接種不同叢枝菌根真菌對黃花苜蓿生長影響

張延旭，畢銀麗，郭 楠，宋子恒，李向磊，苗春光

(1.中國礦業(yè)大學(xué)(北京) 煤炭資源與安全開采國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083; 2.國家能源集團(tuán)煤炭產(chǎn)業(yè)運(yùn)營管理中心 計(jì)劃發(fā)展處,北京 100011)

呼倫貝爾境內(nèi)的煤炭資源豐富，目前已經(jīng)探明煤炭儲量為3.07×104Mt，遠(yuǎn)景儲量約為1.5×105Mt以上，該區(qū)域煤層厚、傾角小、埋藏淺、構(gòu)造簡單、產(chǎn)狀平緩，特別適合露天開采[1]。同時，呼倫貝爾草原面積廣闊，草原總面積約100 000 km2，約占全市土地面積的40%，是我國北方重要的生態(tài)屏障[2]。露天煤礦開采通過直接剝離表土及煤層上覆巖層，造成大面積草原植被的破壞，而地層開挖和排棄改變了原有土壤層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致重構(gòu)土層中微生物群落急劇減少、土壤肥力和酶活性下降，土壤質(zhì)量下降，土地生產(chǎn)力極為低下，嚴(yán)重制約了礦區(qū)地表植被的生長和恢復(fù)[3-4]。同時，呼倫貝爾草原區(qū)處于高寒地區(qū)，自然氣候條件惡劣，易遭受嚴(yán)寒、干旱災(zāi)害，這進(jìn)一步增加了植被恢復(fù)的難度，草原破壞嚴(yán)重威脅了該區(qū)域生態(tài)安全。因此，采取有效途徑在露天礦區(qū)排土場進(jìn)行高效、快速植被恢復(fù)與重建，是露天礦生態(tài)復(fù)墾的緊要任務(wù)[5]。

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)廣泛分布于自然界和草原生態(tài)系統(tǒng)中，能與80%以上高等植物形成叢枝菌根共生體[6]。接種AMF能夠有效促進(jìn)宿主植物生長，改善水分代謝和礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收利用，顯著改善土壤質(zhì)量，同時還能夠增強(qiáng)作物的對干旱寒冷、鹽堿及重金屬等方面抗逆性[7-11]。基于此，利用菌根生物技術(shù)進(jìn)行礦區(qū)復(fù)墾、退化草原修復(fù)，提高宿主在干旱環(huán)境中的成活率、抗逆性和植物生產(chǎn)力具有很大的潛力[12-13]。

黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)為豆科苜蓿屬多年生草本植物，廣泛分布于亞洲和歐洲。其具有較強(qiáng)的耐瘠薄、抗旱、抗寒能力，對礦區(qū)土壤改良具有較好的效果，廣泛應(yīng)用于酷寒、干旱等自然條件惡劣的礦區(qū)受損植被的恢復(fù)[14]，在我國東部草原區(qū)分布較多。近年來，有關(guān)黃花苜蓿的研究主要集中在黃花苜蓿的生理生態(tài)特征、抗逆性、栽培利用、種質(zhì)資源等方面[14-17]，針對菌根對礦區(qū)黃花苜蓿促生作用研究鮮有報(bào)道。筆者以黃花苜蓿為對象，通過接種3種叢枝菌根菌種，比較不同菌根真菌對黃花苜蓿生長的影響，篩選優(yōu)良高效菌種，為菌根真菌資源的利用提供理論依據(jù)，為東部草原礦區(qū)生物聯(lián)合修復(fù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用黃花苜蓿品種為呼倫貝爾黃花苜蓿，種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)徐軍老師提供。所用菌劑為中國礦業(yè)大學(xué)(北京)微生物復(fù)墾實(shí)驗(yàn)室增殖擴(kuò)繁的叢枝菌根菌劑，接種菌劑由菌絲、植物侵染根段、孢子和沙土混合物組成。所選菌種包括摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae，簡稱F.m)，幼套球囊霉(Glomusetunicatum,簡稱G.e)，地表球囊霉(Glomusversiforme，簡稱G.v)，所選菌種均為礦區(qū)當(dāng)?shù)爻Ｒ妰?yōu)勢菌。供試土壤基質(zhì)為寶日希勒礦區(qū)表層土壤，土質(zhì)為砂質(zhì)栗鈣土，土壤中速效鉀含量為145.71 mg/kg，速效P含量13.71 mg/kg，堿解N含量124.37 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量 18.36 g/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)接種菌根(+M)和不接種菌根(CK)處理，接菌處理分別為F.m，G.e，G.v，每個處理重復(fù)3次，共計(jì)12盆。盆栽試驗(yàn)在中國礦業(yè)大學(xué)(北京)玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。栽植塑料盆規(guī)格為:21 cm(高)，23.5 cm(盆口直徑)，15 cm(盆底直徑)，基質(zhì)過2 mm土壤篩，在裝盆前經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌(121 ℃，2 h)，風(fēng)干裝盆，每盆加土量為3.9 kg，接種處理每盆施對應(yīng)菌劑50 g，對照處理加同等質(zhì)量的滅菌菌劑。種植前澆水達(dá)到最大飽和持水量，水分平衡后，播種。將黃花苜蓿種子用10% H2O2溶液浸泡10 min做表面消毒，再用去離子水清洗數(shù)次，每個盆播種200粒種子，待出苗后間苗，每盆保留80株。利用稱重法控制澆水量，每盆土壤含水量維持在最大持水量的75%～80%。

