七星瓢蟲保幼激素環(huán)氧水解酶基因克隆及表達分析

劉夢姚 王娟 王曼姿 高飛 張洪志 李玉艷 臧連生 張禮生

摘要 ：保幼激素（juvenile hormone， JH）可以調控昆蟲滯育，保幼激素環(huán)氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase， JHEH）是調節(jié)保幼激素代謝的關鍵酶之一。為探索JHEH在七星瓢蟲Coccinella septempunctata L.滯育中的調控作用，利用RT?PCR和RACE技術克隆獲得七星瓢蟲JHEH全長基因，命名為Csjheh （GenBank登錄號：MH932586）， 該基因cDNA全長2 077 bp，開放閱讀框（ORF）1 380 bp，編碼459個氨基酸，預測蛋白質分子量為51.39 kD，理論等電點（pI）為8.79。疏水性分析結果顯示該基因具有典型環(huán)氧水解酶的N末端疏水結構。氨基酸序列比對結果表明，Csjheh與中歐山松大小蠹、赤擬谷盜、麗蠅蛹集金小蜂、內華達古白蟻保幼激素環(huán)氧水解酶同源性達到64.24%。利用實時熒光定量 PCR 技術研究其時空表達模式，結果表明Csjheh基因在七星瓢蟲成蟲初羽化階段表達量較高，滯育誘導條件下表達量呈先下降后上升的趨勢，滯育60 d時與初羽化階段接近。本研究結果對揭示JHEH參與JH的調控作用，進而調控昆蟲滯育提供了理論參考。

關鍵詞 ：七星瓢蟲;?保幼激素環(huán)氧水解酶;?基因克隆;?時空表達

中圖分類號：

S 476.2

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018496

Cloning and expression analysis of juvenile hormone epoxide hydrolase

in Coccinella septempunctata

LIU Mengyao1，2，?WANG Juan2，?WANG Manzi1，2，?GAO Fei2，?ZHANG Hongzhi2，

LI Yuyan2，?ZANG Liansheng1，?ZHANG Lisheng2

（1. Jilin Agricultural University， Changchun?130118， China; 2. Key Laboratory of Integrated Pest

Management in Crops， Ministry of Agriculture and Rural Areas， Sino?American Biological Control Laboratory，

Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing?100193， China）

Abstract

Juvenile hormone epoxide hydrolase （JHEH） is one of the most important enzymes in regulating juvenile hormone （JH） metabolism， which is of great significance in insect diapause regulation. In order to explore the regulation of JHEH in diapause of Coccinella septempunctata L.， the full?length cDNA of the gene encoding JHEH in C.septempunctata （Csjheh） was cloned by using RT?PCR and RACE. The full?length sequence was 2 077 bp， which consisted of a 1 380 bp open reading frame （ORF） encoding 459 amino acid residues with a molecular mass of 51.39 kD and a theoretical isoelectric point of 8.79. The results of amino acid sequence alignment showed that Csjheh was homologous to those of Dendroctonus ponderosae， Tribolium castaneum， Nasonia vitripennis and Zootermopsis nevadensis， with an amino acid identity of 64.24%. The expression profile of Csjheh was detected by using real?time fluorescent quantitative PCR at different stages of diapause. The results showed that the expression level of Csjheh gene was the highest in the initial emergence stage of the adult ladybug， and then it decreased firstly but increased in the later time of diapause， at which stage the expression level was close to that at the initial emergence stage. The results of this study have important implications for revealing the role of JHEH in the regulation of JH， which plays an important role in the regulation of diapause.

Key words

Coccinella septempunctata;?juvenile hormone epoxide hydrolase;?gene cloning;?expression

七星瓢蟲Coccinella septempunctata L.是一種優(yōu)良的捕食性天敵昆蟲，產卵量大，定殖性強，存活時間長，寄主范圍廣，成蟲和幼蟲均能持續(xù)控制蔬菜、果樹、作物上的蚜蟲、粉虱、薊馬、介殼蟲等害蟲為害[12]，在國內外已被廣泛應用，并實現(xiàn)其大規(guī)模商品化擴繁[3]。該蟲屬于完全變態(tài)昆蟲，經過卵、幼蟲、蛹、成蟲4個階段，以成蟲進行滯育越冬或越夏[46]。掌握其滯育調控技術，可以延長其產品貨架期，促進天敵昆蟲產業(yè)發(fā)展，具有重要的生產實踐意義。

