PLK1對(duì)人子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制

魏 麗,陳玉忠,張曉靜,邵均均,李 艷,張慧慧,劉 健,王麗華*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤婦科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科;*通訊作者,E-mail:doctorwlh@163.com)

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見惡性腫瘤之一,2019年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率和死亡率近些年呈上升趨勢(shì)[1]。近年隨著基因組學(xué)等相關(guān)精準(zhǔn)治療發(fā)展迅速,針對(duì)腫瘤特異表達(dá)基因的研究已成為目前研究的熱點(diǎn)。作為絲氨酸-蘇氨酸激酶家族之一的Polo樣激酶1(polo-like kinase 1,PLK1),在生殖系統(tǒng)腫瘤[2,3]、血液系統(tǒng)腫瘤[4]和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[5]等多種惡性腫瘤中高表達(dá),并在細(xì)胞有絲分裂中起重要作用。因此,PKL1有望成為成為子宮內(nèi)膜癌的治療靶點(diǎn)。目前PKL1在子宮內(nèi)膜癌中研究較少。本研究使用免疫組化檢測(cè)PLK1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá),并通過敲低和過表達(dá)PKL1,探討其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

CCK-8試劑盒購(gòu)于諾唯贊生物試劑公司(南京),二甲亞砜(DMSO)(Biosharp公司,美國(guó)),1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)購(gòu)于Gibco公司(美國(guó)),兔抗PLK1抗體購(gòu)于abcam公司(美國(guó)),鼠抗GAPDH抗體購(gòu)于Proteintech公司(中國(guó))PLK1 shRNA慢病毒購(gòu)于上海吉瑪基因有限公司(中國(guó))。PLK1重組質(zhì)粒購(gòu)于武漢淼靈生物科技有限公司(中國(guó))。Lipo 3000購(gòu)于賽默飛公司(美國(guó))。子宮內(nèi)膜癌組織芯片購(gòu)于上海芯超生物有限公司(中國(guó))。恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國(guó)),Bio Tek酶標(biāo)儀(Synergy HT公司,美國(guó)),IX73倒置熒光顯微鏡(Olympus公司,日本)。ChemDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司,美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。用含10% FBS、10 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)AN3CA細(xì)胞,37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 shRNA敲低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中PLK1表達(dá)

慢病毒感染前24 h,將細(xì)胞按每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,使用含胎牛血清和抗生素的1640培養(yǎng)基,使細(xì)胞量在24 h內(nèi)達(dá)到80%左右。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(Mock)、無效序列對(duì)照組(Scr)和PLK1干擾序列sh1組、sh2組、sh3組,具體序列見表1;分別加入不同的shRNA慢病毒,并加入1‰體積的聚凝胺(polybrene)增加細(xì)胞膜的通透性。然后將細(xì)胞在5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,用于后續(xù)分析。

表1 PLK1干擾序列堿基Table 1 PLK1 interference sequences

1.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中PLK1、Cdc25c蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的子宮內(nèi)膜癌的AN3CA細(xì)胞,接種于6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右,使用轉(zhuǎn)染干擾或過表達(dá)序列處理細(xì)胞48 h收集細(xì)胞,并用RIPA蛋白裂解緩沖液在冰上裂解30 min,12 000 r/min,4 ℃離心30 min,提取上清進(jìn)行蛋白定量,進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜,蛋白封閉,分別孵育PLK1、Cdc25c一抗(1 ∶500)、二抗,ECL發(fā)光液顯影。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾或過表達(dá)序列處理的AN3CA細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種于96孔板中置于培養(yǎng)箱培養(yǎng),每組4個(gè)復(fù)孔,放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24,48,72,96 h。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)每孔加入10 μl的CCK-8,繼續(xù)孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm時(shí)每孔細(xì)胞的吸光度OD值。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染干擾或過表達(dá)序列處理48 h,6孔板中每孔接種1 500個(gè)細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d至克隆形成,除去培養(yǎng)液,用PBS洗2次,用5%多聚甲醛固定20 min,5%結(jié)晶紫染色室溫孵育20 min,用雙蒸水洗滌2次。室溫干燥,觀察克隆形成情況。

1.7 PLK1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的AN3CA細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至6孔板面積的80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空載體對(duì)照組(vector)和PLK1過表達(dá)質(zhì)粒(overexpression，OE)組。每組各取2個(gè)1.5 ml EP管，每管中均加入500 μl無血清1640培養(yǎng)基，然后一個(gè)EP管中加入5 μg質(zhì)粒(對(duì)照組為空載pcDNA3.1質(zhì)粒，OE組為pcDNA3.1-PLK1重組質(zhì)粒)；另一個(gè)EP管加入15 μl Lipo 3000轉(zhuǎn)染試劑，隨后將空載體對(duì)照組和OE組的2個(gè)EP管分別混合靜置15 min，加入6孔板中，作用AN3CA細(xì)胞6 h更換新鮮的完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PLK1在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)

