激活PPARγ對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

王貴佐,陳芬芬,張葉欽,苗 毅,劉 璐,尚文麗*

(1陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,西安 710068;2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部保健辦公室;*通訊作者,E-mail:zaixuyuan1115@126.com)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性呼吸衰竭。據(jù)統(tǒng)計(jì)美國每年ALI/ARDS的發(fā)病率高達(dá)75/100 000,死亡率接近30%。并且隨著人口的老齡化加重,急性肺損傷的發(fā)病率將會(huì)不斷增加[1]。目前有糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞因子療法等多種治療措施,但療效較差,迫切需要發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)及開發(fā)新的治療藥物。

氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor,PPARγ)是核激素受體家族中的配體激活受體,其配體包括羅格列酮、吡格列酮等,PPAR-γ與配體結(jié)合激活后,與視黃醇類X受體(RXR)形成異二聚體,進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子上游的PPAR反應(yīng)元件結(jié)合,最終調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮抗炎及抗氧化作用[2]。多個(gè)體外研究發(fā)現(xiàn)配體通過激活PPARγ可抑制肺泡上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞分泌和釋放TNF-α等細(xì)胞因子,減輕炎癥因子的趨化作用,并促進(jìn)炎癥細(xì)胞的凋亡,減輕肺正常細(xì)胞損傷,增加表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá),從而從多方面對(duì)急性肺損傷起保護(hù)作用[3-5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)激活PPARγ可抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng),對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用[6,7]。上述研究提示激活PPARγ具有治療急性肺損傷的潛在價(jià)值,然而具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血紅素加氧酶的應(yīng)激誘導(dǎo)型,在保護(hù)肺組織免受炎癥和氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞及組織損傷方面發(fā)揮重要作用。在包括Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,肺泡巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi),血紅素、低氧、高氧、NO、內(nèi)毒素和IL-6、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子均可誘導(dǎo)HO-1表達(dá)[8]。HO-1基因敲除小鼠抗氧化應(yīng)激的能力減弱[9]。而Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)在人肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)HO-1,對(duì)高氧的耐受性增強(qiáng),而應(yīng)用HO-1的抑制劑錫原卟啉(tin protoporphyrin,SnPP),上述保護(hù)作用消失。提示上調(diào)HO-1的表達(dá)可能對(duì)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。研究顯示激活PPARγ在心血管細(xì)胞中可顯著上調(diào)HO-1的表達(dá),發(fā)揮保護(hù)作用[11,12]。然而羅格列酮是否能上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá),在肺部疾病中發(fā)揮保護(hù)作用尚待研究。

本研究應(yīng)用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷動(dòng)物模型,評(píng)估羅格列酮激活PPARγ對(duì)LPS誘發(fā)肺部炎癥的保護(hù)作用,并進(jìn)一步探索HO-1是否介導(dǎo)激活PPARγ對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

6-8周雄性BALB/c小鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量22-25 g,由陜西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證SYXK(陜)2016-006。羅格列酮片(文迪雅,出廠批號(hào)10045192,國藥準(zhǔn)字H20020475)生產(chǎn)公司為葛蘭素史克有限公司。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)來源于大腸桿菌055:B5,購于Sigma-Aldrich。兔抗鼠HO-1一抗購于美國Cell signaling technology;HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗由美國Sigma-Aldrich提供。IL-6檢測(cè)試劑盒為R&D Systems ELISA試劑盒。RIPA裂解液由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2 模型制作和實(shí)驗(yàn)分組

6-8周齡BALB/c雄性小鼠15只隨機(jī)分3組：①對(duì)照組(Con組)，氣管內(nèi)滴注PBS 60 μl，作用24 h；②LPS模型組(LPS組),氣管內(nèi)滴注1 mg/ml LPS 60 μl，作用24 h；③羅格列酮治療組(Rosi+LPS組)，分別于滴注LPS前24 h和0.5 h灌胃給予羅格列酮(20 mg/kg)預(yù)處理，再氣管內(nèi)滴注1 mg/ml LPS 60 μl造模24 h。

1.3 收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)及肺組織樣本

氣道內(nèi)滴注LPS作用24 h后,用10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射處死小鼠,用4 ℃預(yù)冷的無菌PBS 0.6 ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,重復(fù)灌洗3次,BALF的回收率達(dá)80%。BALF離心10 min(4 ℃,1 000g)。分別收集上清和沉淀,上清液在-80 ℃保存?zhèn)溆?。BALF中沉淀用無菌PBS重懸,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取細(xì)胞沉淀涂片,晾干后進(jìn)行瑞氏染色,計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞。支氣管肺泡灌洗后分離右肺組織并在-80 ℃保存。

1.4 肺組織病理學(xué)檢查

取出分離后的左肺組織利用10%中性緩沖甲醛液固定,固定后對(duì)左肺組織進(jìn)行脫水,透明,石蠟包埋后切片(厚度為5 μm),蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.5 支氣管肺泡灌洗液中IL-6濃度檢測(cè)

支氣管肺泡灌洗液上清中IL-6的濃度利用ELISA方法檢測(cè),所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)血紅素加氧酶-1表達(dá)

