低溫發(fā)芽測定早稻種子活力

曹棟棟，吳偉，陳珊宇，秦葉波，阮關(guān)海，陸敏，錢培麗，黃玉韜*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州310021；2.浙江農(nóng)科種業(yè)有限公司，杭州310021；3.浙江省種子管理總站，杭州310020；4.浙江省農(nóng)技推廣中心，杭州310020；5.湖州科奧種業(yè)有限公司，浙江 湖州313000）

水稻（Oryza sativaL.）是我國第一大糧食作物，全國近2/3 的人口以稻米為主食，水稻栽培面積約占糧食作物種植面積的1/3[1]。水稻種子質(zhì)量是決定水稻產(chǎn)量的重要因素，直接關(guān)系到糧食生產(chǎn)的安全。種子質(zhì)量是由種子不同特征綜合而成的一種概念，主要包括2 方面的內(nèi)容：品種質(zhì)量和播種質(zhì)量。品種質(zhì)量是指與遺傳特性有關(guān)的品質(zhì)，可用真實(shí)性和純度來反映。播種質(zhì)量是指種子播種后與田間出苗有關(guān)的質(zhì)量，包括凈度、水分、種子健康度、種子籽粒質(zhì)量、生活力、發(fā)芽力、活力等[2]。

種子活力是決定種子在田間迅速整齊出苗及長成正常幼苗潛在能力的總稱，是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。高活力水稻種子具有明顯的生長優(yōu)勢和生產(chǎn)潛力，對提高水稻種子耐藏性和田間成苗率、抵抗苗期逆境（低溫、干旱和病蟲草害等）、節(jié)省播種費(fèi)用、增加作物產(chǎn)量具有重要意義[3]。種子活力不是一個單一的特性，同時環(huán)境條件又增加了活力的不穩(wěn)定性。因此，任何一種活力測定方法都不可能直接反映種子活力的全部特性[4]。目前，種子活力測定方法歸納起來分為直接法和間接法2 類。直接法是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬田間環(huán)境條件和其他條件，測定種子發(fā)芽情況的方法；間接法是測定與田間出苗率相關(guān)的生理生化指標(biāo)的方法[5]。

在逆境脅迫的田間條件下，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果與田間出苗率相關(guān)性低，不能準(zhǔn)確地預(yù)測田間出苗表現(xiàn)與生產(chǎn)情況。水稻是喜溫作物，根據(jù)播種期、生長期和成熟期的不同，水稻又可分為早稻、中稻和晚稻。1960年以來，浙江省以雙季稻（早稻+晚稻）種植為主，其中早稻在浙江省水稻產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。相比于中、晚稻，早稻在直播或育秧期更容易遭受低溫脅迫，嚴(yán)重影響水稻種子的出苗與幼苗生長。低溫發(fā)芽試驗(yàn)可以模擬田間低溫條件，采用較低的溫度進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，以預(yù)測種子在低溫田間條件下的發(fā)芽適應(yīng)能力[6]。陳一清等利用低溫對水稻品種進(jìn)行鑒定并與田間出苗情況進(jìn)行相關(guān)性分析，表明低溫發(fā)芽可以測定水稻的種子活力[7]。傅丹桂等研究表明，8個不同類型水稻品種在18 ℃低溫發(fā)芽14 d 的發(fā)芽率與田間出苗率呈極顯著正相關(guān)[8]。但是傳統(tǒng)的低溫發(fā)芽試驗(yàn)需要統(tǒng)計發(fā)芽14 d的正常幼苗數(shù)，耗時費(fèi)力。同時，低溫發(fā)芽試驗(yàn)測定水稻種子活力的相關(guān)機(jī)制還未被充分研究。

