不同茶樹品種的茶樹花黃酮苷研究

李金，陳蓮芙，金恩惠，李博，屠幼英

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系，杭州310058）

黃酮類化合物是茶葉中除兒茶素外最重要的一類化合物，主要以黃酮苷的形式存在于茶樹的各個(gè)器官中。由于黃酮苷具有多種生物學(xué)活性[1-2]，且對(duì)茶葉湯色和滋味具有一定的貢獻(xiàn)[3-5]，所以一直受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。20世紀(jì)50年代，人們通過雙向薄層層析色譜技術(shù)，首次在茶葉中檢測到了黃酮苷。隨著高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS）、超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UHPLC-MS）及核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR）技術(shù)的成熟，茶葉中越來越多的黃酮類化合物被檢測出來。王智聰?shù)萚6]采用UHPLC-MS測定了紅茶與綠茶中15種不同的黃酮苷化合物。FANG 等[7]建立了UHPLC-DAD-MS/MS 方法，可以同時(shí)檢測出茶葉中21 種不同的黃酮苷化合物。與茶葉相比，對(duì)茶樹花中黃酮類化合物的研究則較少。YANG 等[8]的研究表明，在茶樹花的乙醇提取物中，8種兒茶素和5種黃酮苷對(duì)茶樹花抗氧化活性起到重要作用。

本文采用UHPLC-MS 方法對(duì)5 個(gè)不同茶樹品種的茶樹花黃酮苷進(jìn)行檢測，以楊梅素、槲皮素、山柰酚3 種黃酮醇作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行黃酮苷等量分析，并對(duì)不同品種茶樹花中的黃酮苷進(jìn)行比較，研究其在種類與含量上的差異性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料為梅占、水古、黃葉早、政和大白、福建水仙5個(gè)茶樹品種，采花時(shí)期為全開期（種植于浙江大學(xué)茶學(xué)系實(shí)驗(yàn)基地）。將采摘的茶樹花置于60 ℃烘箱中烘4～6 h，備用。

1.2 儀器設(shè)備

Waters 超高效液相色譜儀（Waters Corp 公司，美國），AB Triple TOF 5600 plus LC/MS 系統(tǒng)（AB SCIEX 公司，美國），艾科浦高端超純水機(jī)（ACD0-0005-1，重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司），電子分析天平［AL104，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］，恒溫水浴鍋，冷凝管，Welch Ultimate XP C18 柱（100 mm×2.1 mm，直徑1.8 μm）。

1.3 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取1 g（0.000 1 g）茶樹花樣品，以1∶54的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為78%的預(yù)熱乙醇，于75 ℃的水浴鍋中回流提取1.86 h，而后進(jìn)行抽濾，濾液冷卻后將其作為供試液，每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

準(zhǔn)確稱取5 mg 的標(biāo)準(zhǔn)品，分別溶于5 mL 甲醇中，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別取0.1 mL 的標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL 的容量瓶中，并用甲醇定容，得到0.01 mg/mL 的黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)品：楊梅素、槲皮素、山柰酚。

1.5 黃酮苷的UHPLC-MS 定性分析

液相條件：流動(dòng)相A（99.9%超純水，0.1%甲酸），流動(dòng)相B（99.9%乙腈，0.1%甲酸）。梯度洗脫條件：0～10 min，B 相10%～18%；10～15 min，B 相18%～20%；15～20 min，B 相20%～25%；20～30 min，B 相25%～50%；進(jìn)樣量為10 μL，流速為0.3 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫為25 ℃。

質(zhì)譜條件：m/z掃描范圍為100～1 000；電離模式為正、負(fù)離子模式。正離子模式：離子源電壓+5.5 kV，離子源溫度600 ℃。負(fù)離子模式：離子源電壓－4.5 kV，離子源溫度550 ℃。空氣1和空氣2壓力為50 Pa，氮?dú)鈮毫?5 Pa。最大誤差：±5 mmol/L；碰撞能量范圍：20～40 V。

1.6 黃酮苷的UHPLC-MS 定量分析

楊梅素苷、槲皮素苷、山柰酚苷根據(jù)相應(yīng)的黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行等量分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品的檢測

對(duì)3 種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行UHPLC-MS 分析，所得色譜與質(zhì)譜信息如表1 所示。分析可知，1號(hào)峰代表?xiàng)蠲匪兀? 號(hào)峰代表槲皮素，3 號(hào)峰代表山柰酚。

我國林業(yè)資源豐富，但是由于人為的破壞，使得林業(yè)資源大規(guī)模的減少。人們?cè)诎l(fā)展的過程中只注重經(jīng)濟(jì)效益，忽視了破壞森林資源所帶來的生態(tài)后果。他們認(rèn)為保護(hù)森林資源的做法是無關(guān)緊要的，從而做出一些加劇我國森林資源減少的行為，就會(huì)造成水土流失、生態(tài)環(huán)境破壞的問題，這樣對(duì)于我國的發(fā)展是非常不利的。會(huì)對(duì)我國的森林保護(hù)工作造成非常大的阻礙。

