miR-590-5p通過靶向PTEN調(diào)控胃腺癌細胞SGC7901對順鉑敏感性的影響

陳 瑩,章海斌,劉 玉,丁曉嬌,王子安

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,蚌埠 233004;*通訊作者,E-mail:wangzian118@sina.com)

胃癌是世界上第四常見的人類惡性腫瘤,具有較高的發(fā)病率與死亡率。據(jù)統(tǒng)計,胃癌死亡率占全球癌癥死亡原因的第二位[1-3]。盡管近年來胃癌的治療已得到提升,但其5年生存率仍不能確切統(tǒng)計[4,5],遠處轉(zhuǎn)移和化療耐藥是其致死率增高的主要原因,因此,提高胃癌早期診斷率以及降低其耐藥性對提高患者生存率和生活質(zhì)量尤為重要。miRNAs是一種能夠在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)節(jié)基因表達的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,已經(jīng)被廣泛證明能夠通過與靶基因的3′UTR(3′非編碼區(qū))結(jié)合發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[6-9]。前期研究發(fā)現(xiàn)miR-590-5p在胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP中高表達,表明其可能與胃癌耐藥具有一定的相關性,同時通過生物信息學軟件預測到miR-590-5p與PTEN能夠靶向互補,本課題主要研究miR-590-5p與PTEN的關系及其在胃癌耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

SGC7901細胞及SGC7901/DDP細胞購自上海復旦(IBS)細胞資源中心，RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hy-clone股份有限公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，miRNA-590-5p mimics、miRNA-590-5p inhibitors、陰性對照序列、GAPDH引物、PTEN引物均購自上海吉瑪基因有限公司，miR-590-5p引物、U6引物購自上海生工生物工程有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Thermo Scientific公司?？俁NA提取試劑盒購自天根科技(北京)有限公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Scientific有限公司，TB Green TM Primix Ex Taq TM試劑盒購自日本TaKaRa公司，一抗β-actin、PTEN及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗均購于Abbkine科技有限公司，Western blot試劑盒及BCA蛋白濃度測量試劑盒購自碧云天生物技術公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Biofroxx公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人胃癌細胞SGC7901培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,人胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP穩(wěn)定培養(yǎng)于順鉑濃度為0.1 mg/L含10%胎牛血清的RPMI1640中,兩者均在37 ℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行轉(zhuǎn)染,要求轉(zhuǎn)染時細胞融合達到60%,嚴格按照Lip2000及基因片段說明書進行轉(zhuǎn)染操作,將實驗分為空白組、NC組(陰性對照)、轉(zhuǎn)染組。SGC7901細胞及SGC7901/DDP細胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-590-5p mimics及miRNA-590-5p inhibitors,分別用10 μl Lip2000混合4 μg基因片段置入500 μl不含血清培養(yǎng)基靜置20 min后加入培養(yǎng)皿,最終培養(yǎng)液終濃度為1 μg/L,6 h更換不含雙抗僅含10%胎牛血清培養(yǎng)液,48 h進行后續(xù)實驗。

1.3 檢測SGC7901細胞及SGC7901/DDP轉(zhuǎn)染后miR-590-5p的表達

轉(zhuǎn)染后用總RNA提取試劑盒提取細胞內(nèi)總RNA,并用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA,合成的cDNA用TB GREEN試劑盒通過PCR儀進行PCR擴增,以U6為內(nèi)參檢測miR-590-5p相對表達量,最終Ct值采用2-ΔΔCt進行分析。引物序列如下:U6正向5′-TG G CA CCCA GCACAATGAA-3,反向5-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3;miR-590-5p正向5′-GAGCTTATTCATAAAAGTG-3′。實時熒光定量PCR采用兩步法PCR擴增標準程序:第一步預變性(95 ℃,30 s),第二步PCR反應(95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s),共40個循環(huán),所有試驗均重復3次。

