水合氯醛和右美托咪定對新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響

王春艷 許學(xué)兵 姜濤 于洋 金丹 童庭輝

水合氯醛(chloral hydrate,CHL)是國內(nèi)小兒手術(shù)室外鎮(zhèn)靜常用藥物,作用類似巴比妥類,作用于神經(jīng)突觸,產(chǎn)生鎮(zhèn)靜催眠抗焦慮作用,但沒有文獻(xiàn)關(guān)注其對神經(jīng)細(xì)胞生長的影響。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是高選擇性α2受體激動劑,也具有鎮(zhèn)靜抗焦慮、抑制交感神經(jīng)活動的效應(yīng),動物實(shí)驗發(fā)現(xiàn)DEX減輕全身麻醉引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[1-2]。筆者觀察兩種藥物對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用,評估水合氯醛和右美托咪定對發(fā)育階段的神經(jīng)細(xì)胞功能的影響,以期為臨床小兒鎮(zhèn)靜藥物合理選擇提供實(shí)驗基礎(chǔ)。

資料與方法

一、材料

Olympus IX70倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。右美托咪定(江蘇恩華制藥),水合氯醛(廣州南方醫(yī)院制),凋亡蛋白包括半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和激活型Caspase-3(cleaved Caspase-3)兔抗鼠單克隆抗體和羊抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司),α-tubulin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

二、方法

(一)培養(yǎng)基加藥

各組藥液(等滲鹽水稀釋)以1:6的體積比例加入神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中,形成含藥培養(yǎng)基2 mL。CHL組:0.4%水合氯醛加入后的終濃度3.5 mmol/L;DEX組:0.0001% 右美托咪定加入后的終濃度0.7 μmol/L;C+D組為水合氯醛和右美托咪定等量混合后加入,培養(yǎng)基中兩藥終濃度同前;NS組:向培養(yǎng)液中加入1份等滲鹽水。

(二)實(shí)驗動物與處理

孕大鼠由廣東省實(shí)驗動物中心提供[使許可證號SYXK(粵)2015-0106],并經(jīng)本單位實(shí)驗倫理委員會批準(zhǔn)。新生SD幼鼠雌雄不拘,斷頭后迅速取腦;腦組織置預(yù)冷Hank's平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)中,在顯微鏡下迅速解剖出海馬,冷HBSS中清洗并盡量去除海馬上的血管膜和其他雜質(zhì);將海馬分成小塊以利消化,轉(zhuǎn)移至盛有胰蛋白酶(Trypsin)的6孔板中,37℃消化30 min;待消化快完成時,在15 mL管中加入3 mL預(yù)熱的Plating Medium,并準(zhǔn)備另一干凈15 mL管;消化到時間后,迅速將6孔板由培養(yǎng)箱拿出,傾斜,用槍頭將組織轉(zhuǎn)移至15 mL管預(yù)熱的Plating Medium中,用1 mL槍頭輕柔吹打3次,再用1 mL槍頭套200 μL槍頭輕柔吹打3次;靜置2 min,然后將上懸液轉(zhuǎn)移至另一干凈50 mL管中;取20 μL細(xì)胞懸液計數(shù)板計數(shù),按7×105/dish,用Plating Medium稀釋至2 mL/dish種于35 mm dish中;2 h后,吸凈Plating Medium,輕柔緩慢加入Culture Medium;2～3 d換1次Culture Medium,每次換半液。

原代培養(yǎng)7 d后,觀察長勢好,吸凈原培養(yǎng)基,緩慢輕柔加入含藥培養(yǎng)基2 mL,再放回恒溫孵育箱進(jìn)行24h 的培養(yǎng),以使Caspase-3充分表達(dá),然后將細(xì)胞吹下收集洗滌,BCA法測蛋白濃度。Western-Blot法檢測Caspase-3和cleaved Caspase-3。實(shí)驗重復(fù)3次。

(三)Western-Blot法檢測Caspase-3和cleaved Caspase-3

取50 μg蛋白在10% SDS-PAGE凝膠上電泳,以5%脫脂奶粉封閉后,加入兔抗鼠Caspase-3和cleaved Caspase-3抗體1:10 000,4 ℃搖床孵育過夜;加入羊抗兔二抗1:10 000(in 5%脫脂奶粉),常溫孵育2 h曝光成像。Caspase-3和cleaved Caspase-3用SuperSignalTMWEST Pico PLUS(Thermo scientific公司)壓片18 min。cleaved Caspase-3吸光度值與內(nèi)參蛋白α-tubulin吸光度值相比,其比值代表激活型Caspase-3蛋白的表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、培養(yǎng)細(xì)胞顯微觀察

顯微鏡下觀察各組海馬神經(jīng)細(xì)胞長勢良好,胞體致密,突觸清晰(圖1a),加藥后20 h,NS組較前繼續(xù)生長(圖1b),DEX組無明顯變化(圖1c),CHL組細(xì)胞胞體松散、空泡透明現(xiàn)象增多,突觸減少(圖1d),C+D組能看到空泡變化,但較CHL組少(圖1e)。

