一株具有殺蟲活性鏈霉菌的研究

李立梅 左彤彤 鄒建軍 勾天兵 劉慶珍 陳越渠

摘要 ：通過鹵蟲初篩和花布燈蛾幼蟲復(fù)篩，從土壤中獲得1株具有較高殺蟲活性的鏈霉菌，編號為LKY208，為明確該菌株的生防效果及分類地位，采用葉片浸漬法、飼料染毒法、玻片浸漬法及常規(guī)浸蟲法分別測定了其對花布燈蛾、美國白蛾、小菜蛾、菜青蟲、亞洲玉米螟、二斑葉螨、馬鈴薯瓢蟲、桃蚜8種農(nóng)林害蟲的殺蟲活性;并對該菌株發(fā)酵液的穩(wěn)定性進行了初步研究，同時通過形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列分析初步確定了其分類地位。結(jié)果表明：該菌株對8種試蟲均有致死作用，殺蟲譜廣，其中對花布燈蛾的致死作用最強，48 h的校正死亡率達72.1%，菌株發(fā)酵液對溫度耐受性強，在25～50℃殺蟲活性穩(wěn)定;pH 4～7范圍內(nèi)菌株殺蟲活性較好，發(fā)酵液有較好的光穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性和菌株遺傳穩(wěn)定性，具有較好的開發(fā)應(yīng)用價值;經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA序列分析，初步鑒定菌株LKY208為雷格鏈霉菌Streptomyces regensis，此乃國內(nèi)外首次報道將鏈霉菌應(yīng)用于花布燈蛾的防治。

關(guān)鍵詞 ：雷格鏈霉菌;?分類地位;?生防效果;?花布燈蛾

中圖分類號：

S763.306

文獻標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2019127

Study on the insecticidal activity of a Streptomyces strain

LI Limei1，?ZUO Tongtong1，?ZOU Jianjun1，?GOU Tianbing1，?LIU Qingzhen1，?CHEN Yuequ1，2

（1. Jilin Provincial Academy of Forestry Science， Changchun?130033， China; 2. Research Institute of

Forest Ecology Environment and Protection， Chinese Academy of Forestry， Beijing?100091， China）

Abstract

Strain LKY208 with a good insecticidal activity was isolated from soil by using Artemia salina and Camptoloma interiorata. In order to clarify the biocontrol effect and taxonomic status of the strain LKY208， the insecticidal activity of fermented broth of LKY208 against 8 pests was determined by leaf?dipping method， feeding with poison， slide?dip method and conventional dipping method. Meanwhile， the stability of fermentation broth was also studied. The taxonomic identification was carried out by the morphology and 16S rDNA sequence. The strain LKY208 displayed broad?spectrum inhibition activity against all the 8 pests tested， including Camptoloma interiorata， Hyphantria cunea， Plutella xylostella， Ostrinia furnacalis， Pieris rapae， Tetranychus urticae，Henose?pilachna vigintioctomaculata and Myzus persicae. The results showed that the insecticidal effect on C.interiorata was the strongest， with a relative mortality of 72.1% after 48 hours. The fermented broth showed a high resistance to temperature and a highly insecticidal activity was still observed at the temperature of 25-50℃. In the range of pH 4-7， its insecticidal activity was good， with a good photochemical stability， storage tolerance and subculture， and thus it deserved further study. On the basis of morphology and 16S rDNA sequence analysis， it was identified as Streptomyces regensis. This is the first report that Streptomyces regensis was applied for the control of C.interiorata.

Key words

Streptomyces regensis;?classification;?biocontrol effect;?Camptoloma interiorata

蟲害是制約林業(yè)發(fā)展一個重要因素，比如美國白蛾Hyphantria cunea，又稱美國燈蛾、秋幕蛾，屬于世界性檢疫害蟲，原產(chǎn)于北美洲，具有傳播途徑廣、適應(yīng)性強、繁殖量大、多食性等特點[1]，對植物的危害性極強，且一旦侵害植物極易暴發(fā)成災(zāi)，被稱為“無煙的火災(zāi)”[2]。又如花布燈蛾Camptoloma interiorata，國內(nèi)主要分布于東北、華北、華東、華中、華南等地區(qū)[3]。2010年，花布燈蛾在吉林省輝南縣暴發(fā)成災(zāi)，發(fā)生面積3 000 hm2以上[4]。2011年，吉林省花布燈蛾輕度為害林區(qū)近1.70萬hm2，中度為害林區(qū)近1.51萬hm2，而2.32萬hm2重度受害，發(fā)生區(qū)域擴大到吉林市、遼源市、通化地區(qū)的10個縣（市、區(qū)）及紅石林業(yè)局和輝南森經(jīng)局[5]?；ú紵舳暧紫x早春取食樹木的芽苞和葉片，導(dǎo)致樹木不能正常發(fā)芽、抽葉，造成局部枝條干枯、失水，嚴(yán)重影響樹木的生長，如果連年為害，甚至可導(dǎo)致幼樹死亡。