保幼激素（juvenile hormone， JH）是一種倍半萜烯類親脂性激素，參與昆蟲的滯育調控[7]。該激素由咽側體合成并釋放到血淋巴，通過保幼激素的合成和降解代謝共同維持其滴度平衡[89]。大量研究證明昆蟲滯育期間保幼激素滴度維持在很低的水平，解除滯育后又恢復正常水平。在滯育誘導期滴加外源保幼激素會延緩昆蟲進入滯育的時間，已經進入滯育的昆蟲滴加外源保幼激素會暫時解除滯育[1012]。滯育的蓼藍齒脛葉甲Gastrophysa atrocyanea雄蟲被點滴保幼激素后，

滯育解除，性腺發(fā)育和交配行為恢復[13];給處于滯育的黃鉤蛺蝶Polygonia c?aureum滴加外源保幼激素類似物甲氧普林可打破滯育[14]。保幼激素的代謝由保幼激素環(huán)氧水解酶（juvenile hormone epoxide hydrolase， JHEH）、保幼激素酯酶（juvenile hormone esterase，JHE）和保幼激素二醇激酶（juvenile hormone diol kinase， JHDK）等共同催化完成，其中JHEH降解JH和保幼激素酸（juvenile hormone acid，JHa），降解產物分別為保幼激素二醇（juvenile hormone diol， JHD）和保幼激素酸二醇（juvenile hormone acid diol， JHAD）[15]。截至目前，針對保幼激素降解代謝的研究主要集中于保幼激素酯酶的作用機制[16]，研究顯示JHEH對保幼激素參與的代謝調控通路也起到重要作用[17]。本研究以七星瓢蟲為研究對象，利用RACE技術對保幼激素環(huán)氧水解酶JHEH進行全長基因克隆，對該基因序列進行生物信息學分析，運用實時熒光定量PCR技術研究了該基因在七星瓢蟲滯育各階段的轉錄水平，為進一步探究JHEH調控JH的作用機制進而調控滯育提供理論參考。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源

供試七星瓢蟲為中國農業(yè)科學院植物保護研究所天敵昆蟲組飼養(yǎng)種群，飼養(yǎng)方法參見王偉等[6]。飼養(yǎng)條件為：溫度（24±1）℃、相對濕度70%±10%、光周期L∥D=16 h∥8 h，飼養(yǎng)至產卵，為正常發(fā)育組。將正常發(fā)育下初羽化的成蟲雌、雄配對，轉移至滯育誘導條件下飼養(yǎng)，誘導條件為溫度（18±1）℃、光周期L∥D=10 h∥14 h，相對濕度70%±10%，飼養(yǎng)40 d未產卵為滯育組，判斷方法參考王偉等[6， 18]。將滯育組轉移至正常條件飼養(yǎng)，第一次產卵后為滯育解除組。

1.2?主要試劑

RNA提取試劑RNAiso Plus、RACE試劑盒SMARTerRACE 5′/3′Kit Clontech、反轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司。cDNA第一鏈合成、PCR擴增試劑盒購于北京擎科新業(yè)生物技術有限公司。其余試劑均為國產分析純。

1.3?RNA提取與cDNA第一鏈合成

取滯育雌蟲于液氮預冷的研缽中，加入液氮研磨成粉末，轉入1.5 mL RNase?free離心管中，根據(jù)RNAiso Plus試劑盒說明書提取總RNA。在微量分光光度計（NanoPhotometer P?class， Implen）上檢測RNA濃度和純度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。按照反轉錄試劑盒操作說明合成cDNA模板，3′和5′第一鏈cDNA按照RACE試劑盒說明書合成，置于-80℃冰箱保存。

1.4?jheh 基因克隆及序列分析

1.4.1?引物設計與合成

基于本實驗室前期測得轉錄組數(shù)據(jù)，鑒定得到jheh基因序列，利用Primer Primer 5.0軟件設計一對RACE特異性引物及熒光定量引物（表1）。所有引物均由北京擎科新業(yè)生物技術公司合成。