1.4 MTT檢測轉(zhuǎn)染后胃癌細胞對順鉑敏感性的變化

胰酶消化收集轉(zhuǎn)染后空白組、NC組、轉(zhuǎn)染組SGC7901細胞及SGC7901/DDP細胞分別按5 000個/孔接種于96孔板,置于37 ℃,5% CO2,在飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h,吸去原培養(yǎng)液,分別加入終濃度為0,2,4,8,16,32 μmol/L的含順鉑培養(yǎng)液,以不接種細胞而只加培養(yǎng)基的孔作為調(diào)零孔,以不加藥的孔作為對照組,每個濃度設5個復孔,給藥后培養(yǎng)48 h,檢測其490 nm處吸光度。

1.5 生物信息學預測miR-590-5p的下游靶基因

通過生物信息學軟件(Target Scan和PicTar)預測能夠與miR-590-5p結(jié)合的下游靶點作為備選的靶基因。

1.6 總RNA提取及實時熒光定量PCR檢測

轉(zhuǎn)染后用總RNA提取試劑盒提取細胞內(nèi)總RNA,將提取的RNA用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA,合成的cDNA用TB GREEN試劑盒通過PCR儀進行PCR擴增,以GAPDH為內(nèi)參檢測PTEN相對表達量,最終Ct值采用2-ΔΔCt進行分析,引物序列如下:GAPDH正向5′-TCTCTCCTCCTCCTGTTCG-3′,反向5′-GCGCCCAATAGGACCAAATC-3′;PTEN正向5′-CAATGACAGCCATCATCAAAGAG-3′,PTEN反向5′GCTCAGACTTTTGTAATTTGTG-3′。實時熒光定量PCR采用兩步法PCR擴增標準程序:第一步預變性(95 ℃,30 s),第二步PCR反應(95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s),共40個循環(huán),采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量,所有試驗均重復3次。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達水平

胰酶消化收集轉(zhuǎn)染后空白組、NC組、轉(zhuǎn)染組SGC7901及SGC7901/DDP細胞,2 500 r/min離心8 min,棄上清,加入裂解液,冰上裂解30 min,-20 ℃冰箱過夜,次日4 ℃離心機12 000 r/min離心30 min,取上清液,蛋白定量后PAGE-SDS膠對蛋白樣品進行電泳分離1.5 h,PVDF膜轉(zhuǎn)膜1.5 h,含5%脫脂牛奶的TPST室溫封閉4 h,一抗β-actin、PTEN 4 ℃下孵育過夜(PTEN抗體按1 ∶1 000稀釋,β-actin抗體按1 ∶5 000稀釋),二抗室溫下孵育2 h,TPBS洗3次,曝光顯影。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-590-5p表達水平

RT-PCR結(jié)果表明,SGC7901細胞轉(zhuǎn)染miR-590-5p mimics后其表達量明顯升高,而SGC7901/DDP細胞轉(zhuǎn)染miR-590-5p inhibitor后其表達量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。

與空白組及NC組比較,*P<0.05圖1 轉(zhuǎn)染后胃癌細胞中miR-590-5p表達水平的變化Figure 1 Changes of miR-590-5p expression in gastric cancer cells after transfection

2.2 MTT檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖抑制作用

MTT結(jié)果顯示,上調(diào)SGC7901細胞中miR-590-5p的表達,胃癌細胞SGC7901對順鉑的敏感性降低,而敲低SGC7901/DDP胃癌細胞中的miR-590-5p,其對順鉑的敏感性升高(P<0.05,見圖2),提示miR-590-5P能夠影響胃癌細胞的耐藥性。

與NC及空白對照組比較,*P<0.05圖2 miR-590-5p對胃癌細胞順鉑敏感性的影響Figure 2 Effect of miR-590-5p on cisplatin sensitivity of gastric cancer cells

2.3 Targetscan軟件預測靶基因

通過生物信息學軟件預測出miR-590-5p能夠與PTEN 3′UTR靶向結(jié)合,可將PTEN作為miR-590-5p的備選靶基因(見圖3)。

圖3 生物信息學軟件預測miR-590-5p靶基因Figure 3 Bioinformatics software predicts miR-590-5p target gene