目前生產(chǎn)上對于害蟲的防治仍多采用化學(xué)防治，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥易造成環(huán)境污染和破壞生態(tài)平衡。殺蟲抗生素是一類由微生物產(chǎn)生的具有殺蟲活性的次級代謝產(chǎn)物，具有高效、?；蛯Νh(huán)境安全等特點。因此，利用拮抗微生物防治花布燈蛾，以菌治蟲，最終達到以生物防治為主的綜合防治的目的。

放線菌是最早發(fā)現(xiàn)有生防作用的一類微生物，國內(nèi)外相繼報道放線菌中的多種鏈霉菌能夠產(chǎn)生殺蟲抗生素。阿維菌素是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的殺蟲抗生素。近幾年報道的3 000多種新抗生素中，殺蟲抗生素約占5%，如Takahashi等發(fā)現(xiàn)的由鏈霉菌產(chǎn)生的殺蟲殺螨抗生素altemicidin[6]，我國學(xué)者歐陽諒等發(fā)現(xiàn)的梅嶺霉素（meilingmycin）[7]，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所和日本北里研究所共同開發(fā)的殺蟲抗生素戒臺霉素（jietacin），但迄今未見關(guān)于防治花布燈蛾的抗生素產(chǎn)品的相關(guān)報道。

研制開發(fā)新型殺蟲鏈霉素對林業(yè)可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要，本研究從采自吉林省不同地區(qū)的土壤中分離得到217株放線菌，以鹵蟲Artemia salina初篩和花布燈蛾復(fù)篩進行殺蟲效果測定，最終獲得了1株具有較高殺蟲活性的拮抗鏈霉菌菌株，以期為生物防治提供新的生防因子。

1?材料與方法

1.1?供試材料

1.1.1?供試土壤

2016年6月-8月及2017年6月-7月，在吉林省不同地區(qū)采集土樣30份。詳見表1。

1.1.2?供試菌株

鏈霉菌菌株LKY208，由本實驗室從1.1.1中的土壤樣品中篩選、分離并保存。

1.1.3?供試蟲源

花布燈蛾C.interiorata Walker，鱗翅目燈蛾科，采自大連市金狐山;美國白蛾H.cunea Drury，鱗翅目燈蛾科，采自沈陽蘇家屯;小菜蛾P(guān)lutella xylostella L.，鱗翅目菜蛾科，采自吉林省林科院伊通基地;亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis Guenée，鱗翅目螟蛾科，采自吉林省林科院伊通基地;菜青蟲Pieris rapae L.，鱗翅目粉蝶科;采自吉林省林科院伊通基地;二斑葉螨Tetranychus urticae Koch，蜱螨目葉螨科;采自吉林省林科院伊通基地;馬鈴薯瓢蟲Henosepilachna vigintioctomaculata Motschulsky，鞘翅目瓢甲科;采自吉林省林科院伊通基地;桃蚜Myzus persicae Sulzer，半翅目，蚜科;采自吉林省林科院伊通基地;以上供試蟲源為其各自發(fā)生期采集及養(yǎng)蟲室繼代飼養(yǎng)。

1.1.4?供試鹵蟲

鹵蟲Artemia salina，又稱鹽水豐年蟲，購自山東省濱州港友發(fā)水產(chǎn)有限公司。

1.1.5?供試培養(yǎng)基

高氏一號合成培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，K2HPO4 0.5 g，KNO3 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。高氏一號液體培養(yǎng)基除不含瓊脂外，其他成分同合成培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：花生餅粉2.5%、可溶性淀粉50%、酵母粉0.08%、葡萄糖0.02%、（NH4）2SO40.08%、NaCl 0.2%、CaCO30.32%，pH 7.0～7.2。

