苗藥痛風(fēng)停對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥因子及滑膜病理的影響

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550001

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(goutyarthritis，Gout)是尿酸鹽晶體沉積于人體內(nèi)所導(dǎo)致的一種炎性疾病，急性期以關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛為主要臨床特征，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、骨骼損毀，甚則等影響到內(nèi)臟器官功能，出現(xiàn)腎功能衰竭[1]。研究顯示尿酸鹽結(jié)晶作為炎癥激發(fā)因子，通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)信號(hào)途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，機(jī)體生成白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)、腫瘤壞死因子ɑ(Tumor necrosis factor，TNF-ɑ)等多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥瀑布反應(yīng)[2]?！兜は姆ā分杏涊d：“痛風(fēng)者，四肢百節(jié)走痛，方書謂之白虎歷節(jié)風(fēng)證是也”，認(rèn)為是風(fēng)、熱、痰、濕相互膠結(jié)為患，阻滯經(jīng)脈氣血所致；苗醫(yī)認(rèn)為痛風(fēng)屬“熱經(jīng)病”，多由于“風(fēng)、熱、火、濕”等邪氣熾盛、血脈受阻，邪毒留滯筋骨所致，其認(rèn)識(shí)與祖國醫(yī)學(xué)殊途同歸。治療用藥上多以流轉(zhuǎn)氣血、清熱解毒、去除邪熱為法，達(dá)到“趕邪”的目的。我科于臨床中借鑒中醫(yī)、苗醫(yī)理論研創(chuàng)了“痛風(fēng)?！狈剑摲街腥卟?、大澤蘭、田七草、觀音草、芭蕉根等藥物屬苗醫(yī)藥范疇，能“趕邪祛毒、行血消腫”，配合石膏、虎杖、黃柏等藥物，達(dá)到活血散結(jié)、清熱解毒、利水消腫的目的，臨床中發(fā)現(xiàn)苗藥“痛風(fēng)?！狈侥茌^好的減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期炎性腫脹、疼痛。本研究通過建立大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，觀察痛風(fēng)停對血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子及關(guān)節(jié)滑膜組織的影響，探討苗藥痛風(fēng)停方對痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的抗炎作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年雄性SD大鼠72只，清潔級(jí)，體重(240±20)g，購置于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，證號(hào)SCXK(京2013-0007)。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，同等飼養(yǎng)條件。按隨機(jī)數(shù)字分組方法分為空白對照組、模型對照組、痛風(fēng)停低劑量組、中劑量組、高劑量組和秋水仙堿對照組共6組，每組12只。

1.2 主要材料及設(shè)備 實(shí)驗(yàn)藥物苗藥痛風(fēng)停湯由三七草(銳徒清)30 g、大澤蘭(銳米菜)15 g、田七草(銳天梯)15 g、觀音草(銳油沙)15 g、芭蕉根30 g等藥物組成(由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供)。對照藥物秋水仙堿片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20161001)；尿酸鈉(美國Sigma公司，批號(hào)：U2875-5G)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0010S)；DBA、PV-9000(北京中杉金橋生物)；IL-1、IL-6、IL-8檢測ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究院)；切片機(jī)(德國萊卡，型號(hào)：RM2015)，顯微鏡(日本奧林巴斯，型號(hào)：BX51T-PHD-J11)；低溫高速離心機(jī)(SCILOGEX，型號(hào)：D3024R)；自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(美國BioTek公司)；脫色搖床(國立常州試驗(yàn)設(shè)備研究所)；超凈工作臺(tái)(蘇潔凈化有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物制備 將上述苗藥加水1000 mL浸泡1 h后煎煮30 min，再加水500 ml煎煮30 min，兩煎混合過慮后濃縮至含生藥物1 g/mL，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。秋水仙堿取適量加蒸餾水配置成1 g/mL混懸液，儲(chǔ)存待用。

2.2 造模方法 按照Mc Carty DJ的造模方法[4]，除空白對照組外，其余各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用20%烏拉坦(5 mL/kg靜脈注射)麻醉，然后將大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍脫毛，消毒皮膚，輕彎曲膝關(guān)節(jié)，于關(guān)節(jié)正中或側(cè)方進(jìn)針，用6號(hào)注射針將尿酸鈉溶液10 mg(0.4 mL)及多粘菌素B 0.1 mL(10U/mL)注入大鼠膝關(guān)節(jié)腔，制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。造模成功后，病變關(guān)節(jié)明顯腫脹、發(fā)熱，患肢活動(dòng)受限。

2.3 給藥方法 痛風(fēng)停方的成人(60 kg)每日劑量為生藥1.25 g/kg，根據(jù)人與大鼠體質(zhì)量確定大鼠的等效劑量為中劑量(7.5 g/kg)，等效劑量的1/2倍為低劑量(3.75 g/kg)，等效劑量的2倍為高劑量(15 g/kg)。陽性藥對照組秋水仙堿取等效劑量30 mg/kg[5]。從造模第1天開始，連續(xù)灌胃7 d，每天分2次給藥，模型對照組和空白對照組灌服等量生理鹽水。