因此，本試驗(yàn)選用了浙江省種植面積較廣的6個早稻品種，通過人工加速老化的方法獲得了各品種具有高低活力差異的種子樣品（共12個），采用不同低溫（12 ℃、15 ℃和18 ℃）發(fā)芽試驗(yàn)方法測定了這12個種子樣品的種子活力，旨在為改進(jìn)低溫發(fā)芽試驗(yàn)并測定早稻種子活力提供進(jìn)一步的理論研究基礎(chǔ)。同時，試驗(yàn)選取了低溫發(fā)芽試驗(yàn)測定水稻種子活力的最佳時間點(diǎn)，并進(jìn)一步檢測了高低活力種子批之間在低溫脅迫下相關(guān)生理生化指標(biāo)的差異，以期為低溫發(fā)芽試驗(yàn)測定水稻種子活力的機(jī)制提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以‘ 株 兩 優(yōu)06’（ZLY06）、‘ 株 兩 優(yōu)101’（ZLY101）、‘中早39’（ZZ）、‘金早47’（JZ）、‘中嘉早17’（ZJZ）和‘甬秈15’（YX）6 個水稻（Oryza sativaL.）早稻品種作為試驗(yàn)材料。通過人工加速老化的方法獲得各品種低活力（-L）的種子樣品[3]，未經(jīng)過人工老化的種子為高活力（-H）的種子樣品，共12個早稻種子樣品。人工加速老化在種子老化箱中進(jìn)行，在48 ℃和100%空氣濕度下人工老化72 h。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)

參照國際種子檢驗(yàn)協(xié)會（International Seed Testing Association, ISTA）種子檢驗(yàn)規(guī)程[9]，對12 個種子批水稻種子進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)。水稻種子經(jīng)過0.1%的次氯酸鈉溶液消毒15 min 后采用紙上發(fā)芽。發(fā)芽盒（長×寬為12 cm×12 cm）內(nèi)放兩層發(fā)芽紙，充分潤濕后，均勻放入100 粒水稻種子，4 組重復(fù)。將種子置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，光照設(shè)置為12 h光照/12 h黑暗。以種子胚根突破種皮1 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天記錄發(fā)芽數(shù)，在發(fā)芽的第4天和第7 天分別計算發(fā)芽勢（germination energy, GE）和發(fā)芽率（germination percentage, GP）。在發(fā)芽的第14天，隨機(jī)選取具有代表性的10株幼苗，測量其長度。發(fā)芽指數(shù)（germination index,GI）=∑（Gt/t），其中Gt是第t天的發(fā)芽數(shù)?；盍χ笖?shù)（vigor index,VI）=GI×苗干質(zhì)量。

1.3 低溫發(fā)芽試驗(yàn)

對12個種子批水稻種子進(jìn)行低溫發(fā)芽試驗(yàn)，溫度設(shè)置分別為12 ℃、15 ℃和18 ℃。水稻種子經(jīng)過0.1%的次氯酸鈉溶液消毒15 min后采用紙上發(fā)芽。發(fā)芽盒內(nèi)放兩層發(fā)芽紙，充分潤濕后，均勻放入100粒水稻種子，4 組重復(fù)。光照設(shè)置為12 h 光照/12 h黑暗。以種子胚根突破種皮1 mm 為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天記錄發(fā)芽種子數(shù)。

1.4 田間出苗試驗(yàn)

對12 個種子批水稻種子進(jìn)行田間出苗試驗(yàn)。于2018 年4 月7 日—21 日在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所農(nóng)場進(jìn)行，試驗(yàn)期間每天用U 型高低溫度計記錄田間最高與最低氣溫（圖1）。水稻種子經(jīng)過0.1%的次氯酸鈉溶液消毒15 min 后播種于育秧田中，4 組重復(fù)，每組播種100 粒種子，在第14天時統(tǒng)計田間出苗率。

圖1 田間出苗試驗(yàn)期間每日最高和最低溫度變化Fig.1 Change of daily maximum temperature and minimum temperature during the field emergence test

1.5 赤霉素與脫落酸含量測定

赤霉素（gibberellin, GA）和脫落酸（abscisic acid,ABA）含量測定參照HUANG 等的方法并稍作修改[10]。取水稻種子0.3 g，加入液氮，研磨成粉，然后加入6 mL 的冷乙腈，密封放入4 ℃冰箱中浸提12 h。浸提后于4 ℃、1×104r/min 條件下離心10 min，取上清液；接著在35 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?，加? mL 磷酸緩沖溶液（0.1 mol/L，pH=8.0），放入－80 ℃超低溫冰箱中冰凍30 min后，在4 ℃條件下解凍，低溫、1×104r/min離心15 min，過濾棄去雜質(zhì)，用鹽酸（0.5 mol/L）調(diào)pH 至3.0～3.5，再用等體積的乙酸乙酯萃取3 次，合并酯相，在35 ℃條件下氮?dú)獯蹈?；最后用流動相定容? mL，溶液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)行高效液相色譜測定。

