配伍對半夏-厚樸藥對中相關化學成分溶出的影響研究△

袁海建，劉玉梅a，劉興勇，張光際，李衛(wèi)星，姜俊*，孫娥，陳靖靖

1.泰州職業(yè)技術學院，江蘇 泰州 225300；2.國家中醫(yī)藥管理局 中藥釋藥系統(tǒng)重點研究室，江蘇 南京 210028

半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖，具有抗腫瘤、止咳、抗炎等藥理作用[1]。厚樸為木蘭科植物厚樸MagnoliaofficinalisRehd.etWils的干燥樹皮(干皮、根皮及枝皮)，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等藥理作用[2]。半夏-厚樸藥對出自《金匱要略》記載的半夏厚樸湯，在該復方中兩藥相須相使，達到藥效疊加的目的[3]。在半夏厚樸湯中該藥對的配伍比例為4∶3，總用藥質量為21 g。

雖然半夏、厚樸單味藥材的化學成分[4]和藥理研究[5-7]已經(jīng)取得一定進展，但關于不同配伍比例對該藥對中厚樸化學成分影響的研究相對較少。故本實驗擬先以半夏-厚樸經(jīng)典配伍比例4∶3為基準，采用等比遞增(減)法設置半夏-厚樸藥對不同配伍比例(0∶1、1∶6、2∶5、3∶4、3.5∶3.5、4∶3、5∶2、6∶1、1∶0，下同)，建立其HPLC分析方法，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》對藥對不同配伍比例的指紋圖譜進行評價，確定34個共有峰，觀察不同配伍比例下厚樸6個活性成分(厚樸酚、和厚樸酚、綠原酸、紫丁香苷、木蘭花堿、金絲桃苷)、7個未知成分溶出量的變化情況，為深入研究藥對配伍比例對厚樸相關成分的影響，推測分析藥對配伍合理性提供有益探索。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260LC型高效液相色譜儀(四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和DAD檢測器)；Agilent ZORBAX SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；MS150DU十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多公司)；KH2200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；乙腈、甲醇均為色譜純(購自TEDIA)；磷酸(購自阿拉丁)；純凈水(娃哈哈集團)；0.2%磷酸緩沖溶液(自配)。

1.2 材料

對照品厚樸酚(批號：161205，純度≥98%)、和厚樸酚(批號：161029，純度≥98%)、綠原酸(批號：161223，純度≥98%)、紫丁香苷(批號：GR-134-170104，純度≥98%)、木蘭花堿(批號：GR-134-170303，純度≥98%)、金絲桃苷(批號：GR-133-161106，純度≥98%)皆購自南京廣潤生物制品有限公司。

姜厚樸(產(chǎn)地：四川，批號：160201，泰州德新元大藥房)、半夏(泰州市高港中藥飲片有限公司，批號：20180312)經(jīng)泰州市中醫(yī)院王姝梅主任藥師鑒為厚樸、半夏正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脫：0～4 min，10%～30%A；4～7 min，30%～36%A；7～8 min，36%～78%A；8～12 min，78%～80%A；12～14 min，80%～90%A；14～19 min，90%～99%A；19～20 min，99%～10%A；檢測波長：225 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL min-1；進樣量：5 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取厚樸酚11.00 mg、和厚樸酚11.50 mg、綠原酸2.70 mg、紫丁香苷20.00 mg、木蘭花堿15.00 mg、金絲桃苷5.00 mg，置于5 mL容量瓶中用甲醇溶解并稀釋至刻度；制得含厚樸酚2.20 mg mL-1、和厚樸酚2.30 mg mL-1、綠原酸0.54 mg mL-1、紫丁香苷4.00 mg mL-1、木蘭花堿3.00 mg mL-1、金絲桃苷1.00 mg mL-1的混合對照品儲備液。置于4 ℃下保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

按不同配伍比例各稱取半夏、厚樸藥材，總質量均為21 g，加入8倍量的80%乙醇水，溫度60 ℃，水浴加熱回流90 min，過濾，放冷，補足減失質量，定容至175 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.4 線性曲線繪制