2.4 觀測指標(biāo)

2.4.1 各組大鼠一般情況觀察，包括活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)、進(jìn)食、反應(yīng)能力等方面。

2.4.2 外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8濃度檢測 股動(dòng)脈采集外周血，離心后收集血清送檢，使用ELISA檢測方法對TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明書步驟進(jìn)行操作。

2.4.3 關(guān)節(jié)滑膜組織病理檢測 取各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇處理至水洗，然后染色、固定。具體操作步驟嚴(yán)格參照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 一般情況 成功復(fù)制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，模型組大鼠明顯動(dòng)作遲緩，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)量明顯減少，食量減少，精神萎靡，毛發(fā)無光澤。與模型組相比，痛風(fēng)停湯中、高劑量組與秋水仙堿組大鼠一般情況均較治療前明顯改善，進(jìn)食量較多，反應(yīng)良好，活動(dòng)量接近正常。

3.2 痛風(fēng)停方能夠降低模型大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的濃度 比較各組大鼠外周血檢測結(jié)果，與空白組比較，造模組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，痛風(fēng)停低、中、高劑量組及秋水仙堿組均有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；痛風(fēng)停高劑量組檢測結(jié)果低于秋水仙堿組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α濃度

續(xù)表1 表1 各組大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α濃度

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與秋水仙堿組比較，cP<0.05。

3.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理 與空白組比較，模型組滑膜組織增厚，大量淋巴細(xì)胞浸潤，血管增生；與模型組比較，痛風(fēng)停低劑量組滑膜增生、淋巴細(xì)胞浸潤均較輕，痛風(fēng)停中、高劑量組滑膜增生則不明顯，淋巴細(xì)胞浸潤顯著減少，秋水仙堿組與痛風(fēng)停低劑量組改變近似。如圖1～6所示。

4 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患病率逐年增加，發(fā)病年齡也趨向年輕化，而尿酸鹽是炎癥誘發(fā)的啟動(dòng)因素。研究顯示痛風(fēng)的發(fā)生機(jī)制較多，其中TLRs/MyD88炎癥通路較為集中[6]。機(jī)體內(nèi)尿酸鹽晶體暴露后誘導(dǎo)TLRs/MyD88通路激活，觸發(fā)組織細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8、干擾素γ等，誘使中性粒細(xì)胞脫顆粒和單核巨噬細(xì)胞聚集、吞噬[7-10]，并激活NF-κB炎癥通路[11]，使炎癥反應(yīng)持續(xù)放大。

IL是一類具有多重功效的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。IL-1是一種由單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞分泌，常常和TNF-α共同發(fā)揮“核心”致炎的作用，是痛風(fēng)主要的促炎因子[12]；同時(shí)IL-1還誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附因子，使白細(xì)胞聚集于關(guān)節(jié)腔內(nèi)[13]。IL-6主要由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生，并刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，以激活效應(yīng)性T細(xì)胞，還可以誘導(dǎo)血管上皮細(xì)胞形成血管翳，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附因子[14]。IL-8是一種趨化性細(xì)胞因子，主要是由單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌，參與炎癥和體內(nèi)的免疫防御反應(yīng)。研究證實(shí)[15-16]上述三種白介素在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。TNF-α主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放[17]，與IL-l、IL-6、IL-8形成聯(lián)動(dòng)，誘導(dǎo)炎癥呈瀑布樣發(fā)展。因此，我們認(rèn)為TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8等炎癥因子是在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)急劇發(fā)生發(fā)展的重要介質(zhì)，對上述炎癥介質(zhì)的抑制，是有效減輕痛風(fēng)炎癥的手段。

苗醫(yī)理論認(rèn)為痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎是由于各種原因?qū)е隆靶岸尽薄ⅰ帮L(fēng)毒”、“火毒”及“瘀毒”等侵襲所引起，屬于“熱經(jīng)病”范疇，治療當(dāng)予“趕毒”(瑪汝務(wù)翠)為法，痛風(fēng)停方源于苗族經(jīng)驗(yàn)方，由三七草(銳徒清)、大澤蘭(銳米菜)、田七草(銳天梯)、觀音草(銳油沙)、芭蕉根、虎杖、生石膏、黃柏等組成，全方具有祛邪解毒、活血化濁、清熱利水、消腫散結(jié)之效，可有效減輕痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)疼痛，可有效降低患者炎癥指標(biāo)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α濃度顯著升高，且滑膜組織增生、淋巴細(xì)胞浸潤，經(jīng)苗藥痛風(fēng)停治療后，能減輕大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，顯著降低外周血中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的濃度，并抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖，充分說明苗藥痛風(fēng)停通過抑制機(jī)體多種炎癥因子的釋放，從而控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。