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    苗藥痛風(fēng)停對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥因子及滑膜病理的影響

    2019-02-05 06:17:14安陽鐘琴劉正奇馬武開曹躍朋徐暉楊慶萬項(xiàng)飛燕
    關(guān)鍵詞:痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型炎癥

    安陽 鐘琴 劉正奇 馬武開 曹躍朋 徐暉 楊慶萬 項(xiàng)飛燕

    【摘?要】?目的:探討苗藥痛風(fēng)停方對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥因子及關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)的影響。方法:建立痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型,分設(shè)模型對(duì)照組、空白對(duì)照組、痛風(fēng)停低、中、高劑量組和秋水仙堿組,每組12只大鼠,空白對(duì)照組及模型組以等量生理鹽水灌胃,其余各組予等容積相應(yīng)藥物灌胃,連續(xù)給藥5d后收集標(biāo)本。觀察大鼠一般狀況表現(xiàn),檢測(cè)外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8濃度,大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行病理染色檢測(cè)。結(jié)果:①模型組大鼠明顯動(dòng)作遲緩,反應(yīng)遲鈍,活動(dòng)量明顯減少,食量減少,精神萎靡,毛發(fā)無光澤。與模型組相比,痛風(fēng)停湯中、高劑量組與秋水仙堿組大鼠一般情況均較治療前明顯改善,關(guān)節(jié)腫脹減輕,進(jìn)食量較多,反應(yīng)良好,活動(dòng)量接近正常。②模型組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α顯著升高(P<0.05),與模型組比較,痛風(fēng)停低、中、高劑量組及秋水仙堿組血清炎癥因子均有不同程度降低(P<0.05),其中痛風(fēng)停高劑量組炎癥因子濃度低于秋水仙堿組(P<0.05)。③模型組滑膜組織增厚,大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),血管增生;與模型組比較,痛風(fēng)停低劑量組滑膜增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)均較輕,痛風(fēng)停中、高劑量組滑膜增生則不明顯,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少,秋水仙堿組與痛風(fēng)停低劑量組改變近似。結(jié)論:苗藥痛風(fēng)??梢越档脱錓L-1、IL-6、IL-8、TNF-α濃度,抑制關(guān)節(jié)滑膜炎癥增生,有效控制關(guān)節(jié)炎癥。

    【關(guān)鍵詞】?苗藥痛風(fēng)停;痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;動(dòng)物模型;炎癥

    【中圖分類號(hào)】R29???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號(hào)】1007-8517(2019)24-0023-04

    痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(goutyarthritis,Gout)是尿酸鹽晶體沉積于人體內(nèi)所導(dǎo)致的一種炎性疾病,急性期以關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛為主要臨床特征,最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、骨骼損毀,甚則等影響到內(nèi)臟器官功能,出現(xiàn)腎功能衰竭[1]。研究顯示尿酸鹽結(jié)晶作為炎癥激發(fā)因子,通過Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號(hào)途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),機(jī)體生成白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)、腫瘤壞死因子ɑ(Tumor necrosis factor,TNF-ɑ)等多種細(xì)胞因子,導(dǎo)致炎癥瀑布反應(yīng)[2]?!兜は姆ā分杏涊d:“痛風(fēng)者,四肢百節(jié)走痛,方書謂之白虎歷節(jié)風(fēng)證是也”,認(rèn)為是風(fēng)、熱、痰、濕相互膠結(jié)為患,阻滯經(jīng)脈氣血所致;苗醫(yī)認(rèn)為痛風(fēng)屬“熱經(jīng)病”,多由于“風(fēng)、熱、火、濕”等邪氣熾盛、血脈受阻,邪毒留滯筋骨所致,其認(rèn)識(shí)與祖國(guó)醫(yī)學(xué)殊途同歸。治療用藥上多以流轉(zhuǎn)氣血、清熱解毒、去除邪熱為法,達(dá)到“趕邪”的目的。我科于臨床中借鑒中醫(yī)、苗醫(yī)理論研創(chuàng)了“痛風(fēng)?!狈剑摲街腥卟?、大澤蘭、田七草、觀音草、芭蕉根等藥物屬苗醫(yī)藥范疇,能“趕邪祛毒、行血消腫”,配合石膏、虎杖、黃柏等藥物,達(dá)到活血散結(jié)、清熱解毒、利水消腫的目的,臨床中發(fā)現(xiàn)苗藥“痛風(fēng)?!狈侥茌^好的減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期炎性腫脹、疼痛。本研究通過建立大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型,觀察痛風(fēng)停對(duì)血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎癥因子及關(guān)節(jié)滑膜組織的影響,探討苗藥痛風(fēng)停方對(duì)痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的抗炎作用機(jī)理。

