PKCα/CaV1.2在有氧運(yùn)動(dòng)改善高血壓腸系膜動(dòng)脈功能中的作用

單美玲，陳 渝，張嚴(yán)焱，周 楊，吳 迎,2，李 麗，石麗君,2*

（1.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生理教研室，北京 100084；2.北京體育大學(xué) 運(yùn)動(dòng)與體質(zhì)健康教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084）

高血壓是多種心、腦血管疾病的重要病因和危險(xiǎn)因素，迄今為止，仍是心血管疾病導(dǎo)致死亡的主要原因之一（NHBPEP，2003）。高血壓往往伴隨著小動(dòng)脈和微動(dòng)脈血管張力的不斷增加、血管舒張功能紊亂及血管收縮特性的改變等（Brozovich et al.，2016）。在血管張力調(diào)節(jié)方面，除機(jī)體的神經(jīng)-體液途徑外，血管平滑肌也可通過其膜上的相關(guān)離子通道活動(dòng)對(duì)血管收縮進(jìn)行調(diào)控，從而參與調(diào)節(jié)血管張力（張嚴(yán)焱等，2018）。研究表明，當(dāng)血管長(zhǎng)期處于高血壓狀態(tài)時(shí)，血管平滑肌上的離子通道會(huì)發(fā)生功能重構(gòu)，從而影響血管張力（Harder et al.，1983），其中，鈣離子通道在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）內(nèi)鈣水平、細(xì)胞收縮和舒張以及血管張力中都起到了重要作用（Joseph et al.，2013）。

L型電壓門控鈣離子通道（voltage-gated L-type Ca2+channel，CaV1.2）是VSMC膜外鈣離子內(nèi)流的主要通道，是血管平滑肌收縮的主要機(jī)制，其對(duì)血管平滑肌功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。除Ca2+依賴性的肌球蛋白輕鏈磷酸化外，血管平滑肌功能還主要受蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）調(diào)控（Pourmahram et al.，2008）。血管平滑肌中PKC過表達(dá)或是活性增加，可導(dǎo)致血管收縮功能紊亂，使得微血管阻力不斷增加，最終導(dǎo)致高血壓（Khalil et al.，2013；Lacerda et al.，1988）。研究表明，PKC的磷酸化可參與控制細(xì)胞內(nèi)鈣的流入和排出，PKC可增強(qiáng)各種平滑肌細(xì)胞中的CaV1.2電流，如肺動(dòng)脈、腦動(dòng)脈等（Perzvizcaino et al.，2010）。但也有研究報(bào)道，PKC對(duì)CaV1.2通道的功能具有雙重調(diào)節(jié)作用，這種雙重調(diào)節(jié)作用可能與PKC在不同組織中表達(dá)的亞型不同有關(guān)（Sharon et al.，2015）。PKCα（protein kinase Cα，PKCα）為Ca2+依賴性的經(jīng)典型PKC亞型，廣泛表達(dá)于血管平滑肌中。高血壓時(shí)，血管平滑肌中PKCα表達(dá)增多。PKCα可通過肌球蛋白輕鏈磷酸化、Ca2+通道激活或K+通道抑制等參與血管平滑肌收縮（Ringvold et al.，2016）。在離體肺動(dòng)脈的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的PKC活化可激活血管平滑肌上的CaV1.2通道，同時(shí)H2O2誘導(dǎo)的Ca2+敏感性和血管收縮增強(qiáng)等主要與PKCα亞基有關(guān)，而這些反應(yīng)均可被PKCα抑制劑所抑制（Park et al.，2006）。綜上所述，PKCα與CaV1.2通道功能可能存在一定的調(diào)控關(guān)系。

前期研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）血壓，改善血管功能，這可能與膜上的離子通道有關(guān)（張嚴(yán)焱等，2018）。血管平滑肌CaV1.2通道功能上調(diào)是高血壓的一個(gè)標(biāo)志性特征，而有氧運(yùn)動(dòng)可有效改善高血壓誘發(fā)的CaV1.2通道功能上調(diào)（陳渝 等，2015；魯妮 等，2015）。但有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)CaV1.2通道功能的潛在機(jī)制尚不完全清楚，PKC對(duì)高血壓大鼠VSMC的CaV1.2通道功能作用及其具體發(fā)揮作用的亞型尚不明確，有氧運(yùn)動(dòng)能否通過PKCα/CaV1.2信號(hào)通路調(diào)節(jié)SHR腸系膜動(dòng)脈功能，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