為探索PLK1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況,首先對(duì)組織芯片進(jìn)行HE染色,可見正常組織結(jié)構(gòu)較均勻,腫瘤組織可見細(xì)胞核大深染,組織結(jié)構(gòu)紊亂(見圖1A)。而后對(duì)組織芯片進(jìn)行免疫組化染色,鏡下觀察腫瘤組織中PLK1染色明顯,正常組織染色較少(見圖1B),同時(shí)對(duì)免疫組化鏡下觀察結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果顯示PLK1在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1C)。免疫組化結(jié)果證實(shí):PLK1在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá),說明PLK1在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

圖1 PLK1在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)Figure 1 PLK1 high expression in endometrial carcinoma

2.2 shRNA敲低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中PLK1表達(dá)

為檢測(cè)shRNA對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中PLK1表達(dá)的影響及篩選有效的shRNA序列,分別設(shè)置空白對(duì)照組(Mock)、無義序列對(duì)照組(Scr)、包含不同PLK1干擾序列的sh1組、sh2組、sh3組,在shRNA慢病毒感染AN3CA細(xì)胞48 h提取蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),觀察三組序列的干擾效果進(jìn)行干擾序列的初篩,結(jié)果顯示與Mock組相比,含PLK1干擾序列的sh1組、sh2組、sh3組處理的AN3CA細(xì)胞株中PLK1的表達(dá)顯著降低,而Scr組無明顯改變(見圖2)。此結(jié)果為篩選有效PLK1干擾序列提供了依據(jù),據(jù)此實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取Scr、sh1、sh2用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

圖2 shRNA敲低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中PLK1表達(dá)Figure 2 The expression of PLK1 after shRNA treatment in AN3CA cells

2.3 shRNA敲低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中PLK1表達(dá)后細(xì)胞抑制增殖

基于PLK1干擾序列的篩選結(jié)果,分別用Scr、sh1、sh2慢病毒作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA 24,48,72,96 h,采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的OD450吸光度值。結(jié)果顯示,在相同時(shí)間點(diǎn),sh1組和sh2組與Scr組相比,作用第2天和第3天時(shí)OD450值明顯降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。在克隆形成實(shí)驗(yàn)中,與Scr組相比,sh1、sh2作用后的AN3CA細(xì)胞集落形成數(shù)量明顯減少(見圖3)。這表明在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中,敲低PLK1的表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞的增殖。

圖3 shRNA敲低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中PLK1表達(dá)后細(xì)胞增殖Figure 3 Proliferation after the down-regulation of PLK1 expression by shRNA in endometrial cancer AN3CA cells

2.4 shRNA敲低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中PLK1表達(dá)后Cdc25C的表達(dá)降低

為探索降低PLK1表達(dá)后細(xì)胞增殖抑制的相關(guān)機(jī)制。對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA進(jìn)行了如下處理:分別將Scr、sh1、sh2應(yīng)用于AN3CA細(xì)胞48 h,提取蛋白進(jìn)行進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。蛋白條帶結(jié)果顯示與Scr組相比,sh1、sh2處理的AN3CA細(xì)胞Cdc25C表達(dá)量明顯降低,蛋白相對(duì)表達(dá)量分析顯示sh1、sh2組與Scr組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。這表明在AN3CA細(xì)胞中,PLK1被干擾后的細(xì)胞增殖抑制可能是由于Cdc25C的下調(diào)所介導(dǎo)的。

與Scr比較，*P<0.05圖4 shRNA作用子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA后Cdc25C的表達(dá)Figure 4 The expression of Cdc25C after the down-regulation of PLK1 expression by shRNA in endometrial cancer AN3CA cells

2.5 子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞中過表達(dá)PLK1后可促進(jìn)細(xì)胞的增殖

子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞株轉(zhuǎn)染PLK1的過表達(dá)質(zhì)粒,培養(yǎng)48 h提取蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,結(jié)果顯示,與vector組相比,PLK1過表達(dá)組PLK1的表達(dá)明顯增加。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，第2天和第3天PLK1過表達(dá)質(zhì)粒組較空白組OD450值增加，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染PLK1過表達(dá)質(zhì)粒的AN3CA細(xì)胞的集落形成密度明顯增加(見圖5)。這表明在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中過表達(dá)PLK1表達(dá)后可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