1.3 測定指標(biāo)及方法

光合生理參數(shù)、葉色值(SPAD)、可溶性蛋白測定:收獲前，選擇晴朗、光照充足的天氣(09:00—11:00)，采用Li-6400(COR,USA)光合測定系統(tǒng)測定黃花苜蓿葉片光合參數(shù)。選擇長勢一致、生長健康、葉片位置相同(取植株從上往下數(shù)第2片葉子)的苜蓿葉片進(jìn)行測定，主要測定葉片的凈光合速率(Pn)、植株葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)，每盆隨機(jī)選擇3片葉子。測量結(jié)束后，摘除葉片，用方格紙測定葉面積，對光合參數(shù)計(jì)算，得到真實(shí)葉面積對應(yīng)的凈光合速率(Pn)及各參數(shù)。葉色值(SPAD)采用SPAD-502葉綠素儀(Konica,日本)測定，每盆隨機(jī)測定5片，取平均值。葉片可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法測定[18]。

生物量測定:黃花苜蓿生長120 d后分別收獲其地上和地下部分，用自來水清洗根系附著的泥土，同時將植物地上部分和根系分開，在105 ℃烘箱內(nèi)殺青20 min，然后放到80 ℃烘箱內(nèi)直至烘干。分別稱量每盆植株地上部分和根系的干質(zhì)量。

植物養(yǎng)分測定:樣品烘干后磨碎過孔徑為0.25 mm篩，用凱氏定氮法測定植物地上和地下部分全氮量;植物全P測定采用H2SO4-H2O2消煮，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定葉片全P[19]。

菌根侵染率和菌絲密度的測定:隨機(jī)取少量新鮮細(xì)根樣，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% KOH浸泡24 h，隨后用清水沖洗干凈，再用曲利苯藍(lán)染色，將根系剪成1.0～1.5 cm的根段，隨機(jī)選取15根制片，顯微鏡下觀察侵染根段數(shù)，依據(jù)被侵染根段數(shù)占觀察根段數(shù)比值計(jì)算菌根侵染率[20]。菌絲密度采用真空泵微孔濾膜抽濾-網(wǎng)格交叉法測定[21]。

相關(guān)公式如下:

菌根侵染率=感染根段數(shù)/總根段數(shù)×100%;

菌根依賴性(%)=接種處理干重/不接種處理干重×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013軟件處理數(shù)據(jù)，使用Origin2017進(jìn)行繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SAS 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行方差分析，顯著性水平選擇α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接菌處理對植物生長的影響

接菌顯著增加了黃花苜蓿株高，F(xiàn).m，G.e，G.v較對照分別增加了23.5%，20.9%，9.9%，且差異顯著(P<0.05)(表1)。接種菌根后植株地上生物量均有所增加，與對照相比，F(xiàn).m，G.e，G.v處理地上生物量分別提高51.7%，32.8%，18.2%。F.m，G.e處理地下生物量高于對照，較對照分別提高了23.9%，14.8%?？偢芍乇憩F(xiàn)為F.m>G.e>G.v>CK，接菌處理較對照分別提高34.1%，21.5%，3.5%(表1)。方差分析表明，接菌后F.m，G.e處理地上生物量顯著高于對照處理，F(xiàn).m總干重顯著高于對照處理(P<0.05)。接菌后黃花苜蓿植株的菌根依賴性增強(qiáng)，表明菌根有效促進(jìn)了黃花苜蓿的生長。黃花苜蓿的菌根依賴性表現(xiàn)為F.m>G.e>G.v。不同菌株促生效果存在差異，整體來看，F(xiàn).m對生物量的促進(jìn)作用最為明顯，G.e次之，G.v效果略差。