人工海水參考熊麗霞[8]配方：NaCl 24.48 g，MgCl2·6H2O 4.98 g，Na2SO4 3.92 g，CaCl2·H2O 2.23 g，NaHCO3 0.19 g，KCl 0.66 g，NaBO3 0.03 g，SrCl20.02 g，NaF 0.01 g，1000 mL。

1.2?試驗方法

1.2.1?土壤樣品采集

選擇好適當(dāng)?shù)攸c后，用小鏟除掉表層土，取5～10 cm深處的土壤約30～50 g，裝入滅菌的紙袋中，編號，并注明采集地點和采集日期等信息，用于鏈霉菌的分離。

1.2.2?鏈霉菌的分離與純化

采用平板稀釋分離法分離和純化鏈霉菌[9]。為減少雜菌、尤其是細菌的污染，先將稱好的10 g土壤120℃烘烤1 h，然后加入100 mL無菌水中，振蕩30 min后，吸取1 mL混懸液，用無菌水梯度稀釋，依次從10-3、10-4和10-5稀釋管內(nèi)分別吸取0.1 mL混懸液滴到高氏一號平板上，均勻涂布，然后將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～10 d，每天觀察并挑選菌落形態(tài)各不相同的菌株及時轉(zhuǎn)接到高氏一號斜面上培養(yǎng)，采用稀釋分離法重新純化3～5次后，編號并保存至4℃冰箱中備用。

1.2.3?搖瓶發(fā)酵初篩殺蟲活性菌株

發(fā)酵液的制備：將1.2.2中分離純化的鏈霉菌轉(zhuǎn)接至高氏一號平板培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)7 d后，使用7 mm打孔器打菌餅接種至裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)（每瓶15個菌餅），28℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)5 d，發(fā)酵液以6 000 r/min，離心20 min，取上清液過細菌濾器去除菌體備用。

殺蟲活性的測定：采用鹵蟲初篩[10]。測定時，將鹵蟲卵置于人工海水中，28℃活化24 h。在96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入0.1 mL鹵蟲液（約20～30頭鹵蟲）和0.1 mL待測菌株的發(fā)酵液，以高氏一號液體培養(yǎng)基為對照，28℃培養(yǎng)24 h后，雙目解剖鏡觀察并統(tǒng)計鹵蟲死亡率和校正死亡率。

死亡率=死亡蟲數(shù)供試蟲數(shù)×100%;

校正死亡率=處理死亡率-對照死亡率1-對照死亡率×100%。

1.2.4?搖瓶發(fā)酵復(fù)篩殺蟲活性菌株

殺蟲活性測定：以花布燈蛾幼蟲為試蟲。采用葉片浸漬法[11]，取新鮮蒙古櫟葉片用菌株發(fā)酵液浸濕，置于滅菌的培養(yǎng)皿中，晾干后接入2～3齡花布燈蛾幼蟲，每皿20頭，3次重復(fù)，另設(shè)浸漬高氏一號液體培養(yǎng)基為空白對照，阿維菌素1 000倍液為陽性對照，分別置于人工氣候培養(yǎng)箱（25℃±1℃，RH70%～80%，光周期L∥D=16 h∥8 h）中飼養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計試蟲生存情況，計算死亡率和校正死亡率。

1.2.5?鏈霉菌LKY208發(fā)酵液殺蟲譜的測定

LKY208為1.2.4小節(jié)篩選獲得的活性最高的菌株?；ú紵舳辍⒚绹锥?、小菜蛾、菜青蟲、桃蚜的殺蟲活性測定采用葉片浸漬法（方法同1.2.4）。

玉米螟的殺蟲活性測定采用飼料染毒法[12]。均勻切取一定大小的飼料（約為幼蟲的一日食量），將菌株發(fā)酵液拌入高壓滅菌后的人工飼料中（100 μL/g），飼喂2齡玉米螟幼蟲。每處理20頭幼蟲，重復(fù)3次。以人工飼料拌高氏一號液體培養(yǎng)基為對照。48 h后在雙目解剖鏡下統(tǒng)計試蟲生存情況，計算死亡率和校正死亡率。

二斑葉螨的殺蟲活性測定采用玻片浸漬法[13]。粘貼時注意不要粘住螨的足和口器，確保其肢體可以活動。每玻片粘25頭，3次重復(fù)。將粘有二斑葉螨的載玻片置于人工氣候培養(yǎng)箱中（條件同上）飼養(yǎng)4 h后，用雙目鏡觀察并剔除死亡或不活潑個體，然后把粘有二斑葉螨的載玻片一端浸入發(fā)酵液中，用濾紙吸干螨體及周圍多余的液體，重新置于人工氣候培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。另以粘螨玻片浸漬高氏一號液體培養(yǎng)基為對照。48 h后，在雙目解剖鏡下統(tǒng)計試蟲生存情況，計算死亡率和校正死亡率。