    1?實(shí)驗(yàn)材料

    1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組?成年雄性SD大鼠72只,清潔級(jí),體重(240±20)g,購(gòu)置于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司,證號(hào)SCXK(京2013-0007)。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于貴陽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,同等飼養(yǎng)條件。按隨機(jī)數(shù)字分組方法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、痛風(fēng)停低劑量組、中劑量組、高劑量組和秋水仙堿對(duì)照組共6組,每組12只。

    1.2?主要材料及設(shè)備?實(shí)驗(yàn)藥物苗藥痛風(fēng)停湯由三七草(銳徒清)30g、大澤蘭(銳米菜)15g、田七草(銳天梯)15g、觀音草(銳油沙)15g、芭蕉根30g等藥物組成(由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供)。對(duì)照藥物秋水仙堿片(北京嘉林藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):20161001);尿酸鈉(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):U2875-5G);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號(hào)P0010S);DBA、PV-9000(北京中杉金橋生物);IL-1、IL-6、IL-8檢測(cè)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究院);切片機(jī)(德國(guó)萊卡,型號(hào):RM2015),顯微鏡(日本奧林巴斯,型號(hào):BX51T-PHD-J11);低溫高速離心機(jī)(SCILOGEX,型號(hào):D3024R);自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀(美國(guó)BioTek公司);脫色搖床(國(guó)立常州試驗(yàn)設(shè)備研究所);超凈工作臺(tái)(蘇潔凈化有限公司)。

    2?實(shí)驗(yàn)方法

    2.1?藥物制備?將上述苗藥加水1000mL浸泡1h后煎煮30min,再加水500ml煎煮30min,兩煎混合過慮后濃縮至含生藥物1g/mL,儲(chǔ)存?zhèn)溆谩G锼蓧A取適量加蒸餾水配置成1g/mL混懸液,儲(chǔ)存待用。

    2.2?造模方法?按照Mc Carty DJ的造模方法[4],除空白對(duì)照組外,其余各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用20%烏拉坦(5mL/kg靜脈注射)麻醉,然后將大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)周圍脫毛,消毒皮膚,輕彎曲膝關(guān)節(jié),于關(guān)節(jié)正中或側(cè)方進(jìn)針,用6號(hào)注射針將尿酸鈉溶液10mg(0.4mL)及多粘菌素B 0.1mL(10U/mL)注入大鼠膝關(guān)節(jié)腔,制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。造模成功后,病變關(guān)節(jié)明顯腫脹、發(fā)熱,患肢活動(dòng)受限。

    2.3?給藥方法?痛風(fēng)停方的成人(60kg)每日劑量為生藥1.25g/kg,根據(jù)人與大鼠體質(zhì)量確定大鼠的等效劑量為中劑量(7.5g/kg),等效劑量的1/2倍為低劑量(3.75g/kg),等效劑量的2倍為高劑量(15g/kg)。陽性藥對(duì)照組秋水仙堿取等效劑量30mg/kg[5]。從造模第1天開始,連續(xù)灌胃7d,每天分2次給藥,模型對(duì)照組和空白對(duì)照組灌服等量生理鹽水。

    2.4?觀測(cè)指標(biāo)

    2.4.1?各組大鼠一般情況觀察,包括活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)、進(jìn)食、反應(yīng)能力等方面。

    2.4.2?外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8濃度檢測(cè)?股動(dòng)脈采集外周血,離心后收集血清送檢,使用ELISA檢測(cè)方法對(duì)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8進(jìn)行檢測(cè),嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明書步驟進(jìn)行操作。

    2.4.3?關(guān)節(jié)滑膜組織病理檢測(cè)?取各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織,經(jīng)固定后,常規(guī)石蠟包埋,4μm切片,常規(guī)用二甲苯脫蠟,經(jīng)各級(jí)乙醇處理至水洗,然后染色、固定。具體操作步驟嚴(yán)格參照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。

    2.5?統(tǒng)計(jì)方法?采用SPSS22.0軟件分析,計(jì)量資料以(x±s)表示,采用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)意義。

