移植肝缺血/再灌注損傷的保護措施

藍海斌，許蜂蜂，程遠，桑勇勇，王華翔，孔雨薇，楊芳，蔡秋程，劉建勇，江藝（.蚌埠醫(yī)學院教學醫(yī)院聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院肝膽外科，福建 福州5005；.廈門大學附屬東方醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 5005 ；.福建醫(yī)科大學教學醫(yī)院聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 5005；.聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 5005）

肝缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury,IRI）是指因肝臟失去血液供應，導致器官缺氧引起的一種病理生理過程，通常分為熱缺血損傷和冷缺血損傷。熱缺血損傷通常發(fā)生于供肝切除術(shù)中過長時間阻斷血流供應、休克、創(chuàng)傷及心衰等情況下肝血流量減少引起，冷缺血損傷發(fā)生于移植供肝冷保存［1-2］。供肝缺血時間、供肝手術(shù)時間過長及術(shù)后的全身炎癥反應會導致移植肝功能不全、原發(fā)性移植肝無功能、急性腎損傷、腸道損傷［3］和急性呼吸窘迫綜合征［4］等的發(fā)生，極大地增加了圍術(shù)期患者的發(fā)病率和病死率［5］。隨著肝移植技術(shù)的成熟，等待和完成肝移植手術(shù)的人數(shù)正逐年上升，但IRI仍舊威脅著移植患者的生命。因此，為解決IRI帶來的問題，在手術(shù)灌注方式上，人們進行了多樣的嘗試，存在先開放動脈、先開放門靜脈及先開下腔靜脈等多種術(shù)式。肝臟保存方式也有了巨大的變化，從傳統(tǒng)的靜態(tài)低溫灌注液保存法到低溫機械灌注法及亞常溫、常溫機械灌注法，以及研究抗氧化生物酶在IRI的應用。

1 IRI產(chǎn)生的機制

肝臟在機體停止供氧和葡萄糖后，細胞內(nèi)線粒體功能失調(diào)，隨著三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）不斷被消耗，離子泵受損，細胞內(nèi)外離子濃度梯度失衡，Na+、K+和Ca2+等離子的失衡造成細胞水腫和細胞內(nèi)各種生物酶異常激活，誘導細胞壞死和凋亡，釋放損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）分子，并產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species ，ROS)和激活補體系統(tǒng)［2，6］。肝臟恢復灌注后，肝損傷并沒有隨著氧供的恢復而減輕，反而損傷加重，再灌注后的6 h內(nèi)，庫普弗細胞發(fā)揮著重要的損傷作用［7］，產(chǎn)生的ROS激活庫普弗細胞，而庫普弗細胞又能釋放出更多的ROS（ROS能直接對細胞造成損傷），使得庫普弗細胞不斷地自我激活和自我破壞，造成嚴重的細胞損傷。此外庫普弗細胞還能產(chǎn)生多種細胞因子，例如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和白細胞介素-1（interleukin，IL-1），這些細胞因子能使血管內(nèi)皮細胞和肝細胞釋放ROS、并表達細胞表皮黏附分子，而且能誘導血小板、中性粒細胞聚集于肝血竇中，影響微循環(huán)血流，造成細胞損傷。此外活化的補體系統(tǒng)也能激活庫普弗細胞，并形成攻膜復合體直接破壞細胞。

再灌注后的6 ～ 48 h內(nèi)，招募的中性粒細胞、CD4+淋巴細胞釋放大量的ROS和蛋白酶造成進一步的機體損傷和炎癥反應，大量ROS的釋放能使大分子復合物氧化（例如細胞色素C和心磷脂），其中細胞色素C的釋放，能促進一系列酶聯(lián)反應［8］，造成全身各種器官損傷。研究發(fā)現(xiàn)在灌注后5 min后便可檢測到氧自由基O2-的釋放， ROS的釋放在2 ～ 6 h達到高峰［9］。此外，有動物實驗表明，抗氧化治療對肝IRI是有效的措施，可見ROS在IRI的發(fā)生中起重要的調(diào)節(jié)作用，如何減少或者阻斷ROS的釋放極為關(guān)鍵［10］。

