常用藏藥材叢菔質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升

1.青海省藏醫(yī)藥研究院，青海 西寧 810006；2.金訶藏藥股份有限公司，青海 西寧 810003

叢菔現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) 藏藥》第一冊[5]和《青海省藏藥炮制規(guī)范》2010年版[7]，質(zhì)量控制項(xiàng)目僅限于性狀和顯微鑒別，由于藏醫(yī)口耳相傳的傳統(tǒng)以及地域環(huán)境不同導(dǎo)致對叢菔藥材的來源尚不明確，筆者在文獻(xiàn)資料的基礎(chǔ)上結(jié)合藏區(qū)各地對叢菔藥材的使用情況，確定了叢菔的藥材來源，為十字花科植物寬果叢菔Solms-laubachiapulcherrima(Maxim.) Bofsch.的干燥全草，并對其化學(xué)成分定性鑒別、水分和重金屬控制及含量測定方法進(jìn)行了詳細(xì)研究，為更好地控制叢菔藥材的質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超聲波清洗器(KQ-250型)；高效液相色譜儀(島津LC-20AT)； METTLER AG204萬分之一分析天平，METTLER AX205十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒)； HH-4恒溫水浴鍋(上海科學(xué)儀器廠)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；TAS-986原子吸收分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，GFH-986石墨爐電源，AFS-830原子熒光光度計(jì)(北京吉天儀器有限公司)。

1.2 試藥 迪馬C18色譜柱；β-谷甾醇對照品(批號：872-200204供含量測定用)；精氨酸對照品(批號：872-201304供含量測定用)；以上對照品購自中國藥品生物制品鑒定所；雙蒸餾水(自制)；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。鉛標(biāo)準(zhǔn)單元素溶液：標(biāo)準(zhǔn)值為1000μg·mL-1，證書編號為GBW08619；砷標(biāo)準(zhǔn)單元素溶液：標(biāo)準(zhǔn)值為1000μg·mL-1，證書編號為GBW08611；汞標(biāo)準(zhǔn)單元素溶液：標(biāo)準(zhǔn)值為1000μg·mL-1，證書編號為GBW08617；叢菔對照藥材(溯源樣品，采自青海貴南)：由青海藏醫(yī)學(xué)院尕瑪措尼教授鑒定為十字花科植物寬果叢菔Solms-laubachiapulcherrima(Maxim.) Bofsch.樣品信息詳見表1。

表1 叢菔藥材收集情況

2 方法與結(jié)果

2.1 β-谷甾醇的TLC鑒別 取本品粉末2.0 g，加三氯甲烷30 mL，超聲處理(功率300 W,頻率40 khz)30 min，濾過，濾液濃縮至2 mL作為供試品溶液。另取叢菔對照藥材2.0 g，同法制成對照藥材溶液。再取β-谷甾醇對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按TLC法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-丙酮 (25∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，并在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光和紫外光燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)(如圖1和圖2所示)。

2.2 檢查

2.2.1 水分 取叢菔藥材粉末(過3號篩)約2 g，精密稱定，照水分測定法《中國藥典》2015年版一部附錄IXH第一法烘干法測定。每批平行測定2份，結(jié)果見表2。

2.2.1 重金屬檢測 隨機(jī)抽取9批樣本中3批原藥材，按照《中國藥典》2015年版一部附錄Ⅸ B項(xiàng)下(鉛、砷、汞)的測定方法進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3。

2.3 浸出物測定 取叢菔藥材粉末(過3號篩)約2～4 g，精密稱定，以水為溶劑，照水溶性浸出物測定法熱浸法測定，每批平行測定2份，測定結(jié)果見表2。

表2 叢菔藥材水分及浸出物測定結(jié)果

表3 叢菔藥材中重金屬測定結(jié)果

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液(pH=6)-乙腈(84∶16)為流動相；檢測波長為360 nm，柱溫30 ℃。理論板數(shù)按精氨酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取精氨酸對照品適量，加蒸餾水制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得精氨酸貯備液；精密吸取1.0 mL貯備液于10 mL量瓶中，加入0.5 mol·L的碳酸氫鈉溶液和1%DNFB乙腈溶液各1 mL，避光，于60 ℃水浴上反應(yīng)30 min，取出，冷卻，以0.05 mol·L磷酸鹽緩沖溶液(pH=6.8)定容，即得20.0 μg·mL-1的對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取1 g蓯菔藥材粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL水，稱定重量，超聲30 min，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取2.0 mL續(xù)濾液于10 mL容量瓶中，加入0.5 mol·l-1碳酸氫鈉溶液和1%DNFB乙腈溶液各1 mL，避光，于60℃水浴上反應(yīng)30 min，取出，冷卻，以磷酸鹽緩沖液定容，即得供試品溶液。[8]