二、Caspase-3和cleaved Caspase3檢測結(jié)果

Caspase-3正常以酶原(32～35 KD)的形式存在于胞漿中,在凋亡的早期階段,它被激活,活化的Caspase-3由兩個大亞基(17 KD)和兩個小亞基(12 KD)組成,裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Western Blot 凝膠電泳,CHL組很穩(wěn)定地檢測到cleaved Caspase3條帶增強(qiáng),NS組和DEX組未檢測到cleaved Caspase3條帶增強(qiáng),C+D組檢測到的cleaved Caspase3較CHL組減輕,提示水合氯醛增加了海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡,而加了DEX后細(xì)胞凋亡現(xiàn)象減輕。Caspase3是細(xì)胞內(nèi)天然成分,各組條帶灰度大致相同。見圖2。

圖1 各組原代細(xì)胞培養(yǎng)及加藥后顯微觀察(100×)

圖2 Western Blot檢測原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞Caspase3/cleaved Caspase3表達(dá)情況

電泳條帶灰度計算,各灰度值由image J軟件分析得到。按灰度值計算(cleaved Caspase-3/α-tubulin)，NS組、DEX組和C+D組分別為0.15±0.12、0.09±0.05、0.33±0.14，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CHL組為1.20±0.00，比對照組顯著增加(P<0.01)，C+D組0.73±0.14較CHL組降低(P<0.01)。

討 論

眾多動物實(shí)驗研究證實(shí),大部分全身麻醉藥和中樞鎮(zhèn)靜藥(如咪達(dá)唑侖)會誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。全身麻醉藥物的神經(jīng)元毒性與大腦的發(fā)育階段、麻醉藥物暴露的劑量、次數(shù)及時間等密切相關(guān)[3]。目前研究表明，大部分全身麻醉藥是作用于N‐甲基天冬氨酸(N-methyl-Daspartate,NMDA)受體和/或興奮γ-氨基丁酸A(γ-aminobutyric acid,GABAA)受體,后者引起氯離子內(nèi)流增多,細(xì)胞膜超極化。離子通道異常開閉,阻斷正常細(xì)胞功能,使細(xì)胞功能信號傳遞異常而產(chǎn)生麻醉效果,但同時也誘發(fā)了細(xì)胞凋亡。

臨床上水合氯醛因?qū)粑h(huán)干擾輕而被認(rèn)為是安全的,是小兒鎮(zhèn)靜術(shù)常用藥物,但水合氯醛是乙醇的異構(gòu)體,有研究表明乙醇興奮神經(jīng)細(xì)胞的NMDA受體后,使鈣離子內(nèi)流增多,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體損傷,產(chǎn)生凋亡蛋白Caspase3活化[4]。水合氯醛的中樞性鎮(zhèn)靜作用被認(rèn)為是由它的代謝產(chǎn)物三氯乙醇所致,其藥理作用同是NMDA受體,誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與乙醇等相同。本研究所用水合氯醛藥液濃度,參考潘慶軍等藥理實(shí)驗研究,模擬體內(nèi)鎮(zhèn)靜試驗劑量,在體外進(jìn)行重現(xiàn),結(jié)果證實(shí)能誘發(fā)發(fā)育中的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡[5-6]。除了藥理作用外,尚不能確定藥物的理化性質(zhì)在細(xì)胞凋亡過程中起了什么作用。文獻(xiàn)報道，10%水合氯醛藥液pH值是4.0～6.0[7]。在活體生物體中,吸收入血的水合氯醛被緩沖,可能對細(xì)胞穩(wěn)定起到保護(hù)作用而不誘發(fā)凋亡。

本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞接觸DEX后沒有發(fā)生凋亡,培養(yǎng)液中混合了DEX的水合氯醛組凋亡現(xiàn)象也明顯減輕,顯示DEX對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用,這一結(jié)果令人興奮,為臨床上幼兒鎮(zhèn)靜藥物選擇提供了實(shí)驗參考。

DEX是α2-腎上腺素能受體激動劑,其神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不清楚,可以肯定的是,高選擇性α2-腎上腺素能受體激動劑抑制藍(lán)斑核團(tuán)產(chǎn)生的鎮(zhèn)靜作用與前述全麻藥和中樞鎮(zhèn)靜藥作用于GABA受體或NMDA受體的機(jī)制途徑不同。有研究發(fā)現(xiàn)右美在發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用的同時,可改善吸入麻醉藥引起的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子減少和酪氨酸激酶B抑制[1]。Li等[8]將出生后7 d的SD大鼠暴露于異氟醚6 h,發(fā)現(xiàn)DEX能夠通過維持PI3K/Akt通路的活性,對異氟醚導(dǎo)致的大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡起到保護(hù)作用。Zhang等[9]檢測體外循環(huán)后老年大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)現(xiàn),右美托咪定能使β淀粉樣蛋白(Aβ),微管相關(guān)蛋白P-Tau蛋白表達(dá)減少、突觸后致密蛋白95(PSD95)蛋白表達(dá)增加,前兩種蛋白被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)功能萎縮、認(rèn)知功能障礙有關(guān),具有神經(jīng)細(xì)胞毒性,后一種蛋白則能穩(wěn)定細(xì)胞膜、促使神經(jīng)遞質(zhì)正?；厥蔗尫?、突觸正常形成和功能傳遞,行為學(xué)研究證實(shí)加用右美的體外循環(huán)組大鼠認(rèn)知功能明顯改善。

總之，本實(shí)驗結(jié)果提示,水合氯醛直接接觸對發(fā)育中的神經(jīng)細(xì)胞具有誘發(fā)凋亡的作用,而DEX則可減輕凋亡現(xiàn)象。其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究,藥物的劑量和接觸時間也應(yīng)深入探索。