因此，本研究旨在探究PKCα與CaV1.2通道之間的關(guān)系；觀察原發(fā)性高血壓時(shí)，腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的PKCα、CaV1.2通道α1C亞基表達(dá)、分布及二者共定位情況，PKCα/CaV1.2在血管張力調(diào)節(jié)中的作用，從而進(jìn)一步探究PKCα/CaV1.2信號(hào)通路在有氧運(yùn)動(dòng)改善高血壓腸系膜平滑肌功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與運(yùn)動(dòng)方案

SHR和正常血壓大鼠對(duì)照組（Wistar Kyoto，WKY）各24只（12周齡，雄性），隨機(jī)分為有氧運(yùn)動(dòng)組（SHR-EX、WKY-EX）和安靜對(duì)照組（SHR-SED、WKY-SED），每組各12只。大鼠分籠飼養(yǎng)，用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲食，控制飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22℃～24℃）、相對(duì)濕度（40%～60%）和光照（12 h晝，12 h夜）。有氧運(yùn)動(dòng)組先進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1周，隨后進(jìn)行12周中等強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn).動(dòng)。運(yùn)動(dòng)方案：坡度為0，20 m/min（相當(dāng)于55%～65%VO2max），60 min/天，5 天/周，每周測(cè)定各組大鼠體重（BW），尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試儀（BP-2010A，Softron Biotechnology）監(jiān)測(cè)安靜時(shí)收縮壓（SBP）、心率（HR）。

1.2 離體微血管環(huán)制備和張力測(cè)定

腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）將大鼠麻醉后，迅速打開腹腔，取3級(jí)腸系膜動(dòng)脈，在Na-HEPES溶液中將血管周圍的脂肪組織仔細(xì)剝離干凈，隨后將血管剪成4個(gè)5 mm左右的小段，并將其固定于微血管張力測(cè)定儀（Multiwire myograph system-620M，DMT，Denmark）的4個(gè)浴槽中等待進(jìn)行血管收縮特性的測(cè)定。在整個(gè)剝離和固定過程中避免對(duì)血管的過度牽拉。在預(yù)先孵育20 min非選擇性NOS抑制劑Nω-硝基L-精氨酸甲酯（L-NAME，100 μmol/L）的基礎(chǔ)上，測(cè)定各組腸系膜動(dòng)脈對(duì)BayK8644（CaV1.2通道激動(dòng)劑）、Nifedipine（CaV1.2通道抑制劑）、PDBu（PKC激動(dòng)劑）、G?6976（PKCα抑制劑）的張力反應(yīng)。

1.3 急性分離腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

采用急性酶分離方法獲取VSMC。取2級(jí)以下腸系膜動(dòng)脈，于分離液中將動(dòng)脈周圍的脂肪組織剝離干凈，并將其剪至1～2 mm左右的均勻小段。分離液組成成分（mmol/L）：137 NaCl、5.6 KCl、1 MgCl2、10 HEPES、10 Glucose、0.42 Na2HPO4、0.44 NaH2PO4、4.2 NaHCO3，用 NaOH將pH值調(diào)至7.3。待血管段靜置3～5 min后，將其在酶消化液中消化28～30 min，隨后在室溫下用分離液清洗3次以終止消化，每次靜置3～5 min。消化液組成成分（mg/ml）：2牛血清白蛋白（BSA）、4木瓜蛋白酶（Papain）、1二硫蘇糖醇（DTT）。最后用膠頭滴管吹打血管段20～25次，并用濾網(wǎng)將懸液中的VSMC過濾至實(shí)驗(yàn)用浴槽中，于4℃冰箱中貼壁待用。整個(gè)消化過程均在37℃恒溫水浴箱中完成。

1.4 全細(xì)胞電流記錄

采用全細(xì)胞電壓鉗模式記錄CaV1.2通道電流。實(shí)驗(yàn)前，將裝有VSMC的浴槽內(nèi)的分離液換成細(xì)胞外液。細(xì)胞外液組成成分（mmol/L）：20 BaCl2、10 HEPES、5 Glucose、1 MgCl2、124 choline chloride，用 CsOH 將pH值調(diào)至7.4。電極內(nèi)液組成成分（mmol/L）：130 CsCl、10 HEPES、3 Na2ATP、0.1 Na2GTP、1.5 MgCl2、10 Glucose、10 EGTA、0.5 MgATP，用CsOH將pH值調(diào)至7.3。電極電阻為5～6 MΩ，串聯(lián)電阻在10 MΩ以下。血管平滑肌細(xì)胞置于-40 mV鉗制電壓，檢測(cè)電壓為-30～＋40 mV，階躍電位為10 mV，持續(xù)時(shí)間為250 ms。所測(cè)的電流信號(hào)經(jīng)Axon 700B放大器放大。觀察比較CaV1.2通道基礎(chǔ)電流以及加入G?6976后，各組腸系膜動(dòng)脈VSMC的CaV1.2通道電流變化。