精密移取厚樸酚、和厚樸酚、綠原酸、紫丁香苷、木蘭花堿、金絲桃苷混合對照品儲備液各0.02、0.10、0.28、0.46、0.64、0.82、1.00 mL；分別置于5 mL量瓶中用流動相稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度混合對照品溶液，注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進樣分析，見圖1。

注：1.紫丁香苷；2.綠原酸；3.木蘭花堿；4.金絲桃苷；5.和厚樸酚；6.厚樸酚。圖1 厚樸6個活性成分混合對照品色譜圖

以對照品溶液濃度為自變量(X)，峰面積為因變量(Y)，進行回歸，得到6個對照品的回歸方程分別為：紫丁香苷Y=719.12X+53.87，線性范圍0.080 0～4.000 0 mg mL-1，r=0.999 4；綠原酸Y=2 115.5X+54.79，線性范圍0.010 8～0.540 0 mg mL-1，r=0.999 0；木蘭花堿Y=2 767.6X+129.89，線性范圍0.060 0～3.000 0 mg mL-1，r=0.999 3；金絲桃苷Y=1073.2X+29.192，線性范圍0.020 0～1.000 0 mg mL-1，r=0.999 0；和厚樸酚Y=7 961.7X+368.7，線性范圍0.046 0～2.300 mg mL-1，r=0.999 2；厚樸酚Y=10 512X+243.86，線性范圍0.044 0～2.200 0 mg mL-1，r=0.999 1。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取2.4項下混合對照品溶液(含紫丁香苷0.080 0 mg mL-1；綠原酸0.010 8 mg mL-1；木蘭花堿0.060 0 mg mL-1；金絲桃苷0.020 0 mg mL-1；和厚樸酚0.046 0 mg mL-1；厚樸酚0.044 0 mg mL-1)，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣5次，記錄各對照品峰面積，計算各對照品峰面積的RSD分別為0.65%、0.87%、0.30%、0.55%、0.18%、0.22%，說明儀器精密度較好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 取1∶6配伍比例的兩藥材，按2.3項下所述方法制備，在室溫下放置0、4、8、12、24 h，按2.1項下色譜條件測定，記錄各對照品峰面積，計算各對照品峰面積的RSD值分別為2.84%、2.79%、1.43%、1.02%、0.56%、0.60%，表明供試品溶液在室溫條件下至少24 h內穩(wěn)定。

2.5.3 重復性試驗 取1∶6配伍比例的兩藥材，按2.3項下所述方法平行制備5份，按2.1項下色譜條件測定，計錄各對照品峰面積，計算各對照品峰面積RSD值分別為1.07%、1.94%、1.43%、1.02%、0.56%、0.60%，表明本法重復性良好。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 藥對指紋圖譜建立和厚樸共有峰確定 按2.3項下供試品制備方法平行制備藥對不同配伍比例供試液各6份，按2.1項下色譜條件測定，依據(jù)國家藥典委員會頒布《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版本)》，以厚樸單味藥材(配伍比例0∶1)的指紋圖譜為參照譜圖，采用中位數(shù)法，時間窗口設為0.1，經(jīng)多點校正和峰匹配，開展藥對不同配伍比例指紋圖譜相似度評價，確定共有峰34個，見圖2；計算藥對各配伍比例項下6份供試品中各峰的保留時間、峰面積平均值和保留時間RSD，見表1。

注：6.紫丁香苷；9.綠原酸；11.木蘭花堿；16.金絲桃苷；26.和厚樸酚；28.厚樸酚。 圖2 不同配伍比例藥對HPLC指紋圖譜

由表1中可知，34個共有峰相對保留時間RSD均<0.9%，說明不同配伍比例中各成分的出峰時間穩(wěn)定。

2.6.2 共有峰中考察峰的選擇 采用2.6.1項下指紋圖譜相似度評價法生成對照圖譜R，見圖3(色譜峰編號參照圖2中順序)。通過與對照品圖譜比對，峰6、9、11、16、26、28分別為紫丁香苷、綠原酸、木蘭花堿、金絲桃苷、和厚樸酚、厚樸酚，為活性成分(峰)。另選取共有峰中單峰面積大于總峰面積0.5%、相對保留時間RSD<0.35%的成分1(tR=2.361)、成分3(tR=2.718)、成分12(tR=6.324)、成分15(tR=6.835)、成分17(tR=7.333)、成分22(tR=10.405)、成分27(tR=13.224)7個成分，為未知成分(峰)。