馬鈴薯瓢蟲的殺蟲活性測定采用常規(guī)浸蟲法[14]。將供試?yán)ハx放入浸蟲器中，于菌株發(fā)酵液中浸30 s，取出后放入養(yǎng)蟲瓶中，培養(yǎng)方法同上。每處理成蟲20頭，重復(fù)3次，以試蟲浸漬高氏一號液體培養(yǎng)基為對照，飼養(yǎng)條件同上。48 h后在雙目解剖鏡下檢查試蟲生存情況，計算死亡率和校正死亡率。

1.2.6?發(fā)酵液熱穩(wěn)定性測定

取等量菌株發(fā)酵液分別于30、40、50、60、70、80、90℃和100℃下處理1 h后取出，自然冷卻后，對2～3齡花布燈蛾幼蟲進行殺蟲活性檢測，以未處理的發(fā)酵液（25℃）為對照。

1.2.7?發(fā)酵液pH穩(wěn)定性測定

取等量菌株發(fā)酵液用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調(diào)整pH為1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13和14，靜置24 h后調(diào)回pH 7，對2～3齡花布燈蛾幼蟲進行殺蟲活性檢測，以未處理的發(fā)酵液為對照。

1.2.8?發(fā)酵液光照穩(wěn)定性測定

取等量菌株發(fā)酵液分別置于日光下照射1、2、3、4、5 h后，對2～3齡花布燈蛾幼蟲進行殺蟲活性檢測，以未處理的發(fā)酵液為對照。

1.2.9?發(fā)酵液耐貯性測定

取等量菌株發(fā)酵液分別在4℃、50℃、-20℃的恒溫條件下貯存15 d后，將發(fā)酵液恢復(fù)至原體積，對2～3齡花布燈蛾幼蟲進行殺蟲活性檢測，以未處理的發(fā)酵液（25℃）為對照。

1.2.10?菌株遺傳穩(wěn)定性測定

將鏈霉菌LKY208轉(zhuǎn)接至高氏一號斜面培養(yǎng)基上，記為F1代，28℃條件下培養(yǎng)5～6 d后，再轉(zhuǎn)接斜面，記為F2代，依次繼代轉(zhuǎn)接直至F6代。取上述分別培養(yǎng)7 d的F1、F2、F3、F4、F5、F6代斜面培養(yǎng)體，按上述的發(fā)酵方法進行發(fā)酵，檢測各代菌株發(fā)酵液對2～3齡花布燈蛾幼蟲的殺蟲活性。

1.2.11?菌株鑒定

將菌種接種至高氏1號瓊脂平板上，將滅菌蓋玻片以45o斜插在培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5～7 d后，取出蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下直接觀察;同時，選擇菌絲生長疏密適中，但氣生菌絲和孢子絲發(fā)育良好的部分，真空噴鍍制片后，用掃描電鏡觀察孢子鏈和孢子形態(tài)及表面結(jié)構(gòu)，處理方法參考楊瑞等[15]的方法。

參照樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，上下游引物（F：5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′/R：5′?GGTTACCTTGTTACGACTT?3′）由寶生物（大連）工程有限公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系：PCR Mixture 25 μL、模板2 μL、上下引物各1 μL、ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃變性5 min;94℃變性1 min，56℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，35次循環(huán);72℃延伸5 min，4℃保存，以無菌水的PCR產(chǎn)物為陰性對照，以已知16S rDNA的菌株P(guān)CR產(chǎn)物為陽性對照。按上樣量2 μL進行2%瓊脂糖凝膠電泳?；厥债a(chǎn)物送至寶生物（大連）工程有限公司進行雙向測序，序列經(jīng)BioEdit 7.0.1等軟件分析和手工校正后，用NCBI的BLAST程序?qū)y出的序列與在GenBank中下載的已知相似模式菌種的序列進行同源性比較分析，并用 MEGA 6.0軟件的鄰接法（neighbor?joining，NJ）進行序列比對并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

1.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用 SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Duncan氏新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2?結(jié)果與分析

2.1?鏈霉菌的分離與純化

從采集的30份土壤樣品中共分離得到217株鏈霉菌菌株，將上述菌株在高氏一號斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4℃保存，作為原始菌株備用。