1.5 免疫熒光

腸系膜動(dòng)脈急性分離VSMC，室溫貼壁30 min后，4%多聚甲醛固定30 min，隨后用PBS溶液清洗3遍，用0.2%Triton X-100穿孔10 min，再用10%山羊血清封閉60 min，分別加入一抗Polyclonal Anti-CaV1.2（濃度為1：200）、Anti-PKCα（濃度為1：200）。隨后將細(xì)胞置于4℃冰箱中過夜，第2天在避光條件下加二抗Goat Anti-Rabbit IgG Antibody（濃度為1：1 000），并在室溫下孵育60 min，隨后采用Prolong Gold Antifade Mount ant抗淬滅封片劑進(jìn)行封片，于室溫、干燥條件下保存24 h后，采用激光共聚焦系統(tǒng)（SP8 TCS，Leica，Germany）采集 PKCα、CaV1.2α1C 信號(hào)。免疫熒光數(shù)據(jù)采用LAS X軟件進(jìn)行共定位分析，得到共定位系數(shù)（colocalization rate），采用ImageJ軟件分離出共定位區(qū)域。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SEM）表示，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行雙因素方差分析（two-way ANOVA，高血壓×運(yùn)動(dòng)）。P＜0.05，表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓大鼠體重、血壓、心率的影響

運(yùn)動(dòng)前各組大鼠體重、血壓和心率測(cè)定結(jié)果顯示（表1），WKY-EX與SHR-EX在體重、收縮壓和心率上與其各自安靜對(duì)照組相比，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），SHR-SED組體重顯著低于WKY-SED組（P＜0.05）；而SHR-SED組收縮壓、心率均顯著高于WKY-SED組（P＜0.05）。12周有氧運(yùn)動(dòng)后，在體重方面，與其各自的安靜對(duì)照組相比，WKY-EX、SHR-EX組均顯著降低（P＜0.05），SHR-SED組體重仍顯著低于WKY-SED組（P＜0.05）。血壓方面，SHR-SED組收縮壓顯著高于WKY-SED組（P＜0.05），而與WKY-SED組相比，WKY-EX組收縮壓顯著降低（P＜0.05）；與SHR-SED組相比，SHR-EX組收縮壓也顯著降低（P＜0.05）。心率方面，SHR-SED組心率顯著高于WKYSED組（P＜0.05），而與SHR-SED組相比，SHR-EX組心率顯著降低（P＜0.05），WKY-EX與WKY-SED組間無(wú)顯著性差異。提示，有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低高血壓大鼠的血壓、心率和體重。

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR腸系膜動(dòng)脈收縮特性的影響

用60 mmol/L KCL誘導(dǎo)血管呈最大收縮即Kmax（圖1A）。其他藥物引起的收縮或舒張程度均與Kmax相比，并表示為%Kmax。如圖1B所示，KCL誘導(dǎo)的各組腸系膜動(dòng)脈的最大收縮幅度均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)WKY和SHR體重、血壓、心率的影響Table 1 Effects of Aerobic Exercise on Body Weight，Blood Pressure and Heart Rate in WKY and SHR

圖1 KCL誘導(dǎo)的各組腸系膜動(dòng)脈的張力反應(yīng)Figure 1.Tension Response of Mesenteric Arteries Induced by KCL

2.2.1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)BayK8644誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)的影響

由于CaV1.2通道在血管張力調(diào)節(jié)中的重要作用，我們首先采用離體微血管環(huán)張力測(cè)定CaV1.2通道在腸系膜動(dòng)脈張力調(diào)節(jié)中的作用。預(yù)先孵育20 min L-NAME（100 μmol/L）以破壞內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的作用，隨后加入CaV1.2通道激動(dòng)劑BayK8644（10-5M），觀察各組腸系膜動(dòng)脈的收縮反應(yīng)（圖2A）。結(jié)果如圖2B所示，BayK8644可誘發(fā)各組腸系膜動(dòng)脈收縮。與WKY-SED組（25.6±5.6%Kmax）相比，SHR-SED 組（63.7±11.0%Kmax）腸系膜 動(dòng)脈對(duì)BayK8644的收縮反應(yīng)顯著增高（P＜0.05）。與SHR-SED組相比，SHR-EX組（46.2±8.6%Kmax）腸系膜動(dòng)脈收縮反應(yīng)明顯降低（P＜0.05）；同時(shí)，12周有氧運(yùn)動(dòng)后，WKY-EX組（38.2±6.6%Kmax）血管對(duì) BayK8644的收縮反應(yīng)較WKY-SED組顯著增高（P＜0.05），各組n=6。結(jié)果提示，高血壓可增強(qiáng)腸系膜動(dòng)脈對(duì)BayK8644的收縮反應(yīng)（P＜0.05），而有氧運(yùn)動(dòng)可有效減弱SHR-EX對(duì)BayK8644的收縮反應(yīng)（P＜0.05）。同時(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)還增強(qiáng)了WKY對(duì)BayK8644的收縮反應(yīng)（P＜0.05）。