精密稱取各組小鼠肺組織,根據(jù)RIPA裂解液使用說明書制備肺組織勻漿,肺組織與RIPA裂解液的比例為1 mg ∶7.5 μl,用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨。在冰上裂解1 h,14 000g離心20 min,取上清,利用Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織血紅素加氧酶(heme oxygenase,HO-1)(1 ∶500)表達(dá)的變化,應(yīng)用GAPDH(1 ∶5 000)作為內(nèi)參校正。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 激活PPARγ對(duì)肺組織病理改變的影響

與對(duì)照組相比,氣道內(nèi)滴注LPS的小鼠肺組織病理顯示,肺泡及肺間質(zhì)大量出血,組織水腫,炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn),肺泡間隔增厚,正常的肺組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞。而應(yīng)用羅格列酮預(yù)處理(在LPS給藥前24和0.5 h)小鼠后上述改變被明顯抑制(見圖1)。

A.Con組 B.LPS組 C.Rosi+LPS組圖1 激活PPARγ對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷病理改變的影響 (HE染色,×200)Figure 1 Effect of activation of PPARγ on pathological changes of LPS-induced acute lung injury in mice (HE,×200)

2.2 激活PPARγ對(duì)小鼠肺組織浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)及BALF中IL-6的影響

氣道內(nèi)滴注LPS 24 h后,與對(duì)照組相比,BALF內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、BALF中IL-6的濃度均顯著升高(P<0.01,見圖2)。而應(yīng)用羅格列酮預(yù)處理后,可顯著減輕LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷動(dòng)物模型內(nèi)肺組織浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞數(shù)及BALF中IL-6濃度(P<0.01,見圖2)。提示激活PPARγ可抑制LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷動(dòng)物模型炎癥反應(yīng)。

與對(duì)照組比較,**P<0.01;與LPS模型組比較,##P<0.01圖2 激活PPARγ對(duì)小鼠肺組織浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)及BALF中IL-6的影響 (n=3)Figure 2 Effect of activation of PPARγ on the inflammatory cell numbers and the concentration of IL-6 in BALF of mice (n=3)

2.3 激活PPARγ對(duì)小鼠肺組織血紅素加氧酶-1表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)中,給予羅格列酮灌胃預(yù)處理,再氣管內(nèi)滴注LPS作用24 h。應(yīng)用Western blot法檢測(cè)小鼠肺組織內(nèi)HO-1及GAPDH的表達(dá),應(yīng)用GAPDH內(nèi)參校正后,對(duì)照組小鼠肺組織內(nèi)的HO-1蛋白表達(dá)較弱,LPS模型組小鼠肺組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)較對(duì)照組有所升高,然而應(yīng)用羅格列酮預(yù)處理小鼠肺組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)較LPS模型組小鼠顯著增加(P<0.01,見圖3),提示HO-1為PPARγ的靶基因,羅格列酮通過激活PPARγ可上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)。

3 討論

羅格列酮是一種高選擇性、強(qiáng)效的PPARγ激動(dòng)劑,它激活PPARγ核受體后,可以通過促進(jìn)葡萄糖合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及胰島素增敏的相關(guān)基因發(fā)揮其作用,同時(shí)激活脂肪酸代謝的基因來參與脂肪酸的調(diào)節(jié),以羅格列酮為代表的噻唑烷二酮類藥物具有增加胰島素敏感性的作用,在臨床上被用于2型糖尿病的治療。

已有研究表明,配體激活PPARγ能顯著減輕急性肺損傷動(dòng)物模型肺水腫、抑制TNF-α等炎性細(xì)胞因子表達(dá),這種保護(hù)作用可能與抑制HMGB1/RAGE炎性信號(hào)通路有關(guān)[13]。配體激活PPARγ對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用,這可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[14]。上述研究表明,PPARγ可能是ALI/ARDS治療的潛在作用靶點(diǎn)。本研究同樣提示羅格列酮激活PPARγ對(duì)LPS誘導(dǎo)急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用,同時(shí)對(duì)這種保護(hù)作用的可能機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

與LPS組比較,#P<0.01圖3 激活PPARγ對(duì)HO-1蛋白表達(dá)的影響 (n=3)Figure 3 Effect of activation of PPARγ on the expression of HO-1 in lung tissue (n=3)

對(duì)動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)HO-1的表達(dá)可對(duì)急性肺損傷[15]、肺動(dòng)脈高壓[16]等多種疾病發(fā)揮保護(hù)作用。對(duì)心血管系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)激活PPARγ可上調(diào)HO-1,減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,對(duì)其發(fā)揮保護(hù)作用[11,12]。因此激活PPARγ能否通過上調(diào)HO-1表達(dá)對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用值得進(jìn)一步探討。本研究中,給予羅格列酮灌胃預(yù)處理,與LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型比較,羅格列酮預(yù)處理顯著減少以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)的浸潤(rùn),抑制了IL-6的分泌。同時(shí)Western blot顯示HO-1的表達(dá)明顯增加,這提示羅格列酮激活PPARγ對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用,可能與HO-1上調(diào)有關(guān)。

本研究證明了羅格列酮通過激活PPARγ對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI/ARDS發(fā)揮保護(hù)作用,激活PPARγ對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI/ARDS的保護(hù)作用可能與HO-1的上調(diào)有關(guān)。上述研究結(jié)果提示PPARγ激動(dòng)劑具有治療急性肺損傷的潛在價(jià)值,并為其治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。