黃芪多糖通過Traf6/TAK1 信號通路調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)

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黃芪多糖（Astragalus polysaccharide，AP）是來源于黃芪的一種活性物質(zhì)，并且表現(xiàn)出廣泛的藥理活性，包括抗氧化應(yīng)激、參與免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血糖水平及抗炎等方面[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能夠抑制過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC-5）凋亡，對RGC-5 細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[3]。然而對體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否具有抗炎保護(hù)作用不明確。青光眼的發(fā)病原因較為復(fù)雜，由多因素引起的一類退行性、致盲性視神經(jīng)病變[4]。臨床主要表現(xiàn)為視神經(jīng)萎縮、視野損傷、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡等[5]，在導(dǎo)致視力喪失的眼病中位居第2位[6]，嚴(yán)重影響著患者的正常生活和健康。視神經(jīng)的損傷會進(jìn)一步導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）內(nèi)發(fā)生炎性損傷，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞原發(fā)或繼發(fā)死亡。因此，本文采用體外培養(yǎng)RGCs 細(xì)胞構(gòu)建炎性細(xì)胞模型，探討黃芪多糖對脂多糖誘導(dǎo)的RGC-5 細(xì)胞炎性反應(yīng)的保護(hù)作用，并初步研究其可能作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC-5，武漢巴菲爾生物有限公司）；黃芪多糖（陜西中鑫生物有限公司，批號：1203011）；DMEM 培養(yǎng)基（上海谷歌生物有限公司）、胰蛋白酶（美國Sigma 公司）；CCK-8 試劑盒購自默沙克生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海谷歌生物有限公司，批號P0012S-07）；IL-6、TNF-α 檢測試劑盒購自上海華美生物有限公司；一抗稀釋液（上海吉諾公司，批號：C154855）；ECL 顯 色 液（Sigma 公 司）；β-actin、Traf6、TAK1 及p-TAK1 一抗（均購自美國Cell Signaling Technology）；二抗羊抗兔IgG 購自美國LI-COR Biosciences。單人超凈工作臺（北京六一儀器廠）；CB15C02 型細(xì)胞培養(yǎng)箱（北京六一儀器廠）；Victor3 1420 Multilable Counter 酶標(biāo)儀（美國BD，F(xiàn)ACS AriaIII）；HD-3000凝膠成像儀（上海上天精密儀器有限公司）；7230G數(shù)顯可見紫外分光光度計測定儀（上海菁華）。

1.2 RGC-5 細(xì)胞培養(yǎng)

采用DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)RGC-5 細(xì)胞，置于37℃、5% CO2的恒濕培養(yǎng)箱，待細(xì)胞貼壁生長至90%左右，便棄去舊培養(yǎng)基，用無菌PBS 清洗細(xì)胞2 次，加入胰酶進(jìn)行消化，待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化，離心、重懸后以1:3 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化、離心、重懸、調(diào)整密度，以1×104個/孔細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板中持續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去每孔中的培養(yǎng)基，加入含不同濃度黃芪多糖（0.25、0.5、1.0 mg·mL-1）和LPS（1.0 μg·mL-1）共同干預(yù)處理24 h 后，吸干板內(nèi)培養(yǎng)基，然后每孔加入含10 μL CCK8 試劑的無血清培養(yǎng)再繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀于450 nm 波長處檢測每孔的吸光度值。

1.4 檢測炎性因子IL-6、TNF-α 水平

取對數(shù)生長期的RGC-5 細(xì)胞，清洗、消化、重懸細(xì)胞后，以5×105個/孔接種于6 孔板中，每組實驗設(shè)置6 個復(fù)孔，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入含不同濃度黃芪多糖（0.25、0.5、1.0 mg·mL-1）和LPS（1.0 μg·mL-1）共同干預(yù)處理24 h 后，收集細(xì)胞上清及細(xì)胞。ELISA 試劑盒用于上清炎性因子IL-6、TNF-α 水平檢測，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5 Traf6、TAK1 和p-TAK1 蛋白表達(dá)

將收集的細(xì)胞裂解，測定蛋白濃度后，裂解液中加入上樣緩沖液，100℃加熱煮沸10 min。電泳時，每孔上樣蛋白量為40 μg，在12%的SDS-PAGE 凝膠中電泳分離，濃縮膠電泳分離時電壓設(shè)置為70 V，分離膠電泳時電壓設(shè)置為120 V；分離完成后在275 mA電流轉(zhuǎn)膜60 min；再將NC 膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗孵育過夜后，再二抗常溫下孵育1 h，洗膜3 次，顯色成像。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩兩組間比較采用方差分析中LSD-t 檢驗。當(dāng)P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AP 對RGC-5 細(xì)胞相對存活率的影響

LPS 能明顯抑制RGC-5 細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)在LPS 誘導(dǎo)組細(xì)胞相對存活率（48.7±3.92）%相對于空白對照組而言顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.437，P＜0.05）；經(jīng)過低、中、高劑量黃芪多糖干預(yù)RGC-5細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)在不同劑量黃芪多糖組中細(xì)胞相對存活率[低劑量（61.4±3.09）%、中劑量（72.4±2.96）%、高劑量（82.6±3.07）%]均顯著高于LPS 誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t低=9.042，P＜0.05；t中=12.046，P＜0.05；t高=4.327，P＜0.05），并且隨著藥物濃度升高細(xì)胞相對存活率也隨之增高，表現(xiàn)出濃度依賴性。