2 關(guān)于供肝再灌注方式的探索

1963年Starzl等［11］開創(chuàng)了肝移植的先例，動脈氧飽和度較門靜脈高，在肝移植術(shù)中采取率先開放動脈的方式，另外一種灌注方式是先開放門靜脈血流，門靜脈氧飽和度雖然較低，但是門靜脈入肝血流占到70%以上，故其提供的氧氣量和動脈相當。2001年Sadler等［12］回顧性研究比較經(jīng)肝動脈和門靜脈先后開放再灌注兩者之間的區(qū)別，分別比較兩者26例患者術(shù)后丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）等指標，發(fā)現(xiàn)兩者在近期或者遠期肝功能指標的對比上并沒有明顯差異，但經(jīng)肝動脈灌注的患者生存時間較短。2003年Kniepeiss等［13］首次報道原位肝移植術(shù)中采取下腔靜脈逆灌注的方式可以改善早期移植肝功能，減少原發(fā)性移植肝無功能及再灌注綜合征的發(fā)生率。Matevossian等［14］通過大鼠實驗模擬人體肝移植全過程，發(fā)現(xiàn)同種異體肝移植通過下腔靜脈逆行灌注的方式能降低早期肝酶水平，有利于術(shù)后肝功能的恢復。同樣的國內(nèi)學者呂立志等［15］通過臨床正、逆灌注隨機研究分析證明逆灌注有助于改善肝移植IRI的發(fā)生，減少對肝細胞的損害及改善術(shù)后早期肝功能的恢復。國外學者Kern等［16］模擬大鼠原位肝移植模型，對比經(jīng)下腔靜脈逆行灌注法和常規(guī)門靜脈正向灌注法，得出大鼠原位肝移植逆灌注法能減輕肝移植IRI。但有關(guān)逆灌注對移植肝IRI具體的保護機制鮮有報道，還需要進一步的研究及證實。

3 關(guān)于供肝保存方式的探索

傳統(tǒng)的靜態(tài)低溫保存供肝（通常是0 ～ 4℃）方式，一直沿用至今，能夠在一定程度上降低ATP的消耗（大約是12倍左右），但是無法阻止這一進程的發(fā)展，仍會引起細胞凋亡或者壞死，這一時間通常是24 h以內(nèi)，而且低溫對細胞膜脂質(zhì)、細胞骨架和線粒體具有直接的損害作用［17］。為了改善這一情況，國內(nèi)外學者在供肝的保存上做出許多研究［18-24］。低溫（1 ～ 18℃）機械灌注（當時的灌注液為全血）用于器官保存最早是在20世紀60年代，Belzer等［18］用于腎臟的保存，到了1967年，他們將這項技術(shù)提高到了另一個高度，增加氧供于其中，使得當時腎臟的保存能達到72 h。由于當時的技術(shù)限定，灌注機械設備過大造成運輸困難以及臨床使用的不便限制了該技術(shù)的發(fā)展，在當時有研究表明，采用低溫機械灌注保存同靜態(tài)低溫保存相比沒有表現(xiàn)出優(yōu)點［19］。強有力的免疫抑制劑的問世以及器官保存液的改進，使得靜態(tài)低溫器官保存法一直沿用至今。肝臟資源的匱乏，迫使人們將邊緣性供肝（例如年齡過大、脂肪化較嚴重等）納入肝移植擴大供肝標準（extended criteria donors ，ECD）之中，這些肝臟在低溫下更容易受到損傷，IRI帶來的危害更大，更加容易造成移植后肝功能不全甚至移植肝無功能。為了使肝臟在保存過程中盡可能地減少損傷和提高邊緣供肝的利用率及受體的存活率，Yuan等［20］將低溫機械灌注（目前主要應用的灌注液為威斯康星大學保存液和組氨酸 -色氨酸 - 酮戊二酸鹽液）應用于移植供肝保存之中，使用經(jīng)過改良后低溫機械灌注保存能降低細胞新陳代謝和緩解ATP消耗的速度，循環(huán)的液體能給細胞帶來新的養(yǎng)分、氧氣和帶走低溫保存下的代謝毒性產(chǎn)物，而且能隨時檢測細胞的活力。此外低溫機械灌注不僅能實時通過肝臟的流量和壓力側(cè)面反映肝臟的質(zhì)量，并能及時對此進行藥物及基因治療，而且機械灌注模擬血管在人體內(nèi)的搏動方式和頻率，能很好地維持血管的功能、預防再灌注后血管痙攣的發(fā)生以及維持微循環(huán)的通暢。這些優(yōu)點對于提高邊緣供肝的肝功能恢復和患者的存活率都是極有好處的。