圖2 BayK8644誘導(dǎo)的各組腸系膜動(dòng)脈的張力反應(yīng)Figure 2.Tension Response of Mesenteric Arteries Induced by BayK8644

2.2.2 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)Nifedipine誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈舒張反應(yīng)的影響

去甲腎上腺素（NE）可誘發(fā)各組血管收縮，在NE誘發(fā)的最大收縮張力中，SHR-SED組顯著高于WKY-SED組（P＜0.05），而SHR-EX組與SHR-SED組相比顯著減?。≒＜0.05）。CaV1.2通道特異性抑制劑Nifedipine可誘發(fā)各組腸系膜動(dòng)脈呈濃度依賴性舒張。如圖3A所示，NE誘發(fā)的收縮出現(xiàn)平臺(tái)期后，遞增濃度的Nifedipine（10-8～10-5M）可誘發(fā)血管舒張。在Nifedipine誘導(dǎo)的各組血管最大舒張反應(yīng)中，SHR-SED組顯著高于WKY-SED（P＜0.05），而與SHR-SED組相比，SHR-EX對(duì)Nifedipine的舒張反應(yīng)顯著降低（P＜0.05）。如圖3B所示，在各組腸系膜動(dòng)脈對(duì)Nifedipine的敏感性中，SHR-SED組（pIC50：6.78±0.15）顯 著 高 于 WKY-SED 組（pIC50：5.84±0.26）（P＜0.05），與 SHR-SED 組相比，SHR-EX 組（pIC50：6.38±0.22）對(duì)Nifedipine的藥物敏感性顯著降低（P＜0.05），而WKY-EX組（pIC50：6.00±0.19）與WKY-SED組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），各組n=6。結(jié)果提示，高血壓時(shí)，腸系膜動(dòng)脈對(duì)Nifedipine的敏感性增強(qiáng)；有氧運(yùn)動(dòng)可減弱SHR對(duì)Nifedipine的敏感性。

2.2.3 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)G?6976誘發(fā)的腸系膜動(dòng)脈舒張反應(yīng)的影響

PKCα抑制劑G?6976可誘導(dǎo)各組腸系膜動(dòng)脈的濃度依賴性舒張（圖4A）。其中，SHR-SED組腸系膜動(dòng)脈的最大舒張反應(yīng)顯著高于WKY-SED組（P＜0.05）；而與SHRSED組相比，SHR-EX組血管的最大舒張反應(yīng)顯著降低（P＜0.05），但WKY-EX組與WKY-SED組相比，兩者無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。如圖4B所示，在各組腸系膜動(dòng)脈對(duì)G?6976的敏感性中，SHR-SED組（pIC50：5.95±0.12）顯著高于WKY-SED組（pIC50：5.47±0.21）（P＜0.05），與SHRSED組相比，SHR-EX組（pIC50：5.71±0.11）對(duì)G?6976的藥物敏感性顯著降低（P＜0.05），而WKY-EX組（pIC50：5.61±0.15）與WKY-SED組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），各組n=6。結(jié)果提示，高血壓時(shí)，血管對(duì)G?6976的敏感性顯著增強(qiáng)，而有氧運(yùn)動(dòng)可有效減弱SHR對(duì)G?6976的敏感性。

圖3 各組腸系膜動(dòng)脈對(duì)Nifedipine的張力反應(yīng)Figure 3.Tension Response of Mesenteric Arteries to Nifedipine in Each Group

圖4 遞增濃度的G?6976對(duì)各組腸系膜動(dòng)脈張力的影響Figure 4.Effect of Incremental Concentrations of G?6976 on Mesenteric Artery Tension in Each Group