1.6 基因表達(dá)量測定

用植物RNA 提取試劑盒提取水稻籽粒總RNA。利用NanoDrop 1000 分光光度計（NanoDrop技術(shù)公司，美國）檢測RNA 的純度和濃度。采用PrimerScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）系統(tǒng)（Roche公司，美國）進(jìn)行基因檢測。在96 孔板上利用SYBR Premix ExTaqTMⅡ（TaKaRa 公司，日本）法以cDNA 為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個樣品3次重復(fù)。PCR反應(yīng)采用20 μL 體系，包括SYBR Premix ExTaqTMⅡ（10 μL），0.6 mmol/L正反向引物和1 μL cDNA。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，56 ℃退火20 s，進(jìn)行45 個循環(huán)。每次PCR 循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，以線性方式從65 ℃升溫至95 ℃。以O(shè)sActin為內(nèi)參基因，采用2－ΔΔCt法計算脫落酸代謝及信號傳導(dǎo)相關(guān)基因OsNCED1、OsNCED3、

OsNCED4、OsZEP1、OsAAO2、OsAAO3、OsABA8ox1、OsABA8ox2、OsPYL3、OsPYL5、OsPYL9、OsPP2C2、OsPP2C3、OsSnRK2、OsDREB1c、OsDREB1f和OsDREB2a的表達(dá)量。脫落酸代謝及信號傳導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)量的PCR驗(yàn)證所用引物由Primer 5.0軟件設(shè)計，引物序列信息如表1所示。

表1 引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

1.7 統(tǒng)計分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多重比較采用最小顯著差異法（least significant difference,LSD，α=0.05），百分率數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換（y=arcsin[sqrt(x/l00)]）。

2 結(jié)果與分析

2.1 早稻種子樣品的發(fā)芽指標(biāo)與田間出苗情況

由表2可知，在12個早稻種子樣品中，每個早稻品種的2個種子批均表現(xiàn)出顯著的活力差異?！陜蓛?yōu)06’（ZLY06）、‘株兩優(yōu)101’（ZLY101）、‘中早39’（ZZ）、‘金早47’（JZ）、‘中嘉早17’（ZJZ）和‘甬秈15’（YX）高活力種子批的發(fā)芽勢（GE）、發(fā)芽率（GP）、發(fā)芽指數(shù)（GI）與活力指數(shù)（VI）均顯著高于低活力種子批。在田間出苗試驗(yàn)期間，2018年4月7日—9日與2018 年4 月14 日—18 日田間最低氣溫均低于15 ℃（圖1），田間出苗率在每個品種種子批之間的差異表現(xiàn)更為明顯，6 個品種高活力種子批的田間出苗率為66.35%～79.30%，而低活力種子批則為43.34%～69.71%（表2）。

表2 早稻種子樣品的田間表現(xiàn)情況Table 2 Field performance of early rice seed samples

2.2 早稻種子樣品的發(fā)芽指標(biāo)與田間出苗率的相關(guān)關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果（表3）表明，12 個早稻種子樣品的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均與田間出苗率顯著相關(guān)（P＜0.01），其相關(guān)系數(shù)在0.628～0.778 之間。相比于發(fā)芽勢（0.704）與發(fā)芽率（0.628），發(fā)芽指數(shù)（0.723）、活力指數(shù)（0.778）與田間出苗率的相關(guān)系數(shù)更高。此外，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)兩兩之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.801，達(dá)到0.001水平相關(guān)。

表3 早稻種子樣品的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與田間出苗率的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between germination energy(GE),germination percentage(GP),germination index(GI),vigor index(VI)and field emergence(FE)of early rice seed samples

2.3 低溫發(fā)芽率與田間出苗率的相關(guān)關(guān)系

18 ℃發(fā)芽4 d和5 d的發(fā)芽率與田間出苗率有較好的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到了0.932（P＜0.001）與0.817（P＜0.001）；而在發(fā)芽6 d之后的發(fā)芽率與田間出苗率均無顯著相關(guān)性。15 ℃發(fā)芽5～7 d的發(fā)芽率與田間出苗率的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），在發(fā)芽8 d后的發(fā)芽率與田間出苗率均無顯著相關(guān)性。12 ℃發(fā)芽不同天數(shù)的發(fā)芽率與田間出苗率均無顯著相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)只分布在0.304～0.426之間（表4）。

