加拿大進(jìn)口大麥中小麥線條花葉病毒檢疫鑒定

柳吉芹 王立杉 吳曦 錢云開 高飛 王海洋

摘要 ：小麥線條花葉病毒（WSMV）是我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物。2018年5月秦皇島海關(guān)利用反轉(zhuǎn)錄PCR（RT?PCR）和雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS?ELISA），從加拿大進(jìn)口的大麥中檢出WSMV。同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （Real time RT?qPCR）和序列比對分析方法進(jìn)行了驗(yàn)證。這是我國首次在進(jìn)境加拿大大麥中截獲WSMV。

關(guān)鍵詞 ：小麥線條花葉病毒;?大麥;?PCR;?ELISA;?序列比對分析

中圖分類號：

S 435.121

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018409

Identification of Wheat streak mottle virus on imported barley from Canada

LIU Jiqin1，?WANG Lishan1，2，?WU Xi1，?QIAN Yunkai1，?GAO Fei1，?WANG Haiyang1

（1. Qinhuangdao Custom， Qinhuangdao?066004， China; 2. Hebei Normal University of

Science and Technology， Qinhuangdao?066004， China）

Abstract

Wheat streak mosaic virus （WSMV） was one of the most important quarantine pests in China， which had caused significant economic losses in USA. WSMV was detected in the samples of imported barley from Canada using reverse transcription PCR （RT?PCR） and double?antibody sandwich enzyme?linked immunosorbent assay （DAS?ELISA） methods by Qinhuangdao custom in May 2018， which was further confirmed by real time RT?qPCR and sequence alignment analysis. This was the first report on interception of WSMV on imported barley from Canada.

Key words

Wheat streak mosaic virus;?barley;?PCR;?ELISA;?sequence alignment analysis

小麥線條花葉病毒W(wǎng)heat streak mosaic virus（WSMV）是馬鈴薯Y病毒科Potyviridae， 小麥花葉病毒屬Tritimovirus成員[1]，是我國進(jìn)境植物檢疫性有害生物。20世紀(jì)20年代，該病毒首次發(fā)生于美國中部平原地區(qū)[2]，后蔓延至澳大利亞、加拿大、烏克蘭等國家或地區(qū)[3]。小麥線條花葉病毒可侵染小麥、燕麥、大麥及部分玉米品種[4]，引起寄主植物嚴(yán)重花葉和矮化，最高可引起減產(chǎn)100%。該病毒容易通過汁液摩擦方式近距離擴(kuò)散，并能通過帶病種子的調(diào)運(yùn)遠(yuǎn)距離傳播，傳毒介體為小麥卷葉螨Aceria tosichella[5]。1982年該病毒曾在我國新疆、甘肅局部地區(qū)發(fā)生過，之后未見報(bào)道[67]。由于該病毒的自然寄主小麥為我國的主要糧食作物，一旦擴(kuò)散，必將會對我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境安全造成巨大威脅，因此需加強(qiáng)該病毒的檢疫。2018年5月，我們通過血清學(xué)、分子生物學(xué)檢測法，從一批加拿大進(jìn)口的大麥中檢出小麥線條花葉病毒。

1?材料與方法

1.1?主要試劑與儀器

小麥線條花葉病毒的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和WSMV的雙抗體夾心酶聯(lián)（DAS?ELISA）檢測試劑盒購自美國Agdia公司。熒光探針與引物、One Step RT?PCR Kit（Perfect Real Time， RR064A）、One Step RT?PCR Kit（RR055A）購自TaKaRa公司。實(shí)時(shí)熒光PCR儀為ABI Steponeplus。普通PCR儀為ABI 9700。PCR產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。病毒RNA提取試劑盒（RN53）購自艾德萊公司。Model 4001P電泳儀購自Life Technologies公司，Nu Genius凝膠成像系統(tǒng)購自Syngene公司。Multiskan Ascent酶標(biāo)儀購自Thermo Scientific公司。

1.2?DAS?ELISA檢測

將大麥種子研磨成粉，取100 mg用于DAS?ELISA檢測，測試方法參照試劑盒說明書。每個(gè)樣品設(shè)兩個(gè)平行。在酶標(biāo)儀上直接讀取OD405，當(dāng)樣品OD405≥ 2×陰性O(shè)D405時(shí)，樣品被判定為陽性，即攜帶有病毒，否則判為陰性。

1.3?病毒RNA提取及RT?PCR檢測

取100 mg磨碎的大麥粉，按照病毒RNA提取試劑盒操作說明書提取病毒RNA。RT?PCR擴(kuò)增體系參照One Step RT?PCR Kit說明書，反應(yīng)體系為：2×One Step Buffer 25 μL;RNase free ddH2O 20 μL;上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL;PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL;最后加入2 μL RNA模板，總體積50 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，并設(shè)置陰性對照與空白對照。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30 min;94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，共36個(gè)循環(huán);72℃ 5 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4?實(shí)時(shí)熒光RT?qPCR檢測