2.3 PKCα對(duì)CaV1.2通道功能的影響

2.3.1 PKCα在調(diào)節(jié)血管張力中的作用

如圖5Aa所示，PKC激動(dòng)劑PDBu可誘使腸系膜動(dòng)脈收縮，使血管張力增加。SHR-SED組血管張力增加幅值顯著高于WKY-SED組（P＜0.05）；與SHR-SED組相比，SHR-EX組對(duì)PDBu誘發(fā)的血管張力反應(yīng)顯著降低（P＜0.05）。同時(shí)，與WKY-SED組相比，WKY-EX組對(duì)PDBu誘發(fā)的血管張力反應(yīng)顯著增高（P＜0.05）。在PDBu后加入CaV1.2通道抑制劑Nifedipine發(fā)現(xiàn)，各組血管均呈現(xiàn)出濃度依賴性的舒張，這表明，PKC在高血壓血管收縮功能調(diào)節(jié)中占據(jù)重要地位，CaV1.2通道在其中發(fā)揮了重要作用。

為明確PKCα在其中的作用，我們采用PKCα抑制劑G?6976孵育血管10 min，在抑制PKCα活性后加入PDBu誘發(fā)各組腸系膜動(dòng)脈收縮，隨后加入Nifedipine，觀察各組腸系膜動(dòng)脈的舒張反應(yīng)，從而進(jìn)一步探究PKCα在高血壓時(shí)血管張力調(diào)節(jié)中的作用以及CaV1.2通道在其中的貢獻(xiàn)（圖5Ab），各組n=6。結(jié)果如圖5B、5C所示，與直接加入PDBu相比，各組大鼠腸系膜動(dòng)脈在預(yù)先孵育G?6976后，PDBu誘發(fā)各組腸系膜動(dòng)脈的收縮反應(yīng)降低，與其各自安靜對(duì)照組相比，WKY-EX、SHR-EX對(duì)PDBu誘發(fā)的收縮反應(yīng)均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；加入Nifedipine后各組血管舒張程度也變小，其中SHR-SED組血管張力仍顯著高于WKY-SED組（P＜0.05），但WKY-EX、SHR-EX與其各自對(duì)照組相比，加入Nifedipine后，各組血管張力變化均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。以上結(jié)果提示，PKCα在高血壓腸系膜動(dòng)脈張力調(diào)節(jié)中具有重要作用，PKCα可通過調(diào)控CaV1.2通道功能來(lái)調(diào)節(jié)高血壓腸系膜動(dòng)脈的舒縮功能。

圖5 PKCα對(duì)CaV1.2通道功能的影響Figure 5.Effects of PKCα on CaV1.2 Channel Functionality

2.3.2 PKCα對(duì)CaV1.2通道電流的影響

為進(jìn)一步探究PKCα對(duì)CaV1.2通道功能的調(diào)節(jié)作用，采用全細(xì)胞電壓鉗模式記錄G?6976對(duì)CaV1.2通道電流的影響。本實(shí)驗(yàn)中，各組間腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的膜電容均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在未加藥前的基礎(chǔ)電流（control）中，與 WKY-SED 組（-8.2±1.2 pA/pF，n=28）相比，WKY-EX組（-10.0±1.1 pA/pF，n=30）、SHR-SED組（-13.9±1.5 pA/pF，n=33）的CaV1.2通道電流幅值均顯著增高（P＜0.05），而與SHR-SED組相比，SHR-EX組（-10.7±1.3 pA/pF，n=29）的CaV1.2通道電流幅值顯著降低（P＜0.05，圖6A）。這提示，高血壓時(shí)，CaV1.2通道電流幅值增加，而有氧運(yùn)動(dòng)可有效地降低其增加幅度，同時(shí)增加WKY-EX組CaV1.2通道電流。這與本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果一致（陳渝等，2015）。G?6976可誘使腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaV1.2通道電流密度顯著降低（圖6B）。將加G?6976后的各組CaV1.2通道電流與基礎(chǔ)電流相比，計(jì)算其電流幅值降低程度并以%control表示。其中，WKYSED 組（20.4±3.7%control，n=14）與 WKY-EX 組（29.2±3.1%control，n=16）間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與 WKYSED組相比，SHR-SED組（41.0±3.4%control，n=17）CaV1.2通道電流幅值降低幅度顯著增大（P＜0.05）；與SHR-SED組相比，SHR-EX組（32.3±3.0%control，n=15）CaV1.2通道電流幅值降低幅度顯著減?。≒＜0.05）。n表示細(xì)胞個(gè)數(shù)，每組均來(lái)源于6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。結(jié)果提示，G?6976可調(diào)節(jié)CaV1.2通道功能，抑制CaV1.2通道電流；高血壓可增加SHR腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CaV1.2通道對(duì)G?6976的敏感性，而有氧運(yùn)動(dòng)可以有效地降低SHR對(duì)G?6976的藥物敏感性。

2.4 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腸系膜動(dòng)脈PKCα的表達(dá)及其與CaV1.2 α1C共定位的影響