為進(jìn)一步評估低溫發(fā)芽試驗(yàn)測定早稻種子活力的效果，試驗(yàn)選取了18 ℃低溫發(fā)芽第4—5 天的發(fā)芽率與田間出苗率做回歸分析。結(jié)果（圖2）顯示：18 ℃低溫發(fā)芽4 d 的發(fā)芽率與田間出苗率的回歸系數(shù)為0.852，表明18 ℃低溫發(fā)芽4 d的發(fā)芽率能夠有效地預(yù)測早稻種子田間出苗情況；而18 ℃低溫發(fā)芽5 d 的發(fā)芽率與田間出苗率的回歸系數(shù)僅為0.703，其預(yù)測效果差于4 d的發(fā)芽率。

表4 低溫下不同發(fā)芽天數(shù)早稻種子樣品的發(fā)芽率與田間出苗率的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between germination percentage(GP)under chilling stress and field emergence(FE)of early rice seedsamples

圖2 早稻種子樣品18 ℃低溫發(fā)芽第4 天（A）與第5 天（B）的發(fā)芽率與田間出苗率回歸分析Fig.2 Regression analysis between germination percentage and field emergence on the 4th day (A) and the 5th day (B)at 18 ℃for early rice seed samples

2.4 低溫發(fā)芽對水稻種子赤霉素和脫落酸含量的影響

為了進(jìn)一步研究低溫發(fā)芽試驗(yàn)測定早稻種子活力的生理機(jī)制，試驗(yàn)選取了18 ℃發(fā)芽4 d 的水稻樣品，測定了其GA與ABA含量（圖3）。在18 ℃發(fā)芽4 d，ZLY06、ZYL101、ZJZ、YX的高活力種子批中ABA含量均顯著低于低活力種子批，而ZZ 與JZ 種子的ABA含量在高低種子批之間無顯著差異。此外，不同水稻品種之間ABA含量也有所差異（圖3A）。

相比于ABA含量，GA含量在6個水稻品種高低活力種子批之間的差異不具規(guī)律性。在18 ℃發(fā)芽4 d，JZ高活力種子批中GA含量顯著高于低活力種子批。相反的，ZLY06與ZZ高活力種子批中GA含量均顯著低于低活力種子批，而ZLY101、ZJZ與YX種子批之間GA含量無顯著差異（圖3B）。

GA/ABA 比例在ZLY06、ZLY101 和JZ 種子批之間存在顯著差異，且都表現(xiàn)為高活力種子批顯著高于低活力種子批，其上調(diào)倍數(shù)分別為2.12、1.79和1.35。而ZZ、ZJZ 與YX 種子批在GA/ABA 比例上無顯著差異（圖3C）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，18 ℃發(fā)芽4 d水稻種子GA/ABA比例與當(dāng)天的發(fā)芽率及田間出苗率均表現(xiàn)為顯著的正相關(guān)關(guān)系（表5）。

2.5 低溫發(fā)芽對水稻種子ABA 代謝相關(guān)基因及ABA 信號傳導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

為了進(jìn)一步研究ABA代謝及信號傳導(dǎo)過程是否影響低溫條件下早稻種子活力，試驗(yàn)選取了18 ℃發(fā)芽4 d種子批之間發(fā)芽率與ABA含量差異較大的3個水稻品種（ZLY06、ZLY101 和ZJZ），測定了ABA代謝相關(guān)基因和ABA信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)量。

在18 ℃發(fā)芽4 d，ZLY06、ZLY101和ZJZ高活力種子的9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因OsNCED1、OsNCED3與玉米黃質(zhì)氧化酶基因OsZEP1表達(dá)量均顯著低于低活力種子（圖4A～B、D）。OsNCED4在ZJZ 高活力種子中表達(dá)量顯著低于低活力種子，在ZLY06、ZLY101 高低活力種子批之間無顯著差異（圖4C）。而ABA 醛氧化酶基因OsAAO2與OsAAO3表達(dá)量在ZLY06 與ZJZ 高低活力種子批之間無顯著差異，僅在ZLY101 高活力種子中觀察到OsAAO3的表達(dá)量顯著降低（圖4E～F）。此外，ABA 分解代謝關(guān)鍵酶8’-羥化酶基因OsABA8ox1與OsABA8ox2在ZLY06、ZLY101 高 活力種子中表達(dá)量均顯著高于低活力種子，但是在ZJZ高低活力種子批之間無顯著差異（圖4G～H）。

圖3 18 ℃發(fā)芽4 d 的早稻種子樣品脫落酸、赤霉素含量和赤霉素/脫落酸比例Fig.3 Abscisic acid (ABA), gibberellin (GA) contents and GA/ABA ratio of early rice seed samples after 4 days of germination at 18 ℃