    3?結(jié)果

    3.1?一般情況?成功復(fù)制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型,模型組大鼠明顯動(dòng)作遲緩,反應(yīng)遲鈍,活動(dòng)量明顯減少,食量減少,精神萎靡,毛發(fā)無光澤。與模型組相比,痛風(fēng)停湯中、高劑量組與秋水仙堿組大鼠一般情況均較治療前明顯改善,進(jìn)食量較多,反應(yīng)良好,活動(dòng)量接近正常。

    3.2?痛風(fēng)停方能夠降低模型大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的濃度?比較各組大鼠外周血檢測(cè)結(jié)果,與空白組比較,造模組大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,痛風(fēng)停低、中、高劑量組及秋水仙堿組均有顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);痛風(fēng)停高劑量組檢測(cè)結(jié)果低于秋水仙堿組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

    3.3?各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理?與空白組比較,模型組滑膜組織增厚,大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),血管增生;與模型組比較,痛風(fēng)停低劑量組滑膜增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)均較輕,痛風(fēng)停中、高劑量組滑膜增生則不明顯,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少,秋水仙堿組與痛風(fēng)停低劑量組改變近似。如圖1~6所示。

    4?討論

    痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患病率逐年增加,發(fā)病年齡也趨向年輕化,而尿酸鹽是炎癥誘發(fā)的啟動(dòng)因素。研究顯示痛風(fēng)的發(fā)生機(jī)制較多,其中TLRs/MyD88炎癥通路較為集中[6]。機(jī)體內(nèi)尿酸鹽晶體暴露后誘導(dǎo)TLRs/MyD88通路激活,觸發(fā)組織細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8、干擾素γ等,誘使中性粒細(xì)胞脫顆粒和單核巨噬細(xì)胞聚集、吞噬[7-10],并激活NF-κB炎癥通路[11],使炎癥反應(yīng)持續(xù)放大。

    IL是一類具有多重功效的細(xì)胞因子,可由多種細(xì)胞產(chǎn)生,在炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。IL-1是一種由單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞分泌,常常和TNF-α共同發(fā)揮“核心”致炎的作用,是痛風(fēng)主要的促炎因子[12];同時(shí)IL-1還誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附因子,使白細(xì)胞聚集于關(guān)節(jié)腔內(nèi)[13]。IL-6主要由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生,并刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體,以激活效應(yīng)性T細(xì)胞,還可以誘導(dǎo)血管上皮細(xì)胞形成血管翳,激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上的粘附因子[14]。IL-8是一種趨化性細(xì)胞因子,主要是由單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌,參與炎癥和體內(nèi)的免疫防御反應(yīng)。研究證實(shí)[15-16] 上述三種白介素在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。TNF-α主要由單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì),能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,調(diào)節(jié)并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放[17],與IL-l、IL-6、IL-8形成聯(lián)動(dòng),誘導(dǎo)炎癥呈瀑布樣發(fā)展。因此,我們認(rèn)為TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8等炎癥因子是在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)急劇發(fā)生發(fā)展的重要介質(zhì),對(duì)上述炎癥介質(zhì)的抑制,是有效減輕痛風(fēng)炎癥的手段。

    苗醫(yī)理論認(rèn)為痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎是由于各種原因?qū)е隆靶岸尽?、“風(fēng)毒”、“火毒”及“瘀毒”等侵襲所引起,屬于“熱經(jīng)病”范疇,治療當(dāng)予“趕毒”(瑪汝務(wù)翠)為法,痛風(fēng)停方源于苗族經(jīng)驗(yàn)方,由三七草(銳徒清)、大澤蘭(銳米菜)、田七草(銳天梯)、觀音草(銳油沙)、芭蕉根、虎杖、生石膏、黃柏等組成,全方具有祛邪解毒、活血化濁、清熱利水、消腫散結(jié)之效,可有效減輕痛風(fēng)患者關(guān)節(jié)疼痛,可有效降低患者炎癥指標(biāo)[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α濃度顯著升高,且滑膜組織增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),經(jīng)苗藥痛風(fēng)停治療后,能減輕大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng),顯著降低外周血中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的濃度,并抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖,充分說明苗藥痛風(fēng)停通過抑制機(jī)體多種炎癥因子的釋放,從而控制痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。

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    (收稿日期:2019-10-10?編輯:劉斌)

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