2.2?搖瓶發(fā)酵初篩結(jié)果

將分離得到的217株鏈霉菌菌株進行搖瓶發(fā)酵。以鹵蟲為靶標(biāo)進行殺蟲活性測定，獲得12株對鹵蟲致死率達50%以上的菌株，其中編號LKY208號菌株效果最好，校正死亡率達94.2%，LKY23殺蟲活性次之，校正死亡率可達90%（表2）。

2.3?搖瓶發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果

將初篩獲得的5株對鹵蟲具有較高活性的鏈霉菌菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，以花布燈蛾幼蟲為靶標(biāo)進行殺蟲活性測定，48 h后觀察統(tǒng)計，結(jié)果見表3。菌株LKY208對花布燈蛾幼蟲的殺蟲活性最高，校正死亡率達73.5%，與其他供試菌株差異顯著，與供試的生物藥劑阿維菌素差異不顯著，菌株LKY23對花布燈蛾幼蟲亦有較好的殺蟲活性，校正死亡率為65.0%，與阿維菌素差異顯著。

1） 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

Data in the table are mean±SD.

1） 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差方法檢驗在P<0.05水平差異顯著。下同。

Data in the table are mean±SD. Lowercase letters in the same column indicate significant difference at P<0.05 by Duncans new multiple range test. The same below.

2.4?鏈霉菌LKY208發(fā)酵液殺蟲活性的測定

分別測定了菌株LKY208發(fā)酵液對8種農(nóng)林害蟲的殺蟲活性，研究結(jié)果表明（表4），菌株LKY208發(fā)酵液對鱗翅目花布燈蛾幼蟲的殺蟲活性最高，48 h的校正死亡率可達72.1%，對鱗翅目小菜蛾幼蟲和美國白蛾幼蟲的殺蟲活性僅次于花布燈蛾幼蟲，校正死亡率分別為69.5%和66.6%，與其他試蟲差異顯著，同時對鱗翅目菜青蟲和玉米螟48 h的校正死亡率分別為36.9%和32.8%;對二斑葉螨亦具有較好的殺蟲活性，48 h的校正死亡率達44.8%;但對半翅目害蟲桃蚜和鞘翅目害蟲馬鈴薯瓢蟲致死作用不明顯。

2.5?鏈霉菌LKY208發(fā)酵液穩(wěn)定性測定

2.5.1?熱穩(wěn)定性測定

經(jīng)不同溫度處理后，菌株LKY208發(fā)酵液的殺蟲活性略有變化。溫度低于50℃時，發(fā)酵液對花布燈蛾幼蟲的殺蟲活性較好，保持了很好的穩(wěn)定性，但當(dāng)溫度高于50℃時，殺蟲效果有所下降（圖1），但即使溫度達到100℃，LKY208發(fā)酵液仍然具有殺蟲活性。

2.5.2?pH穩(wěn)定性測定

分別測定pH 1～14處理后菌株LKY208的發(fā)酵液活性的變化。當(dāng)pH 7時發(fā)酵液的殺蟲活性最高，在pH小于7時，發(fā)酵液殺蟲活性略有降低，但當(dāng)pH超過9時，菌株發(fā)酵液的殺蟲活性明顯降低（圖2），因此菌株發(fā)酵液在偏酸和中性條件下活性穩(wěn)定，且活性明顯高于經(jīng)堿性條件處理的發(fā)酵液。

2.5.3?光照穩(wěn)定性測定

菌株LKY208的發(fā)酵液經(jīng)不同光照時間處理后，其對花布燈蛾的殺蟲活性變化較小（圖3），說明菌株LKY208發(fā)酵液中的殺蟲活性物質(zhì)對光照穩(wěn)定，不易分解。

2.5.4?耐貯性測定

菌株LKY208的發(fā)酵液在50℃、4℃、-20℃保存15 d后，對花布燈蛾的殺蟲活性與對照相比活性變化不大。發(fā)酵液具有可貯藏性，可以長期保存，以4℃低溫貯藏效果最好（圖4）。

2.5.5?遺傳穩(wěn)定性測定

試驗結(jié)果表明（圖5），鏈霉菌LKY208繼代培養(yǎng)后發(fā)酵液對花布燈蛾的殺蟲活性與原始菌株相比，表現(xiàn)了極強的遺傳穩(wěn)定性。

