苗藥痛風(fēng)停對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥因子及滑膜病理的影響

安陽 鐘琴 劉正奇 馬武開 曹躍朋 徐暉 楊慶萬 項(xiàng)飛燕

【摘?要】?目的：探討苗藥痛風(fēng)停方對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥因子及關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)的影響。方法：建立痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，分設(shè)模型對(duì)照組、空白對(duì)照組、痛風(fēng)停低、中、高劑量組和秋水仙堿組，每組12只大鼠，空白對(duì)照組及模型組以等量生理鹽水灌胃，其余各組予等容積相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)給藥5d后收集標(biāo)本。觀察大鼠一般狀況表現(xiàn)，檢測(cè)外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8濃度，大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行病理染色檢測(cè)。結(jié)果：①模型組大鼠明顯動(dòng)作遲緩，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)量明顯減少，食量減少，精神萎靡，毛發(fā)無光澤。與模型組相比，痛風(fēng)停湯中、高劑量組與秋水仙堿組大鼠一般情況均較治療前明顯改善，關(guān)節(jié)腫脹減輕，進(jìn)食量較多，反應(yīng)良好，活動(dòng)量接近正常。②模型組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α顯著升高（P<0.05），與模型組比較，痛風(fēng)停低、中、高劑量組及秋水仙堿組血清炎癥因子均有不同程度降低（P<0.05），其中痛風(fēng)停高劑量組炎癥因子濃度低于秋水仙堿組（P<0.05）。③模型組滑膜組織增厚，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，血管增生;與模型組比較，痛風(fēng)停低劑量組滑膜增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)均較輕，痛風(fēng)停中、高劑量組滑膜增生則不明顯，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，秋水仙堿組與痛風(fēng)停低劑量組改變近似。結(jié)論：苗藥痛風(fēng)?？梢越档脱錓L-1、IL-6、IL-8、TNF-α濃度，抑制關(guān)節(jié)滑膜炎癥增生，有效控制關(guān)節(jié)炎癥。

【關(guān)鍵詞】?苗藥痛風(fēng)停;痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;動(dòng)物模型;炎癥

【中圖分類號(hào)】R29???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號(hào)】1007-8517（2019）24-0023-04

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（goutyarthritis，Gout）是尿酸鹽晶體沉積于人體內(nèi)所導(dǎo)致的一種炎性疾病，急性期以關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛為主要臨床特征，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、骨骼損毀，甚則等影響到內(nèi)臟器官功能，出現(xiàn)腎功能衰竭[1]。研究顯示尿酸鹽結(jié)晶作為炎癥激發(fā)因子，通過Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）信號(hào)途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，機(jī)體生成白細(xì)胞介素（Interleukin，IL）、腫瘤壞死因子ɑ（Tumor necrosis factor，TNF-ɑ）等多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎癥瀑布反應(yīng)[2]?！兜は姆ā分杏涊d：“痛風(fēng)者，四肢百節(jié)走痛，方書謂之白虎歷節(jié)風(fēng)證是也”，認(rèn)為是風(fēng)、熱、痰、濕相互膠結(jié)為患，阻滯經(jīng)脈氣血所致;苗醫(yī)認(rèn)為痛風(fēng)屬“熱經(jīng)病”，多由于“風(fēng)、熱、火、濕”等邪氣熾盛、血脈受阻，邪毒留滯筋骨所致，其認(rèn)識(shí)與祖國(guó)醫(yī)學(xué)殊途同歸。治療用藥上多以流轉(zhuǎn)氣血、清熱解毒、去除邪熱為法，達(dá)到“趕邪”的目的。我科于臨床中借鑒中醫(yī)、苗醫(yī)理論研創(chuàng)了“痛風(fēng)?！狈剑摲街腥卟?、大澤蘭、田七草、觀音草、芭蕉根等藥物屬苗醫(yī)藥范疇，能“趕邪祛毒、行血消腫”，配合石膏、虎杖、黃柏等藥物，達(dá)到活血散結(jié)、清熱解毒、利水消腫的目的，臨床中發(fā)現(xiàn)苗藥“痛風(fēng)?！狈侥茌^好的減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期炎性腫脹、疼痛。本研究通過建立大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，觀察痛風(fēng)停對(duì)血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子及關(guān)節(jié)滑膜組織的影響，探討苗藥痛風(fēng)停方對(duì)痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的抗炎作用機(jī)理。