表1 不同配伍比例藥對共有峰保留時間①和峰面積②

注：按數(shù)據(jù)統(tǒng)計量，①為n=48；②為n=6；③為n=48。

圖3 半夏-厚樸藥對提取液對照指紋圖譜

2.6.3 計算活性成分含量及其變化百分率 將表1中0∶1配伍比例項下各活性成分平均峰面積代入2.4項下回歸方程算得各活性成分含量(mg mL-1)，再根據(jù)公式(1)，計算各活性成分藥材含量理論值(mg g-1)。按2.3項下供試品制備方法平行制備藥對不同配伍比例供試品各3份，按2.1項下色譜條件測定，記錄各活性成分峰面積，據(jù)2.4項下回歸方程算得各活性成分含量(mg mL-1)后再依公式(1)計算，為各活性成分藥材含量實測值(mg g-1)。根據(jù)公式(2)計算各活性成分含量變化百分率，結果見表2。

藥材含量=算得含量(mg mL-1)×175(mL)/藥材用量(g)

(1)

含量變化百分率=(實測值-理論值)/理論值×100%

(2)

2.6.4 變化百分率影響判斷依據(jù) 參照文獻[9]，變化百分率<5%，屬于誤差范圍，認為該配伍比例對厚樸該成分溶出沒有影響；5%≤變化百分率≤10%，認為該配伍比例對厚樸該成分溶出有影響；變化百分率>10%，認為該配伍比例對厚樸該成分溶出有顯著影響。

由表1、2可知，半夏中不含紫丁香苷等已知成分。通過計算含量變化百分率，紫丁香苷在半夏用量為15 g時溶出變化屬誤差范圍，半夏的用量分別為3、10.5、18 g時顯著抑制厚樸活性成分的溶出，與此同時半夏用量為6、9 g時顯著增加厚樸活性成分溶出，在試驗條件下整體表現(xiàn)出 “抑制→促進→抑制”的趨勢。在半夏用量分別為3、15 g時，綠原酸的溶出變化屬誤差范圍，在2∶5～4∶3配伍比例范圍內半夏的使用均可增加其溶出；與此類似的是，除了半夏用量達到18 g時會顯著抑制厚樸酚溶出外，在半夏存在的其他劑量情況下，均顯著增加厚樸酚溶出，上述2種成分在試驗條件下，表現(xiàn)出半夏促進其溶出的大體趨勢。在半夏配伍用量≤12 g的各配伍比例下，木蘭花堿溶出變化均屬誤差范圍，而半夏其他配伍劑量均可顯著抑制木蘭花堿溶出；在配伍使用的全部劑量范圍內，半夏的存在都會對金絲桃苷的溶出表現(xiàn)較顯著抑制作用；除了在半夏用量為3、10.5 g時可輕微增加和厚樸酚溶出外，在半夏配伍使用的其他劑量下，和厚樸酚的溶出也均表現(xiàn)不同程度的抑制作用，上述3種成分在試驗條件下，表現(xiàn)出半夏抑制其溶出的整體趨勢。上述結果也可從含量變化百分率合計Ⅰ得到初步驗證。

2.6.5 未知成分峰面積及其變化百分率計算 將表1中0∶1配伍比例項下各未知成分平均峰面積代入公式(3)，為未知成分藥材峰面積理論值。按2.3項下供試品制備方法平行制備藥對不同配伍比例供試品各3份，按2.1項下色譜條件測定，記錄各未知成分峰面積再依公式(3)計算，為各未知成分藥材含量實測值。根據(jù)公式(4)計算各未知成分峰面積變化百分率，結果見表3。

表2 不同配伍比例藥對中厚樸活性成分含量及其變化百分率(n=3)

注：*含量低于線性范圍；#因含量低于線性范圍而無法計算其含量變化百分率；—未計算；變化百分率合計Ⅰ=∑9個不同比例組該物質變化百分率，變化百分率合計Ⅱ=∑該配伍比例項下所有被測物質變化百分率(下同)。

表3 不同配伍比例藥對中厚樸未知成分峰面積及其峰面積變化百分率(n=3) %

未知成分藥材峰面積=該未知成分峰面積/該配伍比例下厚樸藥材用量(g)

