玉米彎孢葉斑病菌多聚半乳糖醛酸酶Clpg1基因功能驗(yàn)證

崔佳 趙豐舟 劉震 曲建楠 劉銅 左豫虎

摘要 ：為明確玉米彎孢葉斑病菌的多聚半乳糖醛酸酶基因Clpg1在其致病過(guò)程中的作用，采用Double?joint PCR技術(shù)構(gòu)建融合片段，利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得18株抗潮霉素突變體，經(jīng)檢測(cè)得到1株Clpg1基因敲除突變體ΔClpg1。通過(guò)與野生型菌株比較，發(fā)現(xiàn)ΔClpg1產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率下降、多聚半乳糖醛酸酶活性降低，致病力減弱。這些結(jié)果表明Clpg1基因影響多聚半乳糖醛酸酶活性，調(diào)控了玉米彎孢葉斑病菌的致病性。

關(guān)鍵詞 ：玉米彎孢葉斑病菌;?Clpg1;?基因敲除;?生物學(xué)特性;?致病性

中圖分類號(hào)：

S 432.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018485

Functional verification of polygalacturonase Clpg 1 gene in

Curvularia lunata causing maize Curvalaria leaf spot

CUI Jia1，?ZHAO Fengzhou1，?LIU Zhen2，?QU Jiannan1，?LIU Tong2，?ZUO Yuhu1

（1. College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing?163319， China;

2. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou?570228， China）

Abstract

In order to clarify the role of polygalacturonase Clpg1 gene in the pathogenicity of Curvularia lunata， the fusion fragment was constructed using double?joint PCR， and 18 hygromycin?resistant mutants were obtained by using PEG?mediated protoplast transformation technique. A knock?out mutant ΔClpg1 which contained no Clpg1 gene was found. Compared with the wild?type strain， the sporulation yield and germination rate of ΔClpg1 decreased; the polygalacturonase activity was reduced， and the pathogenicity was weakened. These results indicate that the Clpg1 gene affects the polygalacturonase activity and regulates the pathogenicity of Curvularia lunata.

Key words

Curvularia lunata;?Clpg1;?gene knockout;?biological characteristics;?pathogenicity

由新月彎孢Curvularia lunata引起的玉米彎孢葉斑病是一種嚴(yán)重的葉部病害，在我國(guó)普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量，有時(shí)甚至超過(guò)玉米大斑病和黑粉病引起的損失[12]。研究發(fā)現(xiàn)，新月彎孢存在明顯生理分化和致病性變異[34]。多聚半乳糖醛酸酶（PG）是降解植物果膠骨架結(jié)構(gòu)的主要酶之一，是一類重要的果膠酶[58]。果膠酶在植物病原菌侵染寄主的過(guò)程中起重要作用，是病原菌致病因子之一[911]。Jia等通過(guò)對(duì)辣椒疫霉Phytophthora capsici的毒力和酶活性的試驗(yàn)表明，辣椒疫霉中的多聚半乳糖醛酸酶及果膠裂解酶等的酶活性在致病性中起主要作用，隨著發(fā)病程度加重酶活性升高[12]。Shieh等[13]對(duì)黃曲霉Aspergillus flavus產(chǎn)生的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶P2 c進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)P2 c有助于黃曲霉對(duì)棉鈴的侵染和定殖，導(dǎo)致致病性加劇，表明PG參與黃曲霉的致病過(guò)程。Roper等[14]則發(fā)現(xiàn)糖基水解酶基因家族中pglA基因編碼的PG是引起難養(yǎng)木質(zhì)部小菌Xylella fastidiosa侵染葡萄Vitis vinifera必須的關(guān)鍵致病因子，該基因缺失后X.fastidiosa無(wú)法侵染寄主植物。Ten Have等[15]通過(guò)對(duì)灰葡萄孢Botrytis cinerea的內(nèi)切半乳糖醛酸酶Bcpg1基因進(jìn)行基因敲除，發(fā)現(xiàn)Bcpg1基因的缺失導(dǎo)致PG的酶含量降低，其致病力顯著降低。值得注意的是，當(dāng)紫麥角菌Claviceps purpurea的兩個(gè)PG基因Cppg1和Cppg2被敲除后，病菌的致病力幾乎喪失[16]。馮晶等[17]將玉米彎孢葉斑病菌分別接種到玉米抗感兩個(gè)品種上，發(fā)現(xiàn)PG在玉米彎孢葉斑病菌侵染過(guò)程中可能起重要作用。周舒揚(yáng)等[18]對(duì)玉米彎孢葉斑病菌進(jìn)行酶活性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)病原菌可以產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶等，PG分別在第4天和第10天產(chǎn)生一個(gè)峰值，酶活性變化較大，表明PG可能與其致病性相關(guān)。