2.4.4 提取方法考察 對樣品分別進(jìn)行超聲處理、回流提取，結(jié)果超聲處理的效果最好，可消除對所有待測組分的干擾并且含量較高。結(jié)果見表4。

表4 提取方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果

2.4.5 測定波長的選擇 取對照品溶液和供試品溶液分別在190～400 nm的波長內(nèi)測吸光度，結(jié)果在360 nm處有最大吸收，故選此波長為測定波長。

2.4.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取對照品溶液3、6、9、12、15 μL注入液相色譜儀測定，按2. 1項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積的積分值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得精氨酸回歸方程為Y=229766X-41832.50，r=0.9992。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，精氨酸在0.0612～0.306 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表5。

表5 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果(精氨酸)

2.4.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取精氨酸對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得精氨酸峰面積RSD為1.4%。表明儀器進(jìn)樣精密度良好。結(jié)果見表6。

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液10 μL，分別于2，6，8，10，12 h進(jìn)樣，測定精氨酸的含量，結(jié)果RSD為1.8%，即樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表7。

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.9 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取不同批次樣品5份，按【含量測定】項(xiàng)下色譜條件測定，測定含量RSD為1.3%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。結(jié)果見表8。

表8 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.10 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6份，精密加入精氨酸對照品溶液，按樣品制備方法和測試條件進(jìn)行測定，計(jì)算得平均回收率為97.0%，RSD為0.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測定 取1g樣品粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL水，稱定重量，超聲30 min，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取2.0 mL續(xù)濾液于10 mL容量瓶中，加入0.5mol·l-1碳酸氫鈉溶液和1%DNFB乙腈溶液各1 mL，避光，于60 ℃水浴上反應(yīng)30 min，取出，冷卻，以磷酸鹽緩沖液定容，即得。吸取10 μL進(jìn)樣,測定，結(jié)果3批樣品(2個(gè)平行樣)中精氨酸平均含量為0.314%。結(jié)果見表10。

表10 樣品中精氨酸的含量

3 討論

3.1 薄層色譜 研究過程中分別對叢菔所含不同成分(亞油酸、亞麻酸)的進(jìn)行了薄層色譜分析，但始終效果不理想，只有β-谷甾醇的薄層色譜圖較為清晰，易于辨認(rèn)，效果較好，通過對展開系統(tǒng)的篩選，分別以三氯甲烷-丙酮 (25∶1)、乙酸乙酯-丙酮 (20∶6) 、三氯甲烷-乙酸乙酯-丙酮 (12∶7∶3)等展開系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以三氯甲烷-丙酮 (25∶1)展開后效果最佳，Rf值符合要求；分別用10%硫酸乙醇溶液和香草醛硫酸溶液進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)10%硫酸乙醇溶液效果較好，斑點(diǎn)清晰，在日光下及紫外燈下均可見清晰斑點(diǎn)，說明本方法專屬性強(qiáng)、操作簡便，方法穩(wěn)定。

3.2 水分 按中國藥典2010年版一部附錄IXH第一法烘干法測定9批樣品水分，根據(jù)測定結(jié)果顯示，暫定水分不得過12.0%。

3.3 重金屬 3批樣品檢測結(jié)果顯示重金屬含量非常小,未超限度。由于藥材中的重金屬與產(chǎn)地的自然生態(tài)環(huán)境土壤、水分及空氣中的重金屬含量有直接的關(guān)系，叢菔主要生長在海拔3500～4500 m的高山砂質(zhì)土或巖石隙縫中，高海拔，重金屬無污染，控制藥材重金屬意義不大，故可暫列入標(biāo)準(zhǔn)正文。

3.4 浸出物 本研究依據(jù)藥典中關(guān)于浸出物的方法，分別對藥材進(jìn)行了冷浸法和熱浸法的測定試驗(yàn)，結(jié)果表明熱浸法優(yōu)于冷浸法，且乙醇和水為溶劑的熱浸法比較顯示，以水為溶劑效果更好，因此選用以水為溶劑的熱浸法為浸出物測定方法。

3.5 含量測定 關(guān)于叢菔藥材的定量測定方面研究資料很少，巴桑旺姆等[8]曾用HPLC法測定叢菔藥材的精氨酸含量，筆者在上述方法的基礎(chǔ)上增加了樣品量，并對樣品制備方法和流動相進(jìn)行了調(diào)整，使得精氨酸的分離度更好，準(zhǔn)確度更高。鑒于考慮叢菔藥材中精氨酸的含量有所差異且9批樣品所得平均值后，故規(guī)定本品按干燥品計(jì)算，含精氨酸(C6H14N4O2)不得少于0.20%。