表1 黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜和質(zhì)譜信息Table 1 Chromatography data and mass spectrometry data of flavonol standards

2.2 茶樹花樣品中黃酮苷的UHPLC-MS 分析

以福建水仙品種的茶樹花樣品為例，采用UHPLC-MS進(jìn)行測定和分析，結(jié)合質(zhì)譜信息及參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-13]，可推斷圖1中的峰1～12均為黃酮苷物質(zhì)，各相應(yīng)峰的保留時(shí)間、質(zhì)譜碎片信息及質(zhì)譜鑒定結(jié)果如表2所示。

圖1 茶樹花中黃酮苷的UHPLC色譜圖（λ=360 nm）Fig.1 UHPLC chromatogram of flavonoid glycosides of tea flowers(λ=360 nm)

如圖2所示，1號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－為m/z=625，通過與茶樹花中已檢測出的黃酮苷化合物的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)，初步推斷是楊梅素-3-O-蕓香糖苷，當(dāng)它失去1分子蕓香糖基（－m/z=308）后，可形成m/z=316的楊梅素苷元，因此可以推斷化合物1是楊梅素-3-O-蕓香糖苷。該黃酮苷已在茶葉中被檢測出來[9]，但在茶樹花中卻少有報(bào)道。

表2 茶樹花中黃酮苷類物質(zhì)的質(zhì)譜信息Table 2 Mass spectrometry data of flavonoid glycosides of tea flowers

圖2 各峰化合物的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra from peak 1 to 12

2和3號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－一致，均為m/z=479，初步推斷為楊梅素-3-O-半乳糖苷、楊梅素-3-O-葡萄糖苷，當(dāng)它們分別失去1分子半乳糖基（－m/z=162）和1 分子葡萄糖基（－m/z=162）時(shí)，可以形成m/z=316 的楊梅素苷元。已有研究證明，半乳糖苷類化合物的出峰時(shí)間相對(duì)于葡萄糖苷類化合物早[10-12]，因此可以推斷化合物2是楊梅素-3-O-半乳糖苷、化合物3是楊梅素-3-O-葡萄糖苷。

4和5號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－均為m/z=771。碎片離子m/z=609 為丟失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基的槲皮素-3-O-蕓香糖苷片段；碎片離子m/z=463 為丟失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基和1分子鼠李糖基（－m/z=146）的槲皮素-3-O-葡萄糖苷片段；當(dāng)它們失去所有的糖基時(shí)，可形成－m/z=301的槲皮素苷元。因此，推斷化合物4是槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷，化合物5 是槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷。

6和9號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－均為m/z=755，碎片離子m/z=285 為丟失了1 分子半乳糖基或葡萄糖基和1分子蕓香糖基的山柰酚苷元，推斷峰6是山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷，峰9是山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷。這2 種山柰酚苷已在茶樹干花中被檢測出，而且含量較高[13]。

7和8號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－均為m/z=463，碎片離子m/z=301 分別為丟失1 分子半乳糖基和1 分子葡萄糖基時(shí)的槲皮素苷元，推斷化合物7為槲皮素-3-O-半乳糖苷，化合物8 為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

11號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－為m/z=593，碎片離子m/z=285 為丟失1 分子蕓香糖基的山柰酚苷元，推斷化合物11 為山柰酚-3-O-蕓香糖苷，目前已有相關(guān)研究證實(shí)該物質(zhì)存在于茶樹干花中[8]。

10和12號(hào)化合物的分子離子峰[M-H]－為m/z=447，丟失1 分子半乳糖基和1 分子葡萄糖基時(shí)，可以形成m/z=285 的山柰酚苷元，推斷化合物10 為山柰酚-3-O-半乳糖苷，化合物12 為山柰酚-3-O-葡萄糖苷。

表3 不同品種的茶樹花黃酮苷含量Table 3 Content of flavonoid glycosides of tea flower in different tea plant cultivars mg/g

2.3 不同品種茶樹花中黃酮苷組分和含量

從表3 可見，不同品種茶樹花中的黃酮苷組分和含量存在較大差異。其中，福建水仙茶樹花中楊梅素-3-O-葡萄糖苷的含量在5 個(gè)品種中最高，為0.436 mg/g。黃葉早茶樹花中山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷的含量顯著高于其他幾個(gè)品種，達(dá)到0.962 mg/g。梅占品種中山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量最高，為1.208 mg/g，顯著高于另外4 個(gè)品種。政和大白、黃葉早和水古茶樹花中槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷的含量顯著高于其他2 個(gè)品種。在5 個(gè)茶樹花品種中，福建水仙茶樹花中槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量最高，且顯著高于政和大白、梅占和黃葉早?？v觀各黃酮苷組分在不同品種茶樹花中的分布情況，福建水仙品種中，除了楊梅素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量顯著高于其他品種，有8 種黃酮苷組分在所有品種中均低于平均水平。