本研究通過(guò)構(gòu)建玉米彎孢葉斑病菌Clpg1基因敲除突變體，分析其對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)、分生孢子和附著胞的形態(tài)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率、多聚半乳糖醛酸酶活性、致病性的影響，旨在明確Clpg1在病菌致病過(guò)程中的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步解析玉米彎孢葉斑病菌致病分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試菌株與材料

野生型玉米彎孢葉斑病菌DQ?1保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物病理與應(yīng)用微生物研究所。玉米‘黃早四由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)薛春生教授惠贈(zèng)，質(zhì)粒pBHt1由上海交通大學(xué)陳捷教授惠贈(zèng)。大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自天根生化科技有限公司，pMD?19T Vector購(gòu)自TaKaRa公司。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）和熒光定量試劑盒SYBRTM Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）以及Quick Taq酶均購(gòu)于TaKaRa公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（離心柱型）、質(zhì)粒大提試劑盒及全RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit購(gòu)于天根生化科技有限公司，TRIzol試劑購(gòu)于Invitrogen公司，潮霉素B購(gòu)于Roche公司，溶壁酶購(gòu)于廣東微生物所，PEG 4000購(gòu)于MP公司。引物利用軟件Primer 5 進(jìn)行設(shè)計(jì)，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，本研究所用引物見表1。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?果膠誘導(dǎo)下Clpg基因的表達(dá)分析

選取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的野生菌DQ1菌落，沿邊緣打取5塊直徑為5 mm的菌餅，分別轉(zhuǎn)接到含有0.2 g果膠的100 mL PD液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)DQ?1的Clpg基因的表達(dá)，28℃，120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)2、4、6和8 d后，在無(wú)菌環(huán)境下用無(wú)菌水沖洗，收集菌絲，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

總RNA的提取及第一鏈cDNA合成：參照說(shuō)明書采用試劑盒提取總RNA，-80℃保存?zhèn)溆?。選用第一鏈cDNA試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

熒光定量PCR：選用GADPH為內(nèi)參基因，cDNA為模板，引物Clpg1?F/R、Clpg2?F/R、Clpg3?F/R和Clpg4?F/R分別擴(kuò)增Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4基因，qRT?PCR采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa，Japan）試劑盒以及ABI 7500系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)）進(jìn)行。反應(yīng)體系步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt方法計(jì)算，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2?Clpg1基因敲除載體構(gòu)建

利用CTAB法提取野生菌DQ?1基因組，以DNA為模板，引物Clpg11?F/R擴(kuò)增Clpg1基因的上游片段UP，引物Clpg12?F/R擴(kuò)增Clpg1基因的下游片段DOWN，引物HPH?F/R擴(kuò)增hph基因片段，并將條帶切膠回收，連接到pMD19?T simple Vector載體，挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序。使用Double?joint PCR方法構(gòu)建融合片段，方法參照宋娜等[19]略有修改。將上述UP、HPH、DOWN片段為模板，通過(guò)Double?joint PCR法獲得UP?HPH?DOWN重組片段。

Double?joint PCR法分兩步。第一步：將UP、HPH以及DOWN片段混合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 2 min;95℃ 30 s，65℃ 4 min，72℃ 1.5 min，15個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;16℃保存。第二步：將第一步的PCR產(chǎn)物用引物Clpg11?F/Clpg12?R進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 2 min;95℃ 30 s，65℃ 4 min，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;16℃保存。