2.6?菌株鑒定

2.6.1?菌株LKY208形態(tài)學(xué)鑒定

菌株LKY208在高氏一號培養(yǎng)基上生長茂盛，氣生菌絲豐茂，28℃培養(yǎng)1～2 d時，菌落光滑、無孢子生成，第3天開始可見氣生菌絲呈黃綠色、淡黃綠色、淡黃色，4 d后基質(zhì)顏色逐漸變?yōu)辄S色，7 d時氣生菌絲逐漸變成褐綠色。在顯微鏡下觀察，基內(nèi)菌絲無橫膜，不斷裂;電鏡觀察結(jié)果表明孢子絲短，偶見短而松散螺旋狀（圖6a），孢子橢圓形、柱形，表面光滑或不規(guī)則褶皺（6b），根據(jù)形態(tài)特征初步分析菌株LKY208為鏈霉菌屬。

2.6.2?菌株LKY208的16S rRNA鑒定

對菌株LKY208的16S rRNA基因序列進行PCR擴增、純化、測序后，測得其序列長度為1 388 bp。與GenBank數(shù)據(jù)庫的16S rDNA序列相比，與雷格鏈霉菌Streptomyces regensis的同源性最高，相似值均在 99% 以上。選擇與菌株LKY208同源性較高的10個菌株，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株LKY208與Streptomyces regensis strain NBRC（GenBank：NR 112402.1）等4個菌株，聚在一個分支，親緣關(guān)系最近，因此初步鑒定菌株LKY208為雷格鏈霉菌（MH 473142）（圖7）。

3?結(jié)論與討論

隨著害蟲生物防治研究的不斷發(fā)展，微生物源農(nóng)藥的研制已成為國內(nèi)外研究的熱點之一。放線菌在自然界中分布廣泛，代謝產(chǎn)物種類豐富，是產(chǎn)生抗生素活性物質(zhì)最多的一類微生物，而鏈霉菌屬又是放線菌中產(chǎn)生抗生素最多的一個屬。因此，從鏈霉菌中篩出的可產(chǎn)生高效殺蟲活性物質(zhì)的菌株具有非常好的開發(fā)應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)殺蟲抗生素的篩選都是以目標(biāo)昆蟲為靶標(biāo)，耗費人力及物力。利用小型活體動物進行早期初篩，繼而用目標(biāo)昆蟲進行復(fù)篩是目前被廣泛認可的篩選策略[16]。因此本研究選定鹵蟲為初篩研究對象，減少前期的工作，節(jié)約了時間和成本。

本試驗利用稀釋分離法從采集到的各類土壤樣品中共分離到217株鏈霉菌，以鹵蟲為初篩指示生物，獲得12株對鹵蟲致死率達50%以上的鏈霉菌菌株，其中LKY208的殺蟲活性，高達94.2%;以花布燈蛾為靶標(biāo)，以初篩較好的5株拮抗菌株為試材進行復(fù)篩，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號為LKY208的菌株對花布燈蛾的殺蟲效果明顯，48 h的校正死亡率可達735%，具有很好的研究和開發(fā)前景。

利用室內(nèi)生物測定方法測定了鏈霉菌LKY208菌株發(fā)酵液對多種昆蟲的殺蟲效果。結(jié)果表明：菌株LKY208發(fā)酵液對花布燈蛾的殺蟲活性最高，48 h的校正死亡率可達72.1%，對鱗翅目小菜蛾幼蟲和美國白蛾幼蟲的殺蟲活性僅次于花布燈蛾幼蟲，校正死亡率分別為69.5%和66.6%，對二斑葉螨也具有較好的殺蟲活性，48 h的校正死亡率達44.8%;但對桃蚜和馬鈴薯瓢蟲的殺蟲作用不明顯，這可能是因為微生物的次生代謝產(chǎn)物對昆蟲的毒殺作用具有較高的選擇性，一般一類次生代謝產(chǎn)物可能僅對某些種類的昆蟲有作用。

對菌株LKY208發(fā)酵液進行的穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明：發(fā)酵液在50℃以下、pH為偏酸性和中性條件下殺蟲活性比較穩(wěn)定;具有良好的光照穩(wěn)定性、耐貯藏性;且菌株遺傳性穩(wěn)定。因此，菌株LKY208具有很好的開發(fā)研究價值及應(yīng)用前景。

利用16S rRNA基因?qū)闘KY208進行了分類鑒定，將菌株LKY208初步定名為鏈霉菌屬雷格鏈霉菌Streptomyces regensis。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）