1?實(shí)驗(yàn)材料

1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組?成年雄性SD大鼠72只，清潔級(jí)，體重（240±20）g，購(gòu)置于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，證號(hào)SCXK（京2013-0007）。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，同等飼養(yǎng)條件。按隨機(jī)數(shù)字分組方法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、痛風(fēng)停低劑量組、中劑量組、高劑量組和秋水仙堿對(duì)照組共6組，每組12只。

1.2?主要材料及設(shè)備?實(shí)驗(yàn)藥物苗藥痛風(fēng)停湯由三七草（銳徒清）30g、大澤蘭（銳米菜）15g、田七草（銳天梯）15g、觀音草（銳油沙）15g、芭蕉根30g等藥物組成（由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供）。對(duì)照藥物秋水仙堿片（北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20161001）;尿酸鈉（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：U2875-5G）;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)P0010S）;DBA、PV-9000（北京中杉金橋生物）;IL-1、IL-6、IL-8檢測(cè)ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究院）;切片機(jī)（德國(guó)萊卡，型號(hào)：RM2015），顯微鏡（日本奧林巴斯，型號(hào)：BX51T-PHD-J11）;低溫高速離心機(jī)（SCILOGEX，型號(hào)：D3024R）;自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀（美國(guó)BioTek公司）;脫色搖床（國(guó)立常州試驗(yàn)設(shè)備研究所）;超凈工作臺(tái)（蘇潔凈化有限公司）。

2?實(shí)驗(yàn)方法

2.1?藥物制備?將上述苗藥加水1000mL浸泡1h后煎煮30min，再加水500ml煎煮30min，兩煎混合過慮后濃縮至含生藥物1g/mL，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｇ锼蓧A取適量加蒸餾水配置成1g/mL混懸液，儲(chǔ)存待用。

2.2?造模方法?按照Mc Carty DJ的造模方法[4]，除空白對(duì)照組外，其余各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用20%烏拉坦（5mL/kg靜脈注射）麻醉，然后將大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍脫毛，消毒皮膚，輕彎曲膝關(guān)節(jié)，于關(guān)節(jié)正中或側(cè)方進(jìn)針，用6號(hào)注射針將尿酸鈉溶液10mg（0.4mL）及多粘菌素B 0.1mL（10U/mL）注入大鼠膝關(guān)節(jié)腔，制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。造模成功后，病變關(guān)節(jié)明顯腫脹、發(fā)熱，患肢活動(dòng)受限。

2.3?給藥方法?痛風(fēng)停方的成人（60kg）每日劑量為生藥1.25g/kg，根據(jù)人與大鼠體質(zhì)量確定大鼠的等效劑量為中劑量（7.5g/kg），等效劑量的1/2倍為低劑量（3.75g/kg），等效劑量的2倍為高劑量（15g/kg）。陽性藥對(duì)照組秋水仙堿取等效劑量30mg/kg[5]。從造模第1天開始，連續(xù)灌胃7d，每天分2次給藥，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組灌服等量生理鹽水。

2.4?觀測(cè)指標(biāo)

2.4.1?各組大鼠一般情況觀察，包括活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)、進(jìn)食、反應(yīng)能力等方面。

2.4.2?外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8濃度檢測(cè)?股動(dòng)脈采集外周血，離心后收集血清送檢，使用ELISA檢測(cè)方法對(duì)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明書步驟進(jìn)行操作。

2.4.3?關(guān)節(jié)滑膜組織病理檢測(cè)?取各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，經(jīng)固定后，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇處理至水洗，然后染色、固定。具體操作步驟嚴(yán)格參照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。

2.5?統(tǒng)計(jì)方法?采用SPSS22.0軟件分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