將所得上述片段切膠回收，連接到pMD19?T simple Vector載體，挑選陽(yáng)性菌落測(cè)序。隨后將融合片段UP?HPH?DOWN用于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體制備與PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法參照劉銅等[20]。將原生質(zhì)體涂布在含有200 μg/mL潮霉素的原生質(zhì)體固體再生培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)7 d，然后將新長(zhǎng)出來(lái)的單個(gè)菌落轉(zhuǎn)移到含潮霉素（200 μg/mL）的PDA平板上進(jìn)行二次篩選，再將正常生長(zhǎng)的菌落轉(zhuǎn)移到PDA平板上，篩選第3次，如此交替到第5代可以正常生長(zhǎng)的玉米彎孢葉斑病菌即為轉(zhuǎn)化子。

1.2.3?Clpg1基因敲除突變體鑒定

在DNA水平上對(duì)突變體進(jìn)行檢測(cè)：以野生菌DQ?1和突變體的DNA為模板，利用引物HPH?F/R和引物Clpg1?F/R分別檢測(cè)野生菌與突變體中的hph基因和Clpg1基因。

在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)突變體進(jìn)行檢測(cè)：通過(guò)RT?PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)。以cDNA為模板，采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物Clpg?F/R擴(kuò)增目的基因，進(jìn)行RT?PCR檢測(cè)。

1.2.4?生物學(xué)特性

菌落和孢子形態(tài)：將野生型DQ?1、敲除突變體ΔClpg1和帶潮霉素基因的抗性轉(zhuǎn)化子DQ?ECT接種在PDA平板中央，28℃黑暗條件培養(yǎng)5 d后對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，拍照記錄，同時(shí)分別制備孢子懸浮液，顯微鏡觀察孢子形態(tài)照相記錄，并對(duì)孢子形態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（每個(gè)重復(fù)統(tǒng)計(jì)500個(gè)孢子）。設(shè)置水平重復(fù)，生物學(xué)重復(fù)各3次。

產(chǎn)孢能力和孢子萌發(fā)率測(cè)定：將DQ?1、DQ?ECT和ΔClpg1菌株，在PDA平板上培養(yǎng)5、7 d后，選取6個(gè)直徑為6 mm的菌餅放到10 mL離心管中，用ddH2O洗下孢子，對(duì)過(guò)濾得到的孢子懸浮液進(jìn)行孢子產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)。將培養(yǎng)7 d的菌株，制備濃度為106cfu/mL的孢子懸浮液，采用懸滴法進(jìn)行孢子萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì)，28℃倒置培養(yǎng)3、6、9 h，觀察并記錄結(jié)果。每個(gè)菌株至少觀察3皿，試驗(yàn)重復(fù)3次[21]。

附著胞形態(tài)觀察：將培養(yǎng)7 d的DQ?1、DQ?ECT和ΔClpg1，分別制備成孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度到一個(gè)視野中有1～2個(gè)孢子為宜。取洋蔥內(nèi)表皮（約1 cm×1 cm）置于載玻片上，在其表皮上滴加20 μL孢子懸浮液，28℃保濕培養(yǎng)7.5 h，顯微鏡下觀察附著胞的形態(tài)并拍照。設(shè)置3次水平重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)[21]。

1.2.5?ΔClpg1敲除突變體PG酶活測(cè)定

將菌株DQ?1、DQ?ECT和ΔClpg1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，分別向每100 mL培養(yǎng)液中加入5塊直徑為6 mm菌餅，28℃振蕩培養(yǎng)3 d。收集濾液，10 000 r/min冷凍離心30 min，得到的上清液即為待測(cè)酶液[22]。通過(guò)DNS法在分光光度計(jì)540 nm處測(cè)定待測(cè)液的吸光值，根據(jù)酶反應(yīng)釋放的還原糖計(jì)算多聚半乳糖醛酸酶活性。

測(cè)定方法：取底物0.5 mL加1 mL 0.05 mol/L pH=5.0醋酸?醋酸鈉緩沖液和1%多聚半乳糖醛酸溶液。50℃水浴鍋中酶解60 min后，加3 mL DNS終止反應(yīng)，振蕩混勻，在540 nm處測(cè)定其酶活。對(duì)照在終止反應(yīng)加入底物，操作同上，結(jié)果用U/mL表示。

