多抗霉素B在鮮人參中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

張睿泓 侯志廣 李廣領(lǐng) 李迎東 馮達(dá) 李忠華 張?chǎng)斡? 逯忠斌

摘要 ：建立了鮮人參樣品中多抗霉素B的簡(jiǎn)易樣品前處理程序和HPLC?MS/MS檢測(cè)方法，對(duì)0～150 d低溫儲(chǔ)藏的鮮人參添加樣品進(jìn)行了分析，考察了多抗霉素B在鮮人參樣品中的低溫儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。結(jié)果表明，所建立分析方法在0.01～2.0 mg/L范圍內(nèi)線性響應(yīng)良好，0.2～5.0 mg/kg添加水平的平均回收率為78.0%～94.7%，定量檢測(cè)限為0.275 mg/kg;鮮人參樣品在-18℃和-20℃儲(chǔ)藏條件下多抗霉素B的平均降解率均小于30%，說(shuō)明多抗霉素B在鮮人參樣品中至少可以穩(wěn)定儲(chǔ)藏150 d。該結(jié)果為多抗霉素B在人參上的殘留登記試驗(yàn)提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ：多抗霉素B;?人參;?高效液相色譜質(zhì)譜;?儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：

S 451.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018468

Storage stability of polyoxins B in fresh Panax ginseng

ZHANG Ruihong，?HOU Zhiguang，?LI Guangling，?LI Yingdong，

FENG Da，?LI Zhonghua，?ZHANG Xinyu，?LU Zhongbin

（College of Resource and Environment， Jilin Agricultural University， Changchun?130118， China）

Abstract

In order to investigate the low temperature storage stability of polyoxins B in fresh Panax ginseng samples， the spiked fresh P.ginseng which were stored at -18℃ and -20℃ for 0-150 days were analyzed by the established simple pretreatment program and high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry detection method. The results showed that the established method had a good linear response in the range of 0.01-2.0 mg/L， the average recovery of polyoxins B spiked at 0.2-5.0 mg/kg in blank P.ginseng was between 78.0% and 94.7%， and the limit of quantitative detection was 0.275 mg/kg. The average degradation rate of polyoxins B in fresh P.ginseng samples was less than 30% at -18℃ and -20℃， indicating that polyoxins B can be steadily stored for at least 150 days in fresh P.ginseng samples. This result provides a reliable scientific basis for the polyoxins B residue field trials on P.ginseng field.

Key words

polyoxins B;?Panax ginseng;?high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry;?storage stability

在農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)中，農(nóng)藥殘留試驗(yàn)樣品從田間取樣后往往會(huì)因分析儀器、工作安排或人員調(diào)配等原因被儲(chǔ)藏一段時(shí)間后才被檢測(cè)。殘留農(nóng)藥在樣品中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性對(duì)農(nóng)藥殘留分析工作至關(guān)重要，另外它也是農(nóng)藥登記試驗(yàn)數(shù)據(jù)的重要組成部分[1]。