從低溫到常溫，溫度的劇烈變化，容易使肝臟再次受到損傷。Bruinsma等［21］采用亞常溫機械灌注（一般為20 ～ 30℃），對低溫保存下的肝臟進行液體復溫，體外實驗結(jié)果顯示亞常溫機械灌注有助于肝臟細胞功能的改善：氧氣的攝取、膽汁的產(chǎn)生和組織ATP含量都有明顯的提高。此外，Bea等［22］采用體外常溫肝臟機械灌注（normothermic ex vivo liver perfusion ，NEVLP） （37℃）裝置，更好地模擬了細胞所處內(nèi)環(huán)境的狀態(tài)，從而不影響肝臟的新陳代謝，極大地降低IRI給人體帶來的危害，減少人體發(fā)生肝功能不全、移植肝臟無功能和其他器官的損傷等問題的發(fā)生［23］。同樣在2015年，研究人員成功利用體外常溫灌注肝臟技術(shù)完成10例肝移植手術(shù)，術(shù)后同傳統(tǒng)的低溫保存肝移植相比較，ALT和AST均有所下降，術(shù)后個體主要的并發(fā)癥的發(fā)生率也有所下降［24］。常溫機械灌注能在一定程度上減輕缺血/再灌注引起的損傷，但是由于其裝置較為巨大，搬運不方便，缺乏大量的臨床數(shù)據(jù)支持，目前難以廣泛地應用于臨床實踐之中。

4 關(guān)于抗氧化生物酶減輕氧化應激損傷的探索

ROS是一類來源于O2的化學反應分子，主要代表有O2-、H2O2和 OH-［25］，ROS 在 IRI的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，通過體內(nèi)抗氧化生物酶（過氧化物歧化酶、過氧化氫酶和乙醛脫氫酶）能有效地清除ROS，可能對IRI起著保護作用［9，26-27］。