1.2.6?致病性檢測(cè)

取相同葉齡玉米葉片的相同部位，葉片兩端用浸濕6?BA溶液（10 mol/L）的棉花包裹。致病性檢測(cè)包括離體葉片的傷口處理及無(wú)傷口處理。檢測(cè)方法參照馬炳辰[21]，將培養(yǎng)7 d的DQ?1、DQ?ECT和ΔClpg1菌株的PDA菌餅（直徑為6 mm）或滴加10 μL濃度為107cfu/mL孢子懸浮液（孢子懸浮液中加入0.02% Tween 20和2%的蔗糖）分別接種在玉米葉片正面，28℃晝夜交替光照保濕培養(yǎng)。每天觀察記錄發(fā)病情況，設(shè)3次水平重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)[21]。

1.3?數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P=0.05），結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2?結(jié)果與分析

2.1?果膠誘導(dǎo)下PG基因家族表達(dá)分析

玉米彎孢葉斑病菌Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4基因在果膠誘導(dǎo)的不同培養(yǎng)時(shí)間均有表達(dá)。Clpg1和Clpg2在果膠誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d時(shí)表達(dá)量最高，Clpg3和Clpg4在4 d時(shí)表達(dá)量最高，其中Clpg1基因表達(dá)量最高（圖1）。前期研究也表明Clpg1基因在病菌與寄主互作3 h后表達(dá)量最高[23]。這些結(jié)果表明Clpg1基因在病菌侵染早期可能起重要作用。

2.2?Clpg1基因敲除

以野生型 DQ?1的DNA擴(kuò)增Clpg1基因的上下游片段，分別得到853 bp UP片段、634 bp DOWN片段，經(jīng)測(cè)序片段與目的序列一致（圖2a）。以pBHt1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增潮霉素片段，得到1 343 bp的HPH片段，經(jīng)測(cè)序片段與目的序列一致（圖2b）?；厥债a(chǎn)物通過(guò)Double?joint PCR法，構(gòu)建出一條片段長(zhǎng)為2 830 bp的融合片段UP?HPH?DOWN（圖2c）。

經(jīng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和再生培養(yǎng)基篩選，共獲得19株潮霉素抗性菌株;將這19株菌株放在含有潮霉素B和不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)5代后，最終獲得18株抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子（圖3）。

經(jīng)檢測(cè)，18株抗潮霉素的轉(zhuǎn)化子中鑒定出1株不含Clpg1基因的轉(zhuǎn)化子（圖4a和圖4b）。通過(guò)RT?PCR對(duì)Clpg1基因表達(dá)量的分析，發(fā)現(xiàn)該突變體中Clpg1基因不表達(dá)，表明該轉(zhuǎn)化子為Clpg1敲除突變體，命名為ΔClpg1（圖4c）。

2.3?生物學(xué)特性觀察

對(duì)野生型菌株DQ?1、帶潮霉素的抗性轉(zhuǎn)化子DQ?ECT和敲除突變體ΔClpg1的生物學(xué)特性進(jìn)行觀察。ΔClpg1敲除突變菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與DQ?1存在較小差異。所有菌株菌落均為墨綠色，但ΔClpg1沒(méi)有同心圓環(huán)，菌絲較野生型菌株DQ?1更致密且平滑，分生孢子形態(tài)無(wú)差異，附著孢的形成正常（圖5）。通過(guò)對(duì)產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ΔClpg1比野生型DQ?1的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均顯著降低（P<0.05）（圖6）。

2.4?ΔClpg1多聚半乳糖醛酸酶活性

通過(guò)多聚半乳糖醛酸酶活性測(cè)定，結(jié)果表明DQ?1、DQ?ECT和ΔClpg1的PG酶活性分別為（780±0.11）U/mL，（8.02±0.03）U/mL和（6.49±0.21）U/mL。其中ΔClpg1多聚半乳糖醛酸酶的酶活性比野生型菌株DQ?1下調(diào)了16%，顯示ΔClpg1敲除突變體的PG酶活性下降，Clpg1基因的缺失影響了多聚半乳糖醛酸酶的活性。