表1 接種菌根對植株生長的影響
Table 1 Effects of different treatments on plant growth

處理株高/cm地上生物量/g地下生物量/g總干重/g菌根依賴性CK9.13±0.42c1.81±0.15c3.10±0.19ab4.91±0.34b0F.m11.87±0.31a2.75±0.23a3.84±0.37a6.59±0.49a134G.e11.47±0.42a2.40±0.07ab3.56±0.28ab5.96±0.36ab121G.v10.07±0.68b2.14±0.16bc2.94±0.15b5.08±0.28b103

注:數(shù)值為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同列不同小寫字母表示不同處理在0.05水平上有顯著差異，下同。

2.2 不同接菌處理對侵染率和菌絲密度的影響

接菌后菌根侵染率顯著提高，表明3個菌種均可與黃花苜蓿形成良好的共生關(guān)系(圖1)。不同接菌處理侵染率表現(xiàn)不同，可能是由于宿主植物與菌種之間存在相互選擇作用，其中F.m表現(xiàn)為最高，達(dá)到66.7%，所有接菌處理與CK相比均表現(xiàn)為顯著差異(P<0.05)。菌根侵染后，根圍會產(chǎn)生大量的菌絲。與對照相比，F(xiàn).m，G.e，G.v分別達(dá)到6.4，5.8，3.4 m/g。菌絲的增加可以增大根系吸收面積，有效促進(jìn)土壤中水分和養(yǎng)分的吸收，有利于植物的生長[22]。

圖1 不同接菌處理菌根侵染率、菌絲密度Fig.1 Effects of different treatments on infection rate of plant root and soil mycelium density

2.3 接菌對植株葉片可溶性蛋白、葉色值的影響

葉片可溶性蛋白是植株代謝的重要物質(zhì)，可延緩或者減少植株體內(nèi)RNA降解，增強(qiáng)非酶促防御系統(tǒng)能力，提高寄主細(xì)胞的保水能力，對于植物逆境條件下保持較高生理代謝具有重要作用[23]。由圖2可知，接種菌根后葉片可溶性蛋白含量較對照增加，表現(xiàn)為F.m>G.e>G.v，3者分別較對照提高36.8%，14.7%，7.1%，其中F.m，G.e處理顯著高于對照(P<0.05)。葉綠素作為參與植株光合作用的重要物質(zhì)，其濃度提高可以促進(jìn)植株光合效率的提高和光合產(chǎn)物的合成，有利于植株干物質(zhì)的積累。SPAD值能夠反映植株葉片中葉綠素含量，接菌后植株SPAD值顯著提高(P<0.05)，與對照相比，分別提高21.0%，17.6%，20.6%。

2.4 接種菌根對植株光合作用參數(shù)的影響

植株光合作用是通過能量轉(zhuǎn)化，利用光能將無機(jī)物變?yōu)橛袡C(jī)物，為植物自身和自然界其他生物提供有機(jī)物。凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等指標(biāo)可從植物光合生理角度反映植物對叢枝菌根的響應(yīng)[24]。由表2可知，接種菌根后葉片的凈光合速率(Pn)高于未接菌處理，F(xiàn).m，G.e，G.v較對照分別提高19%，7.0%，7.6%。接菌可有效提高葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)，表現(xiàn)為F.m>G.e>G.v>CK，較對照分別提高38.6%，18.5%，4.9%。接菌后植物葉片蒸騰速率(Tr)有所增加，F(xiàn).m，G.e，G.v較對照分別提高22.9%，16.7%，5.3%。方差分析表明，F(xiàn).m處理顯著提高葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率(P<0.05)，促進(jìn)作用明顯，而G.e僅表現(xiàn)為蒸騰速率顯著優(yōu)于對照，其他指標(biāo)雖表現(xiàn)為促進(jìn)，但差異不顯著(P>0.05)。G.v促進(jìn)作用不明顯，與對照相比差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 接種菌根對植株葉片SPAD值和可溶性蛋白的影響Fig.2 Effects of different treatments on SPAD value and soluble protein content 注:圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。不同小寫 字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

表2 接種菌根對黃花苜蓿葉片光合作用參數(shù)的影響
Table 2 Effects of different treatments on photosyntheticparameters

處理凈光合速率氣孔導(dǎo)度蒸騰速CK14.24±0.04b0.11±0b2.81±0.08bF.m16.94±0.78a0.15±0a3.45±0.12aG.e15.24±0.28ab0.13±0.01ab3.28±0.11aG.v15.32±0.78ab0.12±0b2.96±0.03b