如表4所示，不同品種茶樹花中的總楊梅素苷、總槲皮素苷、總山柰酚苷含量存在顯著差異。政和大白茶樹花中的總楊梅素苷含量顯著低于其他品種。福建水仙茶樹花中的總槲皮素苷含量最低，而黃葉早與水古茶樹花中的含量則明顯較高。政和大白、福建水仙和水古茶樹花中總山柰酚苷的含量顯著低于其他2 個(gè)品種，黃葉早中總山柰酚苷的含量最高，占到黃酮苷總量的一半以上。

由表5 可知，三糖基黃酮苷為茶樹花中最主要的黃酮苷，占其黃酮苷總量的一半以上，而二糖基黃酮苷在茶樹花中的含量最低。楊梅素苷主要以單糖基黃酮苷和二糖基黃酮苷的形式存在，如楊梅素-3-O-半乳糖苷和楊梅素-3-O-蕓香糖苷；槲皮素苷主要以單糖基黃酮苷和三糖基黃酮苷的形式存在，如槲皮素-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷；而山柰酚苷的糖基化形式最為豐富，既有單糖基黃酮苷如山柰酚-3-O-半乳糖苷，也有二糖基黃酮苷和三糖基黃酮苷，如山柰酚-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷。在5個(gè)不同品種的茶樹花中，黃葉早中的單糖基黃酮苷顯著高于其他品種，梅占和水古品種次之；二糖基黃酮苷在黃葉早茶樹花中的含量最高，其次是在水古茶樹花中，在政和大白茶樹花中的含量最低，且黃葉早茶樹花中的三糖基黃酮苷含量也顯著高于其他茶樹花品種。

表4 不同品種茶樹花中不同苷元的黃酮苷含量Table 4 Content of flavonoid glycosides with different aglycones in tea flower of different tea plant cultivars mg/g

3 討論

通過比較不同品種茶樹花中的黃酮苷組分含量，發(fā)現(xiàn)在三糖基山柰酚苷中，5個(gè)品種的山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量最高，其次是山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷。而山柰酚-3-O-葡萄糖苷在5個(gè)品種中的含量都很低；梅占茶樹花中楊梅素-3-O-半乳糖苷含量是福建水仙茶樹花中的5 倍，而楊梅素-3-O-葡萄糖苷卻只有福建水仙茶樹花中的1/5。

此前，吳春燕等[9]用HPLC-MS測定了上述5個(gè)品種茶樹葉片中黃酮苷的組分含量，發(fā)現(xiàn)茶葉中含量最高的為槲皮素苷，而本文結(jié)果表明，在茶樹花中不同苷元黃酮苷含量最高的為山柰酚苷，槲皮素苷、楊梅素苷次之。而茶樹花和葉片中的黃酮苷糖基化程度也有所不同，茶樹花中黃酮苷的存在形式主要是三糖基黃酮苷，其含量占總黃酮苷含量的一半以上；而茶葉中其主要存在形式為單糖基黃酮苷與二糖基黃酮苷。茶樹花中的總山柰酚苷和三糖基山柰酚的含量普遍高于它們?cè)诓枞~中的含量。相關(guān)研究表明，山柰酚苷具有重要的生物學(xué)活性，包括較強(qiáng)的氧化性，能抑制人白血病細(xì)胞活性，保護(hù)腦部組織細(xì)胞，緩解應(yīng)激反應(yīng)等[9,14-16]。

此外，茶樹花中含量較高的黃酮苷為槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷，其中山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷在5 個(gè)茶樹品種的茶葉里均未能檢測到，而它在黃葉早茶樹花中的含量接近1.000 mg/g；另外，福建水仙茶樹花中山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷的含量是茶葉中的2 倍，槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷和槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷在水古和福建水仙茶樹花中的含量也高于茶葉中的含量，槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷在黃葉早茶樹花中的含量高于葉片。綜上表明，在不同的茶樹品種中，各黃酮苷組分在其花與葉中的分布具有一定的品種差異性。

4 結(jié)論

在政和大白、福建水仙、梅占、黃葉早、水古茶樹花中，檢測出了12 種不同的黃酮苷，分別為楊梅素-3-O-蕓香糖苷、楊梅素-3-O-半乳糖苷、楊梅素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷。

通過對(duì)不同品種茶樹花中各黃酮苷組分的含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黃酮苷組分的分布呈現(xiàn)明顯的品種特異性：福建水仙茶樹花中楊梅素-3-O-葡萄糖苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他品種；黃葉早中山柰酚-3-O-蕓香糖半乳糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-半乳糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量顯著高于其他幾個(gè)品種；山柰酚-3-O-蕓香糖葡萄糖苷含量在所有品種的茶樹花中均為最高，在梅占中更是高達(dá)1.208 mg/g。盡管不同品種茶樹花的黃酮苷含量具有一定的差異性，但不同苷元的黃酮苷含量均表現(xiàn)為楊梅素苷＜槲皮素苷＜山柰酚苷，并且以三糖基黃酮苷為主。