圖5 子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞中過表達(dá)PLK1后細(xì)胞的增殖Figure 5 Proliferation after PLK1 overexpression in endometrial cancer AN3CA cells

2.6 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中過表達(dá)PLK1后Cdc25C的表達(dá)增加

同樣對(duì)子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞株轉(zhuǎn)染含有PLK1的過表達(dá)質(zhì)粒,培養(yǎng)48 h時(shí)提取蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明:PLK1過表達(dá)組中Cdc25C蛋白的表達(dá)較vector組明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中過表達(dá)PLK1促進(jìn)細(xì)胞的增殖的機(jī)制可能是通過促進(jìn)Cdc25C的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

圖6 Western blot檢測(cè)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AN3CA中過表達(dá)PLK1后Cdc25C的表達(dá)變化Figure 6 The expression of Cdc25C after PLK1 overexpression in endometrial cancer AN3CA cells by Wes-tern blot

3 討論

絲氨酸-蘇氨酸激酶家族之一的PLK1在細(xì)胞有絲分裂過程中起著關(guān)鍵作用,它與紡錘體形成、中心體復(fù)制、染色體分離等多種有絲分裂有關(guān)[6-9]。大量研究發(fā)現(xiàn),在食管癌、黑色素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌等多種實(shí)體瘤中PLK1的表達(dá)增加,這表明PLK1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[10-12]。研究發(fā)現(xiàn)將外源重組的PLK1基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入正常的纖維細(xì)胞,正常細(xì)胞可通過此過程轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤,轉(zhuǎn)變的細(xì)胞能夠在裸鼠皮下成功種植,這表明PLK1能夠直接導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變[7,13]。近來,研究指出,在肝癌和胰腺癌的早期腫瘤中PLK1即呈高表達(dá)狀態(tài)[14]。研究表明,在腫瘤細(xì)胞增殖過程中,PLK1在細(xì)胞有絲分裂的G2期被中心體募集,而后協(xié)同相關(guān)因子在G2期活化并增加下游細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin B的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的有絲分裂,細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白高表達(dá)也促進(jìn)正常細(xì)胞向惡性腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[7,13,14]。

Cdc25C作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白,參與調(diào)解細(xì)胞的有絲分裂,并與其同源蛋白CDC25A和CCDC25B協(xié)同進(jìn)入細(xì)胞分裂S期,并在G2/M期的轉(zhuǎn)換中起重要作用[8,15]。研究表明棕矢車菊素、異澤蘭黃素可通過激活細(xì)胞周期中的Chk2/Cdc25C/Cdc2通路來抑制腫瘤的增殖[16,17]。Gheghiani等[9]指出PLK1活化后可能通過抑制周期蛋白A和Cdc25C的表達(dá)來誘發(fā)細(xì)胞凋亡,從而有效地抵抗腫瘤增殖。

在進(jìn)行了腫瘤標(biāo)本的HE染色和免疫組織化學(xué)染色(IHC)對(duì)比后發(fā)現(xiàn),PLK1在子宮內(nèi)膜癌的腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織?；诖隧?xiàng)結(jié)果,針對(duì)子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞進(jìn)行了PLK1表達(dá)的敲低,而后進(jìn)行了CCK8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞集落克隆實(shí)驗(yàn)來觀察細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果顯示在PLK1表達(dá)下調(diào)之后,AN3CA細(xì)胞的增殖被抑制。為了探索此現(xiàn)象的相關(guān)機(jī)制,對(duì)上述方法處理的細(xì)胞進(jìn)行了Western blot實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cdc25C的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cdc25C的表達(dá)與PLK1被抑制相關(guān),對(duì)AN3CA細(xì)胞進(jìn)行了PLK1的過表達(dá)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在PLK1的表達(dá)上調(diào)時(shí),過表達(dá)組細(xì)胞的增殖明顯高于對(duì)照組;同時(shí),Cdc25C的表達(dá)也呈增加趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖6)。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)PLK1的表達(dá)增加,細(xì)胞增殖也明顯增加。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抑制Cdc25C的表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[9,16,17],當(dāng)PLK1過表達(dá)時(shí)Cdc25C的表達(dá)也增加,反之亦然。因此推測(cè),PLK1對(duì)AN3CA細(xì)胞增殖的影響可能與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cdc25C的表達(dá)有關(guān)。本研究的不足之處在于沒有進(jìn)行相應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,今后將對(duì)相應(yīng)處理的細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果表明,PLK1可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌AN3CA細(xì)胞的增殖,其機(jī)制可能與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cdc25C的表達(dá)有關(guān)。本研究為子宮內(nèi)膜癌的靶向治療提供了一些思路和理論支持。