2.4 miR-590-5p對PTEN mRNA表達的影響

結(jié)果顯示,在胃癌細胞SGC7901中轉(zhuǎn)染組相較于陰性對照組及空白對照組PTEN mRNA表達水平降低;相反地,在胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP中轉(zhuǎn)染組PTEN mRNA表達水平較陰性對照組及空白對照組升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。

與NC及空白對照組比較,*P<0.05圖4 MiR-590-5p對PTEN mRNA表達的影響Figure 4 Effect of miR-590-5p on the expression of PTEN mRNA

2.5 miR-590-5p對PTEN蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果顯示,在胃癌細胞SGC7901中轉(zhuǎn)染組相較于陰性對照組及空白對照組PTEN蛋白表達水平降低;相反地,在胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP中轉(zhuǎn)染組PTEN蛋白表達水平較陰性對照組及空白對照組升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖5)。

1.SGC7901組;2.SGC7901 NC組;3.miR-590-5p mimics組;4.SGC7901/DDP組;5.SGC7901/DDP NC組;6.SGC7901/DDP inhibitor組;與相應的NC及空白對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 miR-590-5p對PTEN蛋白表達的影響Figure 5 Effect of miR-590-5p on PTEN protein expression

3 討論

胃癌耐藥在胃癌患者的治療中尤為常見,胃癌患者存活率明顯低于其他腫瘤患者,多數(shù)胃癌患者治療后會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移[10]。因此,明確胃癌耐藥的具體機制能夠為胃癌患者的治療及改善預后提供新的思路。

miRNAs是一類可能具有癌基因或抑癌基因功能的小分子非編碼RNA,越來越多研究表明miRNAs廣泛參與腫瘤的病理學研究并且能夠通過結(jié)合下游靶基因3′UTR來調(diào)控多種腫瘤細胞的生物學功能及腫瘤耐藥等,miRNAs的發(fā)現(xiàn)在一定程度上為腫瘤發(fā)病機制提供新的思路,也為腫瘤的診斷及治療提供新的方向[11-13]。已有研究表明在肝癌、宮頸癌、腎癌、結(jié)直腸癌、食管鱗癌細胞中上調(diào)miR-590-5p能夠影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學行為[14-17],因此推測miR-590-5p在多種腫瘤細胞中可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要作用。同時,miR-590-5p可以通過調(diào)節(jié)下游靶基因RECK等的表達變化影響胃癌細胞的增殖、凋亡等生物學行為,并且具有調(diào)節(jié)胃癌細胞對順鉑及紫杉醇的耐藥作用[18],但其具體的機制尚未明確。磷酸酶及張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten, PTEN),于1997年發(fā)現(xiàn),是位于10號染色體具有雙特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因[19]。研究發(fā)現(xiàn),PTEN與腫瘤的發(fā)生密切相關,在多種腫瘤中如膽管癌、肺癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、肝癌等常常存在表達和功能的異常[20-23],發(fā)揮著抑癌基因的功能。

本研究通過比較miR-590-5p在胃癌親本細胞SGC7901和耐藥細胞SGC7901/DDP中的表達表明,miR-590-5p在胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP細胞中有較高表達,通過過表達和敲低SGC7901細胞和SGC7901/DDP細胞中的miR-590-5p發(fā)現(xiàn),SGC7901細胞對順鉑的敏感性下降,而SGC7901/DDP細胞對順鉑敏感性提高,表明miR-590-5p能夠影響胃癌細胞的耐藥性。為了研究miR-590-5p影響胃癌細胞發(fā)生耐藥的機制,本實驗通過軟件Targetscan預測出miR-590-5p的下游靶基因PTEN,并通過熒光定量PCR及Western blot表明,miR-590-5p能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)PTEN的表達,由此表明,miR-590-5p能夠通過靶向調(diào)節(jié)PTEN來調(diào)控胃癌細胞耐藥,提示miR-590-5p可以作為胃癌耐藥治療的一個新的方向。