4.1 過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）：SOD和CAT能有效地清除機體產(chǎn)生的ROS。其中SOD分為銅/鋅-SOD（copper/zinc SOD ，Cu/Zn-SOD）、錳 -SOD（manganese-SOD，Mn-SOD）和細胞外-SOD（extracellular-SOD ，EC-SOD）；其中 Cu/Zn-SOD位于細胞質(zhì)和細胞核中，在細胞內(nèi)其抗氧化作用，Mn-SOD只存在于線粒體中，而ROS起源于此，因此Mn-SOD是對抗氧化應激相對重要的一種酶［28］，而EC-SOD存在于細胞外發(fā)揮其抗氧化作用，促進O2-轉(zhuǎn)化為 O2或 H2O2，H2O2在 CAT 的作用下轉(zhuǎn)化為H2O和O2［9］，O2-不能透過細胞膜進入細胞內(nèi)，只能被EC-SOD所清除。通過增加SOD或SOD類似物來提高SOD活性的方式可以有效地預防各種類型的肝損傷。研究人員檢測急性和慢性肝炎時發(fā)現(xiàn)［27］，急性期時體內(nèi)SOD有明顯的上升，到了慢性期SOD水平明顯被抑制，這說明SOD在急性肝炎的發(fā)病中也起到一定的作用，但是SOD的半衰期只有6 min［9］，無法持續(xù)地發(fā)揮清除ROS的作用。通過基因治療來提高在捐獻者體內(nèi)SOD表達水平和持續(xù)時間從而提高SOD含量和作用時間，能有效對抗肝臟缺血/再灌注引起的損傷。傳統(tǒng)的基因?qū)敕绞酱蠖嗖捎靡韵俨《緸檩d體的方式，將Cu/Zn-SOD基因以腺病毒為載體的方式導入人體之中能有效地保護肝IRI，但將ECSOD導入后，SOD水平只有輕微的升高， SOD活性并沒有顯著的增加，因腺病毒對人體具有直接損傷作用，不可能通過增加腺病毒量來提高SOD的水平。He等［9］將EC-SOD和（或）CAT基因與納米粒子載體融合，解決了腺病毒載體的缺陷，導入于小鼠之中，發(fā)現(xiàn)SOD 活性有明顯的提高，SOD的過表達使得血清中的ALT水平有了明顯的下降，這一作用比單獨導入EC-SOD或CAT基因都要明顯，間接反映了兩者之間存在協(xié)同作用，也揭示了對肝IRI起到保護作用。

4.2 乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH)：再灌注后，釋放的大量ROS，導致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量的活性醛，例如丙二醛，能夠和相關(guān)的蛋白或者DNA結(jié)合，造成肝細胞的破壞，加重肝IRI［29］。ALDH是一類存在人體中能夠清除活性醛的酶，其中同工酶ALDH2在清除毒性醛中起主要作用，此外還能解離氧化應激中產(chǎn)生的醛加合物。ALDH2的保護作用最先發(fā)現(xiàn)于小鼠心肌細胞IRI［30］，通過使用ALDH2的激活劑Alda-1，能使心肌梗死的面積減少60%左右。ALDH2在各種器官缺血損傷中也有保護作用，例如腦、腎、肺［29］。Zhang等［29］，將ALDH2激活劑應用于肝移植之中，發(fā)現(xiàn)激活的ALDH2不僅起保護肝細胞的結(jié)構(gòu)，而且能有效地減少肝細胞凋亡，進一步發(fā)現(xiàn)ALDH2還能減少活性醛的聚集和減輕炎癥反應，對移植肝起一定的保護作用。此外有研究發(fā)現(xiàn)，選擇性激活ALDH2使線粒體復合物Ⅰ功能改變和逆電子傳遞，使線粒體膜電位恢復，減緩ROS的產(chǎn)生，從而起到保護肝臟 IRI的作用［29，31］。

5 “無缺血”器官移植時代的展望

為徹底解決供肝IRI，何曉順等［32］創(chuàng)新地將常溫機械灌注供肝技術(shù)同肝移植術(shù)融合，完成3例“無缺血”肝移植術(shù)，術(shù)后患者恢復情況良好，全程供肝病理未見明顯肝細胞壞死及凋亡，術(shù)后1周肝酶學指標恢復正常水平，近期術(shù)后暫無膽道、血管及排斥反應等并發(fā)癥的發(fā)生。但目前樣本含量少，遠期術(shù)后效果仍不得而知，有待進一步觀察和研究。這一革命性的突破，意味著IRI并不是完全無法避免的，為未來的移植道路指明方向，為更多需要肝移植的患者帶來福音。

6 小 結(jié)

改善再灌注手術(shù)方式、加強機械灌注保存供肝方法及抗氧化生物酶的應用研究，有可能進一步緩解移植肝IRI，有助于肝功能恢復。“無缺血”器官移植時代將值得我們期待。