表5 18 ℃發(fā)芽4 d 早稻種子樣品脫落酸、赤霉素、赤霉素/脫落酸比例與發(fā)芽率、田間出苗率的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis among ABA, GA contents, GA/ABA ratio and germination percentage after 4 days of germination at 18 ℃and field emergence of early rice seed samples

18 ℃發(fā)芽4 d，不同水稻品種高低活力種子的ABA信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)模式也存在差異（圖5）。ABA 受體合成基因OsPYL3與OsPYL5表達(dá)量在ZLY101 和ZJZ 高低活力種子批之間有顯著性差異（圖5A～B），ABA 受體合成基因OsPYL9在高活力種子中表達(dá)量均顯著高于低活力種子（圖5C），而2C 類蛋白磷酸酶基因OsPP2C2、OsPP2C3在高活力種子中表達(dá)量均顯著低于低活力種子（圖5D～E）。SNF1 相 關(guān) 的 蛋 白 激 酶2 基 因OsSnRK2在ZLY101 高活力種子中表達(dá)量是低活力種子的3.81倍（圖5F）。同時，ZLY06 高活力種子中轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1c、OsDREB1f和OsDREB2a的表達(dá)量亦顯著高于低活力種子（圖5G～I(xiàn)）。

3 討論

3.1 低溫發(fā)芽試驗(yàn)測定早稻種子活力的效果

本研究表明，標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)的發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)在各早稻品種高低活力種子批之間均存在顯著差異，且均與田間出苗率呈顯著正相關(guān)，說明這3個指標(biāo)可以作為早稻種子活力衡量的指標(biāo)。

水稻是喜溫作物，早稻在直播或育秧階段容易遭受低溫脅迫并影響田間出苗情況[11-12]。低溫發(fā)芽試驗(yàn)也是一種常見的種子活力測定方法，可用于低溫早播作物的活力測定[13]。筆者之一對水稻種子活力測定的結(jié)果表明，3個雜交水稻品種在18 ℃低溫發(fā)芽10 d的發(fā)芽率與田間出苗率顯著相關(guān)，可以作為測定水稻種子活力的方法之一[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，在田間出苗試驗(yàn)期間，2018年4月7日—9日與2018年4 月14 日—18 日田間最低氣溫均低于15 ℃，表明這12 個早稻種子樣品在田間出苗試驗(yàn)中遭受了低溫脅迫。12 個早稻種子樣品18 ℃低溫發(fā)芽第4—5天的發(fā)芽率與田間出苗率有較好的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)（0.932 與0.817）顯著高于發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)與田間出苗率的相關(guān)系數(shù)（0.704～0.778），其回歸系數(shù)（0.852 與0.703）也分別達(dá)到了極顯著水平，可以作為預(yù)測早稻田間出苗的有效指標(biāo)。此外，15 ℃低溫發(fā)芽5～7 d的發(fā)芽率與田間出苗率也顯著相關(guān)，但是其相關(guān)系數(shù)較小。12 ℃下12個早稻種子樣品發(fā)芽速度與發(fā)芽率受到嚴(yán)重抑制，其不同天數(shù)的發(fā)芽率與田間出苗率均無顯著相關(guān)性，說明12 ℃的低溫發(fā)芽試驗(yàn)不能用于早稻種子活力的測定。以上結(jié)果表明，在早稻直播或田間育秧易遭受低溫脅迫的情況下，18 ℃低溫發(fā)芽試驗(yàn)可以更加準(zhǔn)確有效地測定早稻種子活力。

圖4 18 ℃發(fā)芽4 d早稻種子樣品脫落酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of ABA metabolism-related genes in rice seed after 4 days of germination at 18 ℃

3.2 低溫發(fā)芽過程中脫落酸與赤霉素含量與早稻種子活力的關(guān)系

赤霉素（GA）是調(diào)控水稻種子萌發(fā)的一類重要植物激素。GA 能打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，使種子在適宜的環(huán)境和合適的時間萌發(fā)，并為隨后的幼苗生長做準(zhǔn)備[14]。在18 ℃發(fā)芽4 d，12 個早稻種子樣品的內(nèi)源GA 含量與發(fā)芽率、田間出苗率無顯著相關(guān)關(guān)系。同一品種高低活力種子樣品之間也沒有統(tǒng)一的規(guī)律，這表明18 ℃發(fā)芽過程中GA與早稻種子活力對低溫脅迫的響應(yīng)關(guān)系尚不明確。