研究表明，農(nóng)藥在樣品中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性主要取決于殘留農(nóng)藥自身的理化性質(zhì)、樣品基質(zhì)特性和儲(chǔ)藏溫度條件三個(gè)方面。Afridi 等[2]在對(duì)小麥籽粒中氯菊酯、甲基毒死蜱和甲基嘧啶磷的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的研究中發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)藏穩(wěn)定性與殘留農(nóng)藥的飽和蒸汽壓和水溶性呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系;Mouvet等[3]比較了水溶性有差異的滅草松、異丙隆、甲草胺和特丁津4種除草劑在水中4℃條件下的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，也發(fā)現(xiàn)這4種除草劑的水溶性與儲(chǔ)藏穩(wěn)定性存在負(fù)相關(guān)關(guān)系;Leahey等[4]發(fā)現(xiàn)稻谷和小麥樣本含水量與其中的甲基立枯磷殘留的常溫儲(chǔ)藏穩(wěn)定性成反比;Kobayashi等[5]對(duì)黃瓜、香梨和馬鈴薯中乙撐硫脲在-20℃下的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)乙撐硫脲在pH低的基質(zhì)里降解速率低于高pH基質(zhì);Athanasopoulos等[6]研究了葡萄中甲胺磷常溫和0℃下的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)0℃下儲(chǔ)藏的半衰期為267 d，比常溫下高出一個(gè)數(shù)量級(jí);魏梅等[7]比較了室溫、4℃和-20℃3個(gè)儲(chǔ)藏溫度下聯(lián)苯菊酯和甲氰菊酯在柑橘勻漿物中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)隨著儲(chǔ)藏溫度降低，兩種菊酯類農(nóng)藥在柑橘中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定期均表現(xiàn)為增長(zhǎng)趨勢(shì);董見(jiàn)南[8]研究了10種有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑和8種殺菌劑殘留在甘藍(lán)、番茄和柑橘等7種代表性基質(zhì)中的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，同樣發(fā)現(xiàn)低溫儲(chǔ)藏不利于儲(chǔ)藏過(guò)程中殘留農(nóng)藥的降解。殘留試驗(yàn)樣品的儲(chǔ)藏，需要綜合考慮待試農(nóng)藥的理化性質(zhì)及樣品基質(zhì)，并合理地確定儲(chǔ)藏條件和儲(chǔ)藏時(shí)間，這樣才能確保儲(chǔ)存期間待測(cè)物的性質(zhì)和含量不發(fā)生變化，從而確保分析結(jié)果的可靠性和科學(xué)性。

多抗霉素B（polyoxins B）為生物源抗生素農(nóng)藥，具有高效、安全、低風(fēng)險(xiǎn)的特點(diǎn)，符合當(dāng)今食品安全、藥品安全和生態(tài)安全的大方向，其在防治由Alternaria panax Whetz導(dǎo)致的人參黑斑病方面應(yīng)用潛力巨大。本研究采用模擬添加法，建立并優(yōu)化鮮人參樣品中多抗霉素B殘留的高效、高靈敏度的HPLC?MS/MS分析方法，研究不同儲(chǔ)存溫度下鮮人參中多抗霉素B殘留的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，為推薦多抗霉素B在人參上登記試驗(yàn)的樣品有效儲(chǔ)藏期提供數(shù)據(jù)支持。

1?材料和方法

1.1?藥品、試劑與供試材料

色譜純甲醇、甲酸、乙腈（購(gòu)自MREDA公司），分析純乙酸銨（購(gòu)自北京鵬彩精細(xì)化工有限公司），多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)品（純度29.0%，購(gòu)于Dr. Ehrenstorfer GmbH）。

鮮人參根采自吉林省撫松縣有機(jī)人參種植基地。

1.2?主要儀器設(shè)備

1260系列HPLC（Agilent Technology Inc.，USA），配置真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二元泵。6470型三重四極桿質(zhì)譜儀、SHZ?88型恒溫水浴振蕩器、IKA T25型高速分散機(jī)、YXJ?A型高速大容量電動(dòng)離心機(jī)、IKA VORTEX 3型渦旋儀等。

1.3?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將采集的有機(jī)鮮人參樣品勻漿液與多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液充分混勻，使多抗霉素B在人參樣品中的最終含量分別為1 mg/kg和2 mg/kg。將每5 g混合樣品分裝于1個(gè)50 mL聚丙烯離心管中，分別置于-18℃和-20℃冷凍條件下儲(chǔ)存，按0、7、14、28、60、90、120和150 d間隔期取樣分析，各次的樣品均設(shè)3次重復(fù)，共計(jì)96個(gè)樣品，另設(shè)空白對(duì)照和1 mg/kg的質(zhì)控樣品。

1.4?樣品前處理

將不同溫度下的冷藏樣品從冰箱中取出，平衡至室溫，加入0.3%甲酸25 mL，渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min，移取1 mL上清液，過(guò)0.22 μm濾膜至HPLC進(jìn)樣小瓶，待HPLC?MS/MS分析。