高血壓時(shí)，CaV1.2通道α1C亞基表達(dá)增多，有氧運(yùn)動(dòng)后，與SHR-SED組相比，SHR-EX組CaV1.2通道α1C亞基表達(dá)顯著降低，這與實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果相一致（張嚴(yán)焱等，2018）。如圖7A所示，PKCα亞基在各組血管平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有表達(dá)，且與WKY-SED組相比，SHR-SED組血管平滑肌細(xì)胞上的PKCα亞基信號(hào)表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），而有氧運(yùn)動(dòng)可顯著降低高血壓大鼠PKCα亞基信號(hào)的表達(dá)，同時(shí)還增強(qiáng)了PKCα亞基信號(hào)在WKY上的表達(dá)。對(duì)PKCα亞基與α1C亞基進(jìn)行共定位發(fā)現(xiàn)，高血壓時(shí)，PKCα與α1C的共定位信號(hào)顯著增強(qiáng)，即高血壓時(shí)，腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上的PKCα與CaV1.2耦聯(lián)增多。12周有氧運(yùn)動(dòng)后，與SHR-SED組相比，SHR-EX組PKCα與α1C的共定位信號(hào)顯著減弱，即腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上的PKCα與CaV1.2耦聯(lián)減少，而與WKYSED組相比，WKY-EX組PKCα與α1C的共定位信號(hào)顯著增強(qiáng)（圖7B）。以上結(jié)果表明，高血壓時(shí)，PKCα/CaV1.2信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，而有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制其表達(dá)的上調(diào)。

圖7 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腸系膜動(dòng)脈PKCα的表達(dá)及其與CaV1.2α1C共定位的影響Figure 7.Effects of Aerobic Exercise on PKCα Expression of Mesenteric Artery and its Effect on Colocalization of CaV1.2α1C

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，PKCα在高血壓腸系膜動(dòng)脈張力調(diào)節(jié)中具有重要作用，這種調(diào)節(jié)作用與CaV1.2通道功能密切相關(guān)，抑制PKCα可誘使CaV1.2通道電流幅值減少；高血壓時(shí)，腸系膜動(dòng)脈平滑肌PKCα/CaV1.2表達(dá)上調(diào)，使血管張力增加；而有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制其信號(hào)通路上調(diào)，從而改善血管舒縮功能。

長(zhǎng)期高血壓時(shí)，血管內(nèi)的壓力不斷增加，阻力動(dòng)脈為適應(yīng)其血管內(nèi)壓力的改變而發(fā)生生物學(xué)和結(jié)構(gòu)性的變化。這種變化的具體病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括血管功能重構(gòu)、血管內(nèi)皮功能紊亂、血管平滑肌增大等（Liu et al.，2018；Touyz，2010）。而規(guī)律的體力活動(dòng)被認(rèn)為是預(yù)防和治療高血壓的基石（NHBPEP，2003）。在本研究中，SHR-SED組收縮壓顯著高于WKY-SED組，而12周有氧運(yùn)動(dòng)后，SHR-EX組收縮壓較SHR-SED組顯著降低，即長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低SHR收縮壓，改善血管功能。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)降低血壓的具體機(jī)制尚不完全清楚，根據(jù)現(xiàn)有研究文獻(xiàn)，主要可歸納為以下幾個(gè)方面：1）通過對(duì)中樞神經(jīng)功能進(jìn)行調(diào)節(jié)來(lái)改善血壓；2）調(diào)節(jié)體內(nèi)與血壓相關(guān)的激素（兒茶酚胺類、5-羥色胺等）分泌水平；3）調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮舒張因子的生成；4）調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性；5）調(diào)節(jié)血管平滑肌上離子通道的功能重構(gòu)。