1.4.2?中間片段擴增

以滯育七星瓢蟲cDNA為模板，利用jheh?f1、jheh?r1，jheh?f2、jheh?r2兩對引物進行PCR中間序列擴增。反應體系（50 μL）： PCR Mix 45 μL，引物各2 μL，cDNA 1 μL，輕微振蕩混勻，瞬時離心，進行PCR反應。反應程序：98℃變性2 min;98℃ 10 s， 56℃ 10 s， 72℃ 15 s，30個循環(huán);72℃，5 min;產物置于4℃保存。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目的條帶進行回收純化。將回收產物與克隆載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素篩選后挑選陽性克隆子進行擴大培養(yǎng)送至北京擎科生物公司測序。

1.4.3?3′和5′RACE PCR

以3′和5′第一鏈cDNA為模板，按照SMARTerRACE 5′/3′Kit Clontech試劑盒說明書進行RACE全長擴增。反應體系（50 μL）：15.5 μL PCR?Grade H2O， 25.0 μL 2×SeqAmp Buffer，1.0 μL SeqAmp DNA Polymerase，混勻后加入2.5 μL模板，5.0 μL 10×UPM，1.0 μL jheh?5′/jheh?3′。反應程序：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán);94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5個循環(huán);94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25個循環(huán)。將3′/5′RACE PCR產物回收，連接，轉化，測序。

1.4.4?序列拼接與信息分析

將所得序列利用DNAMAN和EditSeq進行DNA序列分析并拼接獲得七星瓢蟲jheh基因cDNA全長序列。利用ORF Finder （https：∥www.ncbi.nlm.gov/orffinder/）查找完整的開放閱讀框并預測氨基酸序列。利用NCBI BLAST軟件進行序列比對以及同源序列搜索，MEGA 6.0進行系統(tǒng)進化樹構建。利用PredictProtein （https：∥www.predictprotein.org/）在線分析和ExPASy Proteomics Server在線軟件ProtParam tool（http：∥www.expasy.ch/tools/protparam.html）、Prot Scale在線軟件（http：∥expasy.org/tools/protscale.html）、SignalP 4.0 Server在線分析（http：∥www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）、TMHMM Server v.2.0（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜結構的預測等預測蛋白的二級和三級結構、保守結構域、親疏水區(qū)等。

1.5?jheh基因時間表達分析

應用染料法在ABI 7500實時熒光定量儀上測定Csjheh基因表達量。收集不同發(fā)育時期（初羽化、滯育10 d、滯育20 d、滯育30 d、滯育60 d、正常發(fā)育組、滯育解除組）的七星瓢蟲雌蟲，取樣，提取總RNA。根據(jù)PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板進行jheh基因時間表達分析。反應體系 （20 μL）：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ （Tli RNaseH Plus） （2×）10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ （50×） 0.4 μL，cDNA 2 μL，超純水6 μL。振蕩混勻，離心，進行RT?qPCR反應。反應條件：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán);熔解曲線條件：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。試驗采用3個生物學重復，4個技術重復?；虻南鄬Ρ磉_量計算采用2-△△Ct法。

2?結果與分析

2.1?七星瓢蟲保幼激素環(huán)氧水解酶基因克隆與序列分析

基于七星瓢蟲轉錄組數(shù)據(jù)，以滯育七星瓢蟲cDNA作為模板，克隆得到七星瓢蟲jheh基因，命名為Csjheh （GenBank登錄號： MH932586）。序列分析表明，Csjheh基因cDNA全長2 077 bp，開放閱讀框（ORF）1 380 bp，編碼459個氨基酸，5′非編碼區(qū)105 bp，3′非編碼區(qū)592 bp（圖1）。預測蛋白的分子量為51.39 kD， 理論等電點為8.79，存在一個跨膜結構，位于第7-29個氨基酸之間（圖2），屬于跨膜蛋白。在該蛋白的第53-163個氨基酸之間存在EHN環(huán)氧水解酶超家族結構域，具備環(huán)氧水解酶的典型結構特征。以保幼激素環(huán)氧水解酶（SMTL ID： 4qla.1.A）為模型預測Csjheh的3D結構為同源JHEH序列，序列相似度約為49.65%（圖3）。