脫落酸（ABA）是另一類調(diào)控種子萌發(fā)的植物激素，也在低溫逆境中起到重要的調(diào)控作用。一般而言，高濃度的ABA 含量會誘導(dǎo)種子休眠，抑制種子萌發(fā)；而低溫下提高ABA 含量可以放大ABA 信號傳導(dǎo)，并誘導(dǎo)下游低溫響應(yīng)基因的表達(dá)，從而提高植物對低溫的抗性[15]。但也有研究表明，低溫脅迫下相對較低濃度的ABA 含量有利于提高水稻的低溫抗性。HUANG等研究表明，過表達(dá)OsNAC095提高了水稻內(nèi)源ABA含量，卻增強(qiáng)了水稻對低溫脅迫的敏感性[16]。本研究結(jié)果顯示，不同早稻品種高活力種子批中ABA含量均低于低活力種子批，且相關(guān)分析結(jié)果表明ABA含量與發(fā)芽率、田間出苗率呈顯著負(fù)相關(guān)，說明一定范圍內(nèi)低濃度的ABA含量有利于提高水稻種子在低溫條件下萌發(fā)的能力。與ABA 含量結(jié)果一致的是，熒光定量PCR 結(jié)果顯示，一系列ABA 合成相關(guān)基因（OsNCED1、OsNCED3、OsZEP1和OsAAO3）在低活力種子批中高度表達(dá)，而ABA分解相關(guān)基因在高活力種子批中高度表達(dá)，表明低溫脅迫可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控水稻種子ABA代謝，并進(jìn)一步影響水稻種子發(fā)芽能力。

圖5 18 ℃發(fā)芽4 d水稻種子脫落酸信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.5 Expression levels of ABA signal transduction-related genes in rice seed after 4 days of germination at 18 ℃

3.3 低溫發(fā)芽過程中脫落酸信號傳導(dǎo)與早稻種子活力的關(guān)系

水稻在長期的進(jìn)化過程中產(chǎn)生了一系列響應(yīng)低溫脅迫的機(jī)制。水稻響應(yīng)低溫脅迫的信號傳導(dǎo)過程主要包括不依賴ABA 的信號傳導(dǎo)途徑與依賴ABA 的信號傳導(dǎo)途徑。ABA 受體PYL、負(fù)調(diào)控因子PP2C、正調(diào)控因子SnRK2 與轉(zhuǎn)錄因子DREB 等組分共同組成了ABA 的信號通路[17-19]。水稻種子在遭受低溫脅迫后，內(nèi)源ABA與PYL受體結(jié)合，與PP2C 互作，并抑制PP2C 與SnRK2 的結(jié)合，SnRK2進(jìn)一步磷酸化DREB轉(zhuǎn)錄因子，最終誘導(dǎo)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)，從而完成水稻對低溫的響應(yīng)過程[15]。本研究結(jié)果顯示，ABA 受體合成基因OsPYL9與SNF1 相關(guān)的蛋白激酶2 基因OsSnRK2在高活力種子中表達(dá)量均高于低活力種子，而2C類蛋白磷酸酶基因OsPP2C2、OsPP2C3在高活力種子中表達(dá)量均顯著低于低活力種子。同時，ZLY06 高活力種子中轉(zhuǎn)錄因子OsDREB1c、OsDREB1f和OsDREB2a的表達(dá)量亦顯著高于低活力種子。TIAN 等研究表明，過表達(dá)ABA 受體合成基因OsPYL3和OsPYL9均能顯著提高水稻耐冷性[20]，本研究結(jié)果與此一致。水稻中過量表達(dá)DREB1 亞家族的OsDREB1D、OsDREB1F均能提高水稻對低溫的耐受性[21-22]。本試驗(yàn)與其他研究結(jié)果均表明，高表達(dá)豐度的ABA信號傳導(dǎo)基因可能是水稻種子在低溫脅迫下保持高水平種子活力的重要原因。

4 結(jié)論

本研究表明，18 ℃發(fā)芽4 d的發(fā)芽率可以準(zhǔn)確地預(yù)測早稻的田間出苗率，可作為測定早稻種子活力的有效指標(biāo)。而高低活力種子樣品之間ABA代謝、信號傳導(dǎo)及其對低溫脅迫響應(yīng)基因表達(dá)量的差異，可能是低溫脅迫下早稻種子活力差異的重要原因。