3?結(jié)果

3.1?一般情況?成功復(fù)制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，模型組大鼠明顯動(dòng)作遲緩，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)量明顯減少，食量減少，精神萎靡，毛發(fā)無光澤。與模型組相比，痛風(fēng)停湯中、高劑量組與秋水仙堿組大鼠一般情況均較治療前明顯改善，進(jìn)食量較多，反應(yīng)良好，活動(dòng)量接近正常。

3.2?痛風(fēng)停方能夠降低模型大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的濃度?比較各組大鼠外周血檢測(cè)結(jié)果，與空白組比較，造模組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，痛風(fēng)停低、中、高劑量組及秋水仙堿組均有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;痛風(fēng)停高劑量組檢測(cè)結(jié)果低于秋水仙堿組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。詳見表1。

3.3?各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理?與空白組比較，模型組滑膜組織增厚，大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，血管增生;與模型組比較，痛風(fēng)停低劑量組滑膜增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)均較輕，痛風(fēng)停中、高劑量組滑膜增生則不明顯，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，秋水仙堿組與痛風(fēng)停低劑量組改變近似。如圖1～6所示。

4?討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患病率逐年增加，發(fā)病年齡也趨向年輕化，而尿酸鹽是炎癥誘發(fā)的啟動(dòng)因素。研究顯示痛風(fēng)的發(fā)生機(jī)制較多，其中TLRs/MyD88炎癥通路較為集中[6]。機(jī)體內(nèi)尿酸鹽晶體暴露后誘導(dǎo)TLRs/MyD88通路激活，觸發(fā)組織細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8、干擾素γ等，誘使中性粒細(xì)胞脫顆粒和單核巨噬細(xì)胞聚集、吞噬[7-10]，并激活NF-κB炎癥通路[11]，使炎癥反應(yīng)持續(xù)放大。

IL是一類具有多重功效的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。IL-1是一種由單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞分泌，常常和TNF-α共同發(fā)揮“核心”致炎的作用，是痛風(fēng)主要的促炎因子[12];同時(shí)IL-1還誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附因子，使白細(xì)胞聚集于關(guān)節(jié)腔內(nèi)[13]。IL-6主要由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生，并刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，以激活效應(yīng)性T細(xì)胞，還可以誘導(dǎo)血管上皮細(xì)胞形成血管翳，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附因子[14]。IL-8是一種趨化性細(xì)胞因子，主要是由單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌，參與炎癥和體內(nèi)的免疫防御反應(yīng)。研究證實(shí)[15-16] 上述三種白介素在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。TNF-α主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放[17]，與IL-l、IL-6、IL-8形成聯(lián)動(dòng)，誘導(dǎo)炎癥呈瀑布樣發(fā)展。因此，我們認(rèn)為TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8等炎癥因子是在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)急劇發(fā)生發(fā)展的重要介質(zhì)，對(duì)上述炎癥介質(zhì)的抑制，是有效減輕痛風(fēng)炎癥的手段。

苗醫(yī)理論認(rèn)為痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎是由于各種原因?qū)е隆靶岸尽?、“風(fēng)毒”、“火毒”及“瘀毒”等侵襲所引起，屬于“熱經(jīng)病”范疇，治療當(dāng)予“趕毒”（瑪汝務(wù)翠）為法，痛風(fēng)停方源于苗族經(jīng)驗(yàn)方，由三七草（銳徒清）、大澤蘭（銳米菜）、田七草（銳天梯）、觀音草（銳油沙）、芭蕉根、虎杖、生石膏、黃柏等組成，全方具有祛邪解毒、活血化濁、清熱利水、消腫散結(jié)之效，可有效減輕痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)疼痛，可有效降低患者炎癥指標(biāo)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α濃度顯著升高，且滑膜組織增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，經(jīng)苗藥痛風(fēng)停治療后，能減輕大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，顯著降低外周血中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的濃度，并抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖，充分說明苗藥痛風(fēng)停通過抑制機(jī)體多種炎癥因子的釋放，從而控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。

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（收稿日期：2019-10-10?編輯：劉斌）