注:凈光合速率單位為(μmolCO2·(m2·s)-1));氣孔導(dǎo)度單位為(molH2O·(m2·s)-1);蒸騰速單位為(mmolH2O·(m2·s)-1)。

2.5 接菌對植株養(yǎng)分含量的影響

接種后，F(xiàn).m，G.e，G.v處理的黃花苜蓿地上部分N元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于對照處理，表現(xiàn)為CK>G.e>F.m>G.v(圖3)。地下部N含量表現(xiàn)為G.v>CK>G.e>F.m，但對照與接菌處理間差異均不顯著(P>0.05)。植物地上部分和根系的植物P營養(yǎng)均表現(xiàn)為接菌大于對照處理。其中地上部分P含量表現(xiàn)為G.e>G.v>F.m>CK，較對照分別提高34.1%，7.5%，0.4%，但差異不顯著(P>0.05)。根系P含量表現(xiàn)為G.e>F.m>G.v>CK，接菌處理均顯著高于對照(P<0.05)。接菌后對植物N含量的響應(yīng)不明顯，這可能是由于植物生長的稀釋效應(yīng)。接菌有效促進(jìn)了植物對P的吸收，這可能是由于植物與菌根結(jié)合后促進(jìn)了植物根系對土壤中養(yǎng)分的吸收利用[7]。不同接菌處理對于植物營養(yǎng)元素的吸收表現(xiàn)不同，這可能是由于菌根在根系的侵染位點(diǎn)和作用時間及作用機(jī)制不同。

2.6 菌根侵染與植物生長、光合作用參數(shù)等相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明(表3)，菌根侵染率與生物量、葉片可溶性蛋白、氣孔導(dǎo)度、地上部分N含量呈顯著相關(guān)，與菌絲密度、株高、蒸騰速率、根系P含量呈極顯著相關(guān)，菌絲密度與生物量、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率呈顯著相關(guān)，而與SPAD、可溶性蛋白、株高、凈光合速率、地下P含量呈極顯著相關(guān)。表明菌根侵染后顯著提高了植物株高和生物量，同時促進(jìn)了植物體對土壤養(yǎng)分的吸收，改善了植物光合代謝，菌根對植物的生長起到顯著促進(jìn)作用。

表3 菌根侵染、植物生長、光合作用參數(shù)相關(guān)性分析
Table 3 Correlations between infection rate,external hyphal density,plant growth and photosynthetic parameters

注:**表示在 0.01 水平上相關(guān)性顯著，*表示在 0.05 水平上相關(guān)性顯著。

2.7 接菌促生效應(yīng)主成分分析

通過對菌根侵染及植物生長、生理、營養(yǎng)狀況等指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，選取了2個主成分。其中第1主成分反映信息占總信息量的75.04%，第2主成分占13.33%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到88.37%(表4)。第1主成分主要綜合了菌根侵染、植物生物量、株高、植物根系P含量、光合作用等指標(biāo)的變異信息，第2主成分主要包含了地上N含量的變異信息，可表征為植物生長、營養(yǎng)狀況和菌根作用的量度。由綜合得分及排名分析可知(表5)，3種接菌處理中F.m得分最高，促進(jìn)作用最好，G.e次之，G.v表現(xiàn)較差。F.m的應(yīng)用潛力較大，可優(yōu)先作為后續(xù)微生物菌肥應(yīng)用。

表4 主成分載荷矩陣、特征值與貢獻(xiàn)率
Table 4 Principal component loading matrix,eigenvalueand contribution rate

表5 不同接菌處理植物生長效應(yīng)綜合得分及排名
Table 5 Comprehensive score and ranking of plant growtheffects with different inoculation treatments

處理第1主成分第2主成分綜合得分排名F.m1.071-0.7570.7951G.e0.2980.2980.2982G.v-0.2811.286-0.0453CK-1.250-0.828-1.1864

3 討 論

呼倫貝爾草原地處內(nèi)蒙古高原東部的高寒地區(qū)，該區(qū)域生態(tài)極其脆弱，氣候條件惡劣，無霜期短，易遭受寒災(zāi)、旱災(zāi)，一旦受損退化，極難恢復(fù)。該區(qū)域露天采礦活動造成地表土壤結(jié)構(gòu)破壞，土壤肥力下降，微生物數(shù)量和活性降低，對植物生長非常不利[6]。而菌根修復(fù)技術(shù)在解決礦區(qū)植被和土壤退化、提高植物抗逆性、生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)重建等方面可起到重要作用[7,10]。