一般認(rèn)為，原發(fā)性高血壓形成的基礎(chǔ)主要是鈣離子通道的功能變化而引起的VSMC的胞內(nèi)游離的Ca2+濃度（［Ca2+］i）升高。CaV1.2通道廣泛表達(dá)于VSMC膜上，它是細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要途徑。研究表明，血管平滑肌細(xì)胞膜上的CaV1.2通道表達(dá)上調(diào)是高血壓的一個(gè)重要的標(biāo)志性特征（陳渝 等，2015；張嚴(yán)焱 等，2018），CaV1.2通道表達(dá)上調(diào)后，其通道開放數(shù)量增加，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增多，血管張力增加，血壓升高，且血壓升高的程度與CaV1.2通道表達(dá)量呈正相關(guān)（Navedo et al.，2010；Wellman et al.，2003）。有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制高血壓誘導(dǎo)的CaV1.2通道的功能重構(gòu)。在本研究中，CaV1.2通道激動(dòng)劑BayK8644可誘導(dǎo)血管收縮，使血管張力增加，而CaV1.2通道抑制劑Nifedipine可誘導(dǎo)血管呈濃度依賴性舒張，且高血壓時(shí)血管對(duì)BayK8644、Nifedipine的藥物敏感性增強(qiáng)，而有氧運(yùn)動(dòng)可有效地抑制SHR的BayK8644、Nifedipine敏感性增強(qiáng)反應(yīng)，即有氧運(yùn)動(dòng)可通過調(diào)節(jié)腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道功能改善血管舒張功能、改善高血壓，這與前人研究結(jié)果一致（陳渝等，2015）。但有氧運(yùn)動(dòng)調(diào)控高血壓腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道功能的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。α1C是CaV1.2通道的孔道亞基，具有4個(gè)跨膜區(qū)構(gòu)成的成孔亞單位，Ca2+通過此通道進(jìn)入細(xì)胞形成電流。高血壓時(shí)，CaV1.2通道功能上調(diào)主要表現(xiàn)為α1C亞基表達(dá)顯著增高。前期研究表明，長(zhǎng)期規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低高血壓大鼠收縮壓，引起β1亞基啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化，調(diào)控miR-328在轉(zhuǎn)錄后對(duì)CaV1.2通道α1C亞基的表達(dá)進(jìn)行靶向抑制，進(jìn)而調(diào)節(jié)高血壓腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道功能，從而改善血管舒縮功能（張嚴(yán)焱等，2018）。除表觀遺傳修飾外，研究發(fā)現(xiàn)，PKC也可對(duì)CaV1.2通道功能進(jìn)行調(diào)節(jié)（Schuhmann et al.，1994；Tseng et al.，1991），有氧運(yùn)動(dòng)可能經(jīng)PKC途徑調(diào)節(jié)CaV1.2通道功能，從而改善高血壓。

PKC是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，非活化的PKC主要存在于胞質(zhì)中，經(jīng)磷酸化激活后向細(xì)胞膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器發(fā)生易位（Ringvold et al.，2016）?；罨腜KC可磷酸化不同底物，包括離子通道、泵和核蛋白等。根據(jù)亞型結(jié)構(gòu)的不同可將PKC分為3大類：Ca2+和二酰甘油（DAG）依賴性的經(jīng)典型 PKC（cPKCs：α，βI，βII）、新型PKC（nPKCs：δ，?，η，θ）和DAG依賴性的非經(jīng)典型PKC（aPKCs：ζ，ι/λ）。其中，cPKCs由4個(gè)保守區(qū)域（C1～C4）和5個(gè)變量區(qū)域（V1～V5）構(gòu)成，主要由Ca2+、DAG激活（Newton，1995；Salamanca et al.，2005）。C1區(qū)域包含DAG和佛波醇酯的識(shí)別位點(diǎn)，而C2區(qū)域富含酸性殘留物和包含Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)。有學(xué)者通過測(cè)定PKC mRNA表達(dá)、蛋白質(zhì)水平和活性，以及通過研究PKC抑制劑的作用、PKC敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因大鼠中血管反應(yīng)性的變化，發(fā)現(xiàn)了PKC在血管收縮中的重要作用（Ringvold et al.，2016）。PKC可以通過多種機(jī)制影響血管平滑肌收縮，包括調(diào)節(jié)離子通道、離子泵、［Ca2+］i等。PKC易位至細(xì)胞表面還可以觸發(fā)一系列蛋白激酶，其最終與收縮肌絲相互作用并引起血管平滑肌收縮。研究發(fā)現(xiàn)，佛波醇酯可誘導(dǎo)血管收縮，同時(shí)還伴隨著平滑肌細(xì)胞中的Ca2+內(nèi)流增多，其機(jī)制可能為膜上的CaV1.2通道功能活動(dòng)增強(qiáng)，［Ca2+］i升高（Bonev et al.，1997）。PKC的磷酸化可參與控制細(xì)胞內(nèi)鈣的流入和排出，PKC可增強(qiáng)各種平滑肌細(xì)胞中的CaV1.2電流，如肺動(dòng)脈、腦動(dòng)脈等（Perzvizcaino et al.，2010）。在本實(shí)驗(yàn)中，離體微血管環(huán)張力測(cè)定結(jié)果顯示，PKC激動(dòng)劑PDBu可誘導(dǎo)血管張力增加，且呈一定的濃度依賴性。有研究表明，PKC對(duì)CaV1.2通道具有雙重調(diào) 節(jié) 作 用（Lacerda et al.，1988；Schuhmann et al.，1994），這可能與PKC在不同組織中亞型的表達(dá)情況有關(guān)（Gulia et al.，2013）。PKC亞型在不同的血管細(xì)胞類型中具有不同的作用，對(duì)VSMC的作用顯著。其中，PKCα亞基具有Ca2+依賴性，是血管平滑肌收縮的重要調(diào)節(jié)器。PKCα通過使肌球蛋白輕鏈磷酸化、Ca2+通道激活參與平滑肌收縮（Ren et al.，2010）。研究表明，PKCα在肺動(dòng)脈高血壓的發(fā)病過程中表達(dá)上調(diào)，PKCα的活化可能參與肺血管重構(gòu)（Tan et al.，2005）。在正常生理狀態(tài)下，PKCα可錨定VSMC，進(jìn)而調(diào)節(jié)局部的CaV1.2通道功能活動(dòng)。PKCα可直接磷酸化CaV1.2通道，以產(chǎn)生持久的鈣星（Gollasch et al.，2000）。PKCα與CaV1.2通道功能可能存在一定的關(guān)系。為此，我們展開了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)與直接加入PDBu相比，各組大鼠腸系膜動(dòng)脈在G?6976孵育后，PDBu誘發(fā)的收縮降低，加入Nifedipine后，各組血管張力前后變化較小，提示PKCα亞基在血管張力調(diào)節(jié)中具有非常重要的作用，且這一調(diào)節(jié)作用與CaV1.2通道功能密切相關(guān)。免疫熒光結(jié)果顯示，高血壓時(shí)，PKCα與CaV1.2α 1C共定位信號(hào)顯著增強(qiáng)，PKCα/CaV1.2信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，而有氧運(yùn)動(dòng)可有效抑制其表達(dá)的上調(diào)，即有氧運(yùn)動(dòng)可經(jīng)PKCα/CaV1.2信號(hào)通路調(diào)節(jié)高血壓腸系膜動(dòng)脈功能。但值得注意的是，12周有氧運(yùn)動(dòng)后，與WKY-SED組相比，WKY-EX組PKCα與CaV1.2α1C共定位信號(hào)顯著增強(qiáng)，這與SHR-EX中的表現(xiàn)相反。針對(duì)這一現(xiàn)象，我們猜測(cè)可能是由于SHR和WKY的不同生理和病理狀態(tài)，使得有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)其二者的作用機(jī)制和影響不同。