1.5?色譜和質(zhì)譜條件

Agilent Zorbax C18分離分析柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），以0.5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸的溶液（A）和乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序?yàn)?～1 min內(nèi)，B由5%增至10%;1～2 min內(nèi)，B由10%增至20%;2～3 min內(nèi)，B由20%增至30%;3～4 min內(nèi)，B由30%增至40%;4～5 min內(nèi)，B由40%增至60%;5～7 min內(nèi)，B由60%降至40%;7～9 min內(nèi)，B由40%降至10%;9～10 min內(nèi)，B由10%降至5%;平衡5 min。設(shè)柱流速0.3 mL/min、柱溫恒定30℃、進(jìn)樣5 μL。根據(jù)儀器廠商推薦設(shè)定質(zhì)譜各種氣體參數(shù)、離子源溫度、離子噴射電壓，其他參數(shù)見(jiàn)表1。

1.6?方法性能

分別用10%甲醇將1 000 mg/L質(zhì)量濃度的多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液;參照1.4描述的樣品前處理程序處理空白人參樣品，獲得空白人參樣品提取液，再將不同濃度的多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液溶于相同體積的空白樣品提取液制得0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 mg/L系列濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。在1.5儀器條件下進(jìn)樣分析，分別以進(jìn)樣濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，擬合出線性回歸方程，評(píng)價(jià)線性關(guān)系，并計(jì)算方法的檢出限（LOD）及定量限（LOQ）。用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)（matrix effects， ME），如果ME≤10%，可忽略樣品基質(zhì)的影響，如果ME>10%，需用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量校準(zhǔn)，以減小基質(zhì)的影響。

采用模擬添加法，用有機(jī)鮮人參樣品勻漿液進(jìn)行多抗霉素B的添加回收率試驗(yàn)，添加水平分別為0.2、1.0 mg/kg和5.0 mg/kg，各添加水平分別做5次重復(fù)，分別用計(jì)算得到的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示準(zhǔn)確度和精密度。

2?結(jié)果與分析

2.1?方法的線性、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）

圖1中a為1 mg/L多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)品的定量離子流色譜圖、b為多抗霉素B的兩個(gè)選擇離子的質(zhì)譜圖，c為定性離子色譜圖，圖2為人參空白樣品基質(zhì)的兩個(gè)選擇離子色譜圖（a，c）和質(zhì)譜圖（b）。

由圖1和圖2可以看出，本研究所用人參樣品不含多抗霉素B，且在確定的色譜/質(zhì)譜條件下，多抗霉素B與人參基質(zhì)無(wú)干擾。

多抗霉素B在純?nèi)軇┲泻驮诳瞻兹藚悠坊|(zhì)中的線性回歸方程分別為y=3.8x-17.7（R2=0.999 5）和y=1.7x+22.7（R2=0.997 1），說(shuō)明在確定的儀器條件下，多抗霉素B在0.01～2.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)進(jìn)樣濃度和色譜峰積分面積有良好的線性響應(yīng)。通過(guò)在空白基質(zhì)提取液中添加少量適當(dāng)濃度的多抗霉素B標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，并分別根據(jù)3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）計(jì)算出的多抗霉素B的LOD為0.413 ng，LOQ為0.275 mg/kg。

2.2?基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是基質(zhì)成分復(fù)雜的樣品HPLC?ESI?MS/MS分析中較常見(jiàn)的現(xiàn)象，一般認(rèn)為是由于待測(cè)組分與樣品基質(zhì)在ESI過(guò)程中霧滴表面離子化的競(jìng)爭(zhēng)造成的，該結(jié)果可能會(huì)顯著地抑制或增強(qiáng)目標(biāo)離子的生成效率及離子強(qiáng)度，進(jìn)而影響到檢出限、定量限、線性、準(zhǔn)確度和精密度等方法性能指標(biāo)[9]。文獻(xiàn)報(bào)道的基質(zhì)效應(yīng)補(bǔ)償措施主要有采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法、樣品稀釋法和應(yīng)用分析物保護(hù)劑[10]，其中基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法是最常用、最簡(jiǎn)單，也是有效的方法。根據(jù)文獻(xiàn)介紹方法[11]計(jì)算的多抗霉素B在空白人參樣品基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)值（ME）為56%，說(shuō)明有明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，因此，本研究中采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)人參樣品基質(zhì)中的多抗霉素B進(jìn)行定量校準(zhǔn)。