N和P是植物進(jìn)行生理代謝必需的大量元素，在光合與呼吸、生物膜的合成與穩(wěn)定、酶的活化與失活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、產(chǎn)量與品質(zhì)形成等過程中發(fā)揮重要作用[25]。研究表明，N，P的缺失會導(dǎo)致光合作用能力的下降，限制植物的生長和正常代謝。研究區(qū)本身土壤瘠薄，由于煤炭開采，造成了土壤養(yǎng)分和水土流失，對植物的生長造成一定的消極影響。而接種菌根后顯著提高了植物體內(nèi)養(yǎng)分含量尤其是P，這可能是由于接菌后根系周圍產(chǎn)生了大量的菌絲，增加了根系的吸收面積。這一研究與陳梅梅等[26]在接種菌根促進(jìn)黑麥草植株體內(nèi)營養(yǎng)濃度的結(jié)論相一致。可溶性蛋白是植物進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，可使植物在逆境條件下保持較高的生理代謝，對植物的抗逆性有重要作用[23]。研究表明，可溶性蛋白含量與植物的抗旱、抗寒性密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，接種菌根顯著提高了黃花苜蓿葉片的可溶性蛋白含量，其對于黃花苜蓿葉片生理代謝進(jìn)行具有重要意義，且可有效提高植物的抗逆性，研究結(jié)果與劉歡等一致[27]。

光合作用是植物同化作用進(jìn)行干物質(zhì)積累的主要方式途徑。影響光合作用的環(huán)境因素較多，如光強(qiáng)度、CO2濃度、溫度、水分、礦質(zhì)營養(yǎng)、葉綠素含量等[28]。呼倫貝爾地區(qū)由于處于中高緯度地區(qū)，生長季短，且容易遭受干旱和低溫嚴(yán)寒脅迫，如何有效提高植物光合作用效率、充分利用光能是提高其土地生產(chǎn)力，促進(jìn)植物恢復(fù)的關(guān)鍵。在外界環(huán)境條件一定的情況下，提高植物葉綠素含量、增強(qiáng)植物體內(nèi)水分和營養(yǎng)狀況是提高植物光合作用效率的有效手段。已有研究表明，接種菌根能夠有效促進(jìn)植物在低溫、干旱等環(huán)境脅迫條件下光合作用效率，促進(jìn)植物干物質(zhì)的積累[29]。本研究中接種菌根顯著提高了植株葉片SPAD值，植株養(yǎng)分含量也得到有效提高，一定程度上對于植物光合作用的提高和干物質(zhì)的積累具有重要作用，實(shí)際測定結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。相關(guān)性分析亦表明，凈光合速率與SPAD、株高均呈顯著正相關(guān)，與菌絲密度、葉片可溶性蛋白呈極顯著正相關(guān)。菌根通過促進(jìn)植物對土壤水分和養(yǎng)分的吸收，提高了植物體內(nèi)的養(yǎng)分濃度，促進(jìn)了葉片的代謝和葉綠素合成，從而有效促進(jìn)植物光合作用和干物質(zhì)的積累。接種菌根后有效促進(jìn)了植物凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率，這對于高寒地區(qū)的植物生長和植被恢復(fù)具有至關(guān)重要的作用，體現(xiàn)出菌根真菌的生態(tài)價(jià)值。研究結(jié)果與ZHANG對AM真菌對黑麥草光合作用影響的研究結(jié)果一致[11]。

本研究通過室內(nèi)盆栽模擬實(shí)驗(yàn)，分析對比了不同菌種的有效性，表明接種菌根能夠有效促進(jìn)黃花苜蓿幼苗的生長，提高植物葉片葉綠素和可溶性蛋白含量，提高植物凈光合速率和對營養(yǎng)的吸收。研究主要在溫室內(nèi)土壤滅菌條件下進(jìn)行，對于在逆境條件下(干旱、嚴(yán)寒等環(huán)境)的作用效果以及礦區(qū)實(shí)際環(huán)境條件與土著微生物的長期互相作用有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

(1)3種接菌處理對黃花苜蓿幼苗生長均有不同程度的促進(jìn)作用，其中以F.m的效果最好，G.e次之，G.v效果最差。綜合各形態(tài)、生理指標(biāo)來看，F(xiàn).m對幼苗生長的促生效果最好，具有菌肥開發(fā)的潛力。

(2)接種菌根能與黃花苜蓿形成良好共生關(guān)系，顯著提高了根際菌絲密度，并能促進(jìn)植物生長，接種菌根處理顯著促進(jìn)了植物株高和生物量的增加。

(3)接種菌根有效提高了葉片和根系P含量，提高了黃花苜蓿凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率，同時提高了葉片SPAD值和可溶性蛋白，對于礦區(qū)逆境的抗性具有潛在作用。