除CaV1.2通道外，PKCα對(duì)其他離子通道功能也具有一定的調(diào)節(jié)作用。K+通道蛋白的PKCα依賴性磷酸化可降低KV7通道活動(dòng)（Brueggemann et al.，2014）。在兔的冠狀動(dòng)脈 VSMCs，人內(nèi)皮素-1（ET-1）和血管緊張素 II（Ang II）通過激活PKC?抑制KV電流，通過激活PKCα抑制KIR通道活動(dòng)（Park et al.，2006）。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌上，CaV1.2通道具有明確的PKC磷酸位點(diǎn)——Thr27/31（Keef et al.，2001；Lacerda et al.，1988）。但目前在血管平滑肌上，PKCα調(diào)節(jié)CaV1.2通道功能的具體作用機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)作為一種非藥物治療手段，可通過調(diào)控高血壓相關(guān)離子通道功能活動(dòng)等機(jī)制，在改善高血壓、血管舒張功能等方面發(fā)揮重要作用。本研究通過離體微血管環(huán)張力測(cè)定、膜片鉗、免疫熒光等技術(shù)，從腸系膜動(dòng)脈收縮特性、CaV1.2通道電流變化、PKCα、CaV1.2通道α1C亞基表達(dá)、分布及二者共定位等方面，證明了有氧運(yùn)動(dòng)可通過PKCα/CaV1.2信號(hào)通路有效地改善高血壓腸系膜動(dòng)脈功能。這為理解有氧運(yùn)動(dòng)改善高血壓腸系膜動(dòng)脈CaV1.2通道功能的機(jī)制以及高血壓藥物治療新靶點(diǎn)的尋找提供了重要證據(jù)。

4 結(jié)論

有氧運(yùn)動(dòng)可有效降低高血壓大鼠的體重、血壓和心率，抑制高血壓誘導(dǎo)的PKCα表達(dá)上調(diào)，從而調(diào)節(jié)CaV1.2通道功能，改善高血壓，即有氧運(yùn)動(dòng)可通過抑制PKCα/CaV1.2信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)來(lái)改善高血壓大鼠的腸系膜動(dòng)脈舒縮功能。