圖1 RGC-5 細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下圖像

圖2 AP 對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相對存活率的影響

2.2 AP 對RGC-5 細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α 水平的影響

LPS 能誘導(dǎo)RGC-5 細(xì)胞IL-6、TNF-α 的釋放，表現(xiàn)在LPS 誘導(dǎo)組中細(xì)胞上清IL-6、TNF-α 水平相對于空白對照組而言顯著升高，比較有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.209，P＜0.05）；經(jīng)過低、中、高劑量黃芪多糖干預(yù)RGC-5 細(xì)胞后，細(xì)胞炎性因子水平明顯降低，表現(xiàn)在不同劑量黃芪多糖組中細(xì)胞上清IL-6、TNF-α水平均顯著低于LPS 誘導(dǎo)組，比較有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.307，P＜0.05），并且隨著藥物濃度升高細(xì)胞上清中IL-6、TNF-α 水平也隨之降低，表現(xiàn)出濃度依賴性。

表1 AP 對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞炎癥因子水平的影響

2.3 AP 對RGC-5 細(xì)胞Traf6/TAK1 信號通路的影響

LPS 誘導(dǎo)組細(xì)胞中Traf6、p-TAK1 水平相比空白對照組升高，比較有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.183，P＜0.05）；經(jīng)過低、中、高劑量AP 干預(yù)RGC-5 細(xì)胞后，Traf6、p-TAK1 水平均低于LPS 誘導(dǎo)組，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.603，P＜0.05），并且隨著藥物濃度升高細(xì)胞Traf6、p-TAK1 水平也隨之降低，表現(xiàn)出濃度依賴性。

圖3 AP 對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Traf6/TAK1 信號通路的影響。3A Traf6 和p-TAK1 蛋白條帶；3B 對Traf6 表達(dá)水平影響；3C 對p-TAK1 達(dá)水平影響。LPS：脂多糖，Traf6：腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6，TAK1：轉(zhuǎn)化生長因子激酶1

3 討論

視網(wǎng)膜是重要的光感受器官，可以感知視覺信號進(jìn)一步進(jìn)行處理，然而一旦出現(xiàn)損傷就會引起視覺障礙或者失明。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）為視網(wǎng)膜信號輸出的細(xì)胞，以動作電位形式把經(jīng)視網(wǎng)膜神經(jīng)回路加工、處理、傳遞至視覺中樞，進(jìn)一步產(chǎn)生正常視覺[7-8]。在多種刺激環(huán)境下，會引起視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，激活NF-κB 信號通路，并啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)炎性因子（IL-6、TNF-α）和黏附分子相互作用，進(jìn)一步造成視網(wǎng)膜毛細(xì)血管阻塞無灌注、內(nèi)皮損傷、新生血管形成等多個病理過程[9-10]。因此，抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)可以很好的保護(hù)眼部免受損傷。

中醫(yī)藥治療青光眼有確切的治療效果[11-12]。黃芪在臨床上主要用于補(bǔ)氣，主要應(yīng)用于糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病腎病。黃芪多糖是黃芪中主要的活性物質(zhì)，對心肌細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，還表現(xiàn)出清除自由基、調(diào)節(jié)免疫、改善微循環(huán)以及清除炎性因子等多方面的藥理活性[1-2]。并且研究還發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對周圍神經(jīng)損傷的功能恢復(fù)具有促進(jìn)作用，早期治療的效果更顯著[13]。本研究先通過CCK8 實驗觀察不同濃度黃芪多糖對RGC-5 細(xì)胞藥物毒性的作用，發(fā)現(xiàn)0.1～2.0 mg·mL-1的黃芪多糖對RGC-5 細(xì)胞的增殖活性沒有明顯影響，并且細(xì)胞形態(tài)也沒有發(fā)生明顯變化。因此，實驗采用0.25、0.5、1.0 mg·mL-1的黃芪多糖處理RGC-5 細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實驗。研究采用了LPS 體外誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞炎性模型，觀察黃芪多糖對RGC-5 細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能明顯增高RGC-5 細(xì)胞的相對存活率，并且不同劑量黃芪多糖能明顯抑制炎性因子IL-6、TNF-α 的產(chǎn)生，且表現(xiàn)出濃度依賴性。

腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6（Traf6）屬于一種銜接蛋白，可傳導(dǎo)膜上多種受體介導(dǎo)的信號，其中就包括Toll/IL 受體家族介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。LPS 刺激可引起Traf6 的泛素化，接著與轉(zhuǎn)化生長因子β 活化激酶1（TAK1）作用形成復(fù)合物，進(jìn)一步激活I(lǐng)KB激酶家族(IKB kinases,IKKs)，促使了NF-κB 向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，包括炎癥因子IL-6 和TNF-α 水平的升高[14]。對Traf6/TAK1 信號通路進(jìn)行抑制可以降低炎癥因子的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞的炎性損傷。Traf6 在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷過程呈表達(dá)升高的趨勢，可能與青光眼的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[15]。本文研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能明顯抑制Traf6 和p-TAK1表達(dá)，降低了Traf6/TAK1 信號通路的活化，進(jìn)一步降低炎癥反應(yīng)。綜上所述，黃芪多糖可以抑制Traf6/TAK1 信號通路的活化，降低炎性因子IL-6 和TNF-α 的產(chǎn)生，起到抗炎的作用。