2.5?致病性檢測(cè)

通過(guò)對(duì)DQ?1、DQ?ECT和ΔClpg1離體葉片有傷口和無(wú)傷口接種處理，發(fā)現(xiàn)孢子懸浮液和菌餅接種后ΔClpg1的病斑面積都明顯小于DQ?1的病斑面積（圖7），ΔClpg1敲除突變體對(duì)寄主植物的致病性減弱，表明基因Clpg1可能參與了病菌致病性調(diào)控。

3?討論

目前，病原菌的細(xì)胞壁水解酶參與致病已有許多報(bào)道。病原菌產(chǎn)生一系列細(xì)胞壁水解酶降解植物細(xì)胞壁，破壞寄主組織細(xì)胞，釋放營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)病原菌繁殖，有利于病害的發(fā)生。細(xì)胞壁水解酶主要包括果膠酶、角質(zhì)酶和纖維素酶等，根據(jù)作用底物的不同，果膠酶又分為多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲酯水解酶和果膠裂解酶等[24]。多聚半乳糖醛酸酶是一種細(xì)胞壁水解酶，在細(xì)菌、真菌和植物中普遍存在，是細(xì)菌和真菌降解寄主植物細(xì)胞壁的主要酶之一[2526]。Williamson等[27]首次通過(guò)分離純化樹莓果實(shí)獲得了PGIP蛋白，并且發(fā)現(xiàn)可以對(duì)灰霉菌的PG酶活性產(chǎn)生抑制作用。2005年鞏振輝等[28]克隆了樟疫霉菌Phytophthora cinnamomi多聚半乳糖醛酸酶Pcpg16和Pcpg17基因。本研究通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)玉米彎孢葉斑病菌Clpg基因家族成員在果膠誘導(dǎo)下的不同時(shí)期基因均有表達(dá)，且Clpg1基因表達(dá)量最高，推測(cè)Clpg1在誘發(fā)玉米彎孢葉斑病中起重要作用。2009年Sun等[29]克隆了辣椒疫霉的7個(gè)PG基因，采用熒光定量PCR對(duì)葉片內(nèi)Pcipg2基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在接種后的第7天 Pcipg2表達(dá)量最高，并對(duì)Pcipg2基因進(jìn)行原核表達(dá)后接種辣椒健康植株葉片出現(xiàn)病斑，表明其參與了病原菌的致病過(guò)程。本研究利用Double?joint PCR法構(gòu)建了Clpg1基因的敲除突變體，通過(guò)對(duì)表型、DNA水平以及轉(zhuǎn)錄水平分析，獲得了一個(gè)Clpg1基因敲除突變體，通過(guò)對(duì)突變體的致病力分析，結(jié)果表明ΔClpg1突變體對(duì)玉米的致病性有所減弱，暗示Clpg1基因可能參與了病菌的致病過(guò)程。Valette?Collet等[30]研究表明灰葡萄孢的其中一個(gè)多聚半乳糖醛酸酶基因的缺失，導(dǎo)致發(fā)病延遲且致病性降低50%～85%。這與本論文Clpg1基因敲除后致病力減弱的研究結(jié)果一致，表明Clpg1基因參與玉米彎孢葉斑病菌的致病性。然而病原菌在侵染過(guò)程中可以產(chǎn)生不同PG酶，并且不同的PG同工酶在致病性中作用存在差異。本研究鑒定的4個(gè)基因中，目前只對(duì)Clpg1基因進(jìn)行敲除并且對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證，但是其他3種同工酶是否參與功能調(diào)控以及致病性，還有待進(jìn)一步的研究，該研究結(jié)果也為后期的試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

4?結(jié)論

玉米彎孢葉斑病菌PG基因家族成員Clpg1基因在果膠酶誘導(dǎo)下，6 d時(shí)表達(dá)量最高，敲除突變體ΔClpg1在菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率等特性上均與野生型DQ?1存在差異。與野生型菌株比較，多聚半乳糖醛酸酶活性降低，ΔClpg1致病性減弱，因此推測(cè)該基因參與了病原菌的致病性調(diào)控。

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（責(zé)任編輯：田?喆）