2.3?方法的準(zhǔn)確度和精密度

鮮人參空白樣品中0.2、1.0 mg/kg和5.0 mg/kg添加水平的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見(jiàn)表2。其中0.2 mg/kg添加水平的平均回收率為94.7%，5次重復(fù)的RSD為4.2%;1.0 mg/kg添加水平的平均回收率為74.7%，5次重復(fù)的RSD為3.2%;5.0 mg/kg添加水平的平均回收率為78.0%，5次重復(fù)的RSD為1.3%。

2.4?儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

按照1.3中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)公式（1）計(jì)算樣品儲(chǔ)藏過(guò)程中多抗霉素B殘留的降解率，當(dāng)人參在冷凍條件下儲(chǔ)存時(shí)，人參中的多抗霉素B殘留能夠保持穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月，可以看出，隨著樣品采集間隔的增長(zhǎng)，在鮮人參基質(zhì)中的殘留雖不同程度的減少，但仍然趨于穩(wěn)定。

D=C0-CtC0×100（1）

式中：D為降解率，單位為百分率（%）;C0為樣品的初始濃度，單位為毫克每千克（mg/kg）;Ct為樣品的檢測(cè)濃度，單位為毫克每千克（mg/kg）。

由表3可以看出，空白鮮人參中1 mg/kg多抗霉素B添加水平分別在-18℃和-20℃下儲(chǔ)藏0、7、14、28、60、90、120和150 d后多抗霉素B降解率最大為13.18%;整個(gè)儲(chǔ)藏過(guò)程中，各時(shí)間點(diǎn)的樣品中多抗霉素B降解率均小于30%，根據(jù)植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留儲(chǔ)藏穩(wěn)定性判斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，空白鮮人參中1 mg/kg多抗霉素B添加水平分別在-18℃和-20℃下150 d儲(chǔ)藏期間內(nèi)穩(wěn)定。

由表4可以看出，空白鮮人參中2 mg/kg多抗霉素添加水平分別在-18℃和-20℃下儲(chǔ)藏0、7、14、28、60、90、120和150 d后多抗霉素B降解率最大為14.86%;-18℃和-20℃下，各時(shí)間點(diǎn)的樣品中多抗霉素降解率均小于30%，根據(jù)植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留儲(chǔ)藏穩(wěn)定性判斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，空白鮮人參中2 mg/kg多抗霉素添加水平分別在-18℃和-20℃下150 d儲(chǔ)藏期間內(nèi)穩(wěn)定。

3?結(jié)論與討論

農(nóng)藥在生物樣品中的低溫儲(chǔ)藏穩(wěn)定性是農(nóng)藥登記殘留試驗(yàn)的基礎(chǔ)資料，而儲(chǔ)藏穩(wěn)定性研究具有周期長(zhǎng)的特點(diǎn)，在較長(zhǎng)的試驗(yàn)周期內(nèi)難以保證各項(xiàng)試驗(yàn)條件的穩(wěn)定性以及每次試驗(yàn)操作的重復(fù)性，為了盡可能減小所獲取數(shù)據(jù)的波動(dòng)，本研究引入質(zhì)控樣品對(duì)每次獲取的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行回收率校準(zhǔn)，保證了數(shù)據(jù)的可用性。本文通過(guò)建立鮮人參樣品中多抗霉素B的簡(jiǎn)易樣品前處理程序和靈敏、可靠的HPLC?MS/MS檢測(cè)方法，對(duì)添加多抗霉素B的鮮人參樣品經(jīng)低溫儲(chǔ)藏，并進(jìn)行了漸進(jìn)性測(cè)定，結(jié)果表明，150 d內(nèi)各次檢測(cè)數(shù)據(jù)均圍繞質(zhì)控上下波動(dòng)，且在-18℃和-20℃儲(chǔ)藏條件下多抗霉素B在鮮人參樣品中的降解率均低于30%，說(shuō)明兩個(gè)儲(chǔ)藏條件下生物農(nóng)藥多抗霉素B在鮮人參樣品中150 d儲(chǔ)藏期內(nèi)穩(wěn)定，該研究為多抗霉素B在人參上的殘留登記試驗(yàn)提供了科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）