實(shí)時(shí)熒光RT?qPCR擴(kuò)增體系參照One Step RT?PCR Kit （Perfect Real Time）說明書，反應(yīng)體系為：2×One Step RT?PCR BufferⅢ10 μL;RNase free ddH2O 5 μL;上、下游引物（20 μmol/L）各0.6 μL;熒光MGB探針（20 μmol/L） 0.6 μL;ROX reference dye （50×） 0.4 μL;TaKaRa EX TaqTM HS（5U/μL） 0.4 μL;PrimeScriptTM RT Enzyme MixⅡ0.4 μL;最后加入2 μL RNA模板，總體積20 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，并設(shè)置陰性對照與空白對照。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 15 min，95℃ 10 s;然后95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光RT?qPCR利用熒光定量PCR儀自帶的軟件進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)陰性對照結(jié)果設(shè)定閾值線，擴(kuò)增曲線及樣品Ct值由軟件自動(dòng)生成。

1.5?序列分析

利用DNAStar分析軟件對測定的PCR序列進(jìn)行裝配;序列同源性比較分析采用BLAST（Basic Local Alignment Search Tools）工具（http： ∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）;序列多重比對采用Cluster X;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析采用MEGA 5.0軟件，通過鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹作聚類分析，Boot?strap自展檢驗(yàn)重復(fù)1 000次。

1.6?引物與探針序列

引物與探針序列見表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?DAS?ELISA檢測結(jié)果

經(jīng)DAS?ELISA分析發(fā)現(xiàn)，大麥兩個(gè)平行樣品OD405均值為0.393，陽性對照OD405為0.663，陰性對照OD405為0.113，空白對照OD405為0.095（表2）。大麥樣品OD405> 2×陰性對照OD405，因此大麥樣品檢測為陽性，即攜帶小麥線條花葉病毒。

2.2?RT?PCR檢測結(jié)果

大麥3個(gè)平行樣品的總RNA用WSMV?F2/R2引物擴(kuò)增均得到約190 bp的特異性片段，片段大小與陽性對照一致，而陰性對照和空白對照均未出現(xiàn)特異性條帶（圖1）。我們將此毒株命名為 WSMV?Can01。

2.3?實(shí)時(shí)熒光RT?qPCR檢測結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光RT?qPCR分析發(fā)現(xiàn)，大麥3個(gè)平行樣品均有典型的擴(kuò)增曲線，Ct均值為32.41，陽性對照Ct值為28.01，陰性對照和空白對照均無擴(kuò)增（圖2），該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該批大麥樣品含有小麥線條花葉病毒。

2.4?CP基因克隆

利用特異性引物WSMV?CP?F571/WSMV?CP?1267R對CP基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約700 bp的特異性條帶，而陰性對照和空白對照均無擴(kuò)增（圖3）。

2.5?序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化分析

將上述約700 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物測序并進(jìn)行NCBI BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)WSMV?Can01與美國已發(fā)生的小麥線條花葉病毒相似度最高。從數(shù)據(jù)庫中下載與其相似度較高的WSMV序列，以燕麥壞死斑駁病毒Oat necrotic mottle virus（ONMV）作為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 4）。系統(tǒng)發(fā)育圖顯示：本次從加拿大進(jìn)口大麥中檢出的 WSMV?Can01與美國分離株CO87、PV57聚為1支，其相似度達(dá)99%;與美國分離株Sindey 81、加拿大分離株IHC聚為第2支，相似度為98%;與美國分離株MON96、WA99、阿根廷分離株Arg2聚為第3支，相似度為97%;與伊朗分離株Iran聚為第4支，相似度為95%;與捷克分離株Czech、德國分離株Hoym、法國分離株Marmagne聚為第5支，相似度為93%～94%;與墨西哥分離株EI Batan 3親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，后者獨(dú)自聚為一個(gè)分支。此外，ONMV（AY377938）作為外群與WSMV?Can01的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。2002年Stenger等基于WSMV CP全長基因（1 267 bp）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)WSMV可分為A、B、C、D 4個(gè)不同的簇[11]，WSMV?Can01屬于D簇。

3?討論

為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們采用了RT?PCR、實(shí)時(shí)熒光RT?qPCR和DAS?ELISA三種方法進(jìn)行鑒定，并通過對WSMV CP基因片段的測序與比對分析，最終證實(shí)加拿大進(jìn)境的大麥中含有小麥線條花葉病毒。本研究基于CP基因片段構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹與Stenger等基于CP全長基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹基本一致[11]，表明該片段具有足夠的多態(tài)性和進(jìn)化特征。加拿大進(jìn)境的大麥中檢測到的小麥線條花葉病毒與美國分離株相似度最高，而與加拿大分離株相似度略低，這可能與兩個(gè)國家之間的種子調(diào)運(yùn)密切相關(guān)。該批疫麥19 994 t，擬作啤酒原料。目前世界上還沒有有效的化學(xué)藥劑以及種子處理技術(shù)來防治小麥線條花葉病毒和小麥卷葉螨。為防止疫情擴(kuò)散，秦皇島海關(guān)加強(qiáng)監(jiān)管，對該批大麥儲存場所，卸貨、運(yùn)輸過程，加工工藝、下腳料處理等環(huán)節(jié)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估;制定專項(xiàng)監(jiān)管方案，防止接卸、儲存、加工過程中疫情擴(kuò)散;監(jiān)督貨物存放，避免交叉污染;及時(shí)對下腳料、成品及生產(chǎn)用水實(shí)施無害化處理。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）