2.2?Csjheh基因的同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構建

將Csjheh基因的氨基酸序列在NCBI中BLAST搜索比對發(fā)現(xiàn)，Csjheh基因在不同物種中的同源性較高。從中選取4種不同昆蟲的JHEH氨基酸序列進行同源性分析，結果顯示相似性達到64.24%，保守性較高（圖4）。從NCBI數(shù)據(jù)庫選取20種同源性較高的不同物種，利用MEGA 4.0軟件，通過neighbor?joining（N?J）方法構建JHEH氨基酸序列進化樹。從進化樹中可以看出，Csjheh蛋白序列與鞘翅目、膜翅目等親緣性具有較高一致性，其中與中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae （登錄號XP-019766997.1）親緣關系最近，聚為一支，其余以目為類群，同目物種親緣關系較近，同源性較高（圖5）。

2.3?Csjheh基因的時空表達分析

采用實時熒光定量PCR的方法，以18S rRNA和actin為雙內參，根據(jù)2-△△Ct法對Csjheh基因在滯育不同階段的表達量進行檢測。結果如圖6所示，Csjheh基因在七星瓢蟲滯育各階段均有表達，初羽化時期表達量較高，滯育10 d時顯著降低，隨著滯育時間增加，表達量逐漸增加，滯育60 d時表達量達最高。正常發(fā)育和滯育解除后表達量沒有顯著差異。

3?討論

保幼激素在昆蟲生長發(fā)育中具有重要作用，保幼激素環(huán)氧水解酶是保幼激素的分解酶之一，是調控昆蟲體內保幼激素滴度的重要酶。保幼激素環(huán)氧水解酶基因首先在煙草天蛾中被克隆出來[1920]，迄今為止，已經在家蠶Bombyx mori、意大利蜜蜂Apis mellifera、赤擬谷盜Tribolium castaneum、黑腹果蠅Drosophila melanogaster等多種昆蟲中進行了研究報道，證明保幼激素環(huán)氧水解酶的典型結構特征是在N末端具有疏水信號肽結構[2124]。保守區(qū)域與其他昆蟲一樣具有真核生物環(huán)氧水解酶的典型結構特征，對近源物種進行同源比較，構建進化樹分析表明，七星瓢蟲保幼激素環(huán)氧水解酶Csjheh與同屬鞘翅目的中歐山松大小蠹保幼激素環(huán)氧水解酶親緣關系最近。

滯育是昆蟲適應不良環(huán)境的一種生存策略，保幼激素可以調控昆蟲的滯育[25]。作為保幼激素的關鍵分解酶，保幼激素環(huán)氧水解酶在調節(jié)保幼激素滴度方面起到重要作用[26]。前人研究證明保幼激素具有保持幼蟲形態(tài)與促進成蟲生殖系統(tǒng)發(fā)育的作用，滯育階段保幼激素滴度極低，抑制生殖系統(tǒng)發(fā)育是導致成蟲生殖滯育的重要原因[2728]。本研究通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)Csjheh基因在七星瓢蟲滯育的各個階段均存在特異性表達。其中初羽化成蟲體內表達量較高，滯育條件下降低，隨著滯育誘導時間的增加，表達量又逐漸增加，在滯育60 d時達到與初羽化接近的程度。初羽化成蟲體內具有大量的保幼激素環(huán)氧水解酶Csjheh，調控保幼激素滴度降低至正常濃度。在滯育誘導條件下，Csjheh表達量逐漸增加，調控保幼激素滴度降低至極低濃度，七星瓢蟲成蟲進入滯育狀態(tài)。推測保幼激素環(huán)氧水解酶Csjheh在七星瓢蟲滯育過程中通過調節(jié)保幼激素滴度從而參與調控其滯育過程。

本研究通過克隆得到保幼激素環(huán)氧水解酶cDNA全長，分析序列特征，并從mRNA水平檢測了該基因在七星瓢蟲雌蟲體內滯育不同階段的時間表達模式。該研究為進一步利用RNA干擾技術研究該基因的功能奠定了基礎，為更好的應用七星瓢蟲防治害蟲提供了理論依據(jù)。

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（責任編輯：田?喆）