(3)

峰面積變化百分率=(藥材峰面積實測值-藥材峰面積理論值)/藥材峰面積理論值×100%

(4)

由表1、3可知，半夏-厚樸配伍比例1∶0不含本研究考察的未知成分。通過計算峰面積變化百分率，成分12在半夏加入的情況下整體表現(xiàn)出被抑制的趨勢；與此正好相反的是成分27，半夏的加入促進了厚樸活性成分的溶出，總體而言半夏的加入對上述2種未知成分的影響較大。成分1、成分3隨半夏的加入大體表現(xiàn)出“抑制→促進”的趨勢，但略有不同：成分1在半夏用量達到最大時(18 g)才促進溶出，成分3在半夏-厚樸配比4∶3峰面積變化百分率即開始由負變正，逐漸體現(xiàn)出促進溶出的作用。隨著半夏的加入，成分17和成分22的溶出大體表現(xiàn)出“促進→抑制→促進”的特點，但半夏對成分22的促進溶出作用弱于對成分17的作用，且隨著半夏用量的增加成分22的溶出又趨向于被抑制。半夏的加入對成分15的影響并未表現(xiàn)出較明顯的規(guī)律性。上述結果也可從峰面積變化百分率合計Ⅰ得到初步驗證。

3 討論

雖然直接將復方藥物配伍比例用于藥對配伍研究還有待商榷，但為了便于建立基準、開展分析，本研究還是以半夏厚樸湯中半夏-厚樸君臣配伍比例4∶3為基準，按等比遞增(減)設置了其他8個劑量組。同時，中藥(復方)發(fā)揮藥效是多種成分共同作用的結果，筆者認為以半夏-厚樸指紋圖譜開展相關研究比較有利，因此研究除了選擇指紋圖譜中屬于厚樸的6個有活性的對照品外，還依據(jù)《中華人民共和國藥典》指紋圖譜研究中的規(guī)定(任意單個雜質峰面積應不大于總峰面積的0.5%)，選擇屬于厚樸且單峰面積大于總峰面積0.5%、相對保留時間RSD<0.15%的7個未知成分峰進行綜合分析討論。

厚樸中含有多個厚樸酚結構類似化合物[9]，見圖4。從色譜圖及表2的含量變化百分率結果可以看出，和厚樸酚的含量在變化百分率Ⅰ總體呈減少趨勢，厚樸酚含量在變化百分率Ⅰ總體呈增加趨勢。但在隨后進行的半夏+厚樸酚對照品、半夏+和厚樸酚對照品的試驗中，并未得到“厚樸酚和厚樸酚”相互間變化的證據(jù)。

如果某比例項下總溶出量減少(即變化百分率合計Ⅱ減少)而個別成分溶出量卻增加，是否可以認為配伍后更有利于發(fā)揮溶出量增加成分的藥理活性/藥效？從表2結果來看，存在上述情況的配伍比例為1∶6、4∶3和5∶2。以4∶3為例，厚樸酚和綠原酸的溶出量同時增加；據(jù)藥理學研究表明，厚樸酚具有抗炎、抗抑郁、抗?jié)?、腦缺血再灌注損傷保護、抗腫瘤等作用[10-11]，綠原酸具有抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)、心血管保護、抗腫瘤及抗病毒等作用[12-13]，2個溶出量同時增加成分的藥理作用確有重合(抗炎、抗腫瘤等)。如后續(xù)的腫瘤動物實驗等能證實：厚樸酚+綠原酸的藥效活性≈半夏-厚樸藥對配伍4∶3的藥效活性>半夏-厚樸配伍其他比例的藥效活性，那么即可證明半夏-厚樸間配伍及二者4∶3的配伍比例存在合理性。

注：A.厚樸酚；B.和厚樸酚；C.4-甲氧基和厚樸酚；D.obovatol。圖4 厚樸中4個厚樸酚結構類似物

但藥對的方法多樣、研究角度也很多，是否可以從不同配伍比例有效成分溶出量的變化角度開展預測分析，后續(xù)需要MSn、核磁共振等分析手段進一步辨析，同時也還需要藥理、藥效學實驗加以證實。