耐藥性與敏感性阿薩希毛孢子菌感染小鼠病死率的對(duì)比研究

彭卓穎，田艷麗，廖 勇，郎德休，敖俊紅，楊蓉婭

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）是一種致病性較強(qiáng)的條件病原真菌，可廣泛存在于自然界中，也可定植于人體特定組織（皮膚和黏膜）[1,2]，其所致的播散性毛孢子菌感染的病死率可高達(dá)80%以上[3]。T.asahii對(duì)大部分常用抗真菌藥物敏感性不高或耐藥，僅對(duì)三唑類抗真菌藥敏感[4]。但是，近年來逐漸出現(xiàn)該菌對(duì)唑類藥物耐藥的報(bào)道[5,6]，因此，T.asahii唑類抗真菌藥耐藥方面的研究逐漸受到人們的關(guān)注。既往研究發(fā)現(xiàn)，T.asahii環(huán)境株與臨床株在致病性上存在一定差異[7]，但是并沒有耐藥株與敏感株在致病性方面的比較研究。本研究使用氟康唑?qū)Νh(huán)境和臨床敏感株進(jìn)行體外梯度濃度誘導(dǎo)耐藥，將所得的耐藥菌株及其親本菌株通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，最后觀察感染不同菌株小鼠病死率的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株T.asahii環(huán)境株CBS8904、臨床標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479 和近平滑念珠菌ATCC22019（藥敏質(zhì)控株）均購自荷蘭the Westerdijk Fungal Biodiversity Institute。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c雄性SPF級(jí)小鼠85只，體重18～20 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究中心。

1.1.3 主要試劑 蛋白胨、酵母粉（英國OXOID公司），葡萄糖（北京化學(xué)試劑有限公司），瓊脂（北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司），兩性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑（美國Sigma），卡泊芬凈（Cardinal Health），1640 干粉（sigma RB83），MOPS 干粉（amresco 0670）。

1.2 方法

1.2.1 耐藥菌株的梯度濃度誘導(dǎo) 將-80℃保存的菌株進(jìn)行復(fù)蘇并傳代，當(dāng)真菌狀態(tài)較好時(shí)（對(duì)數(shù)生長期），調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106CFU/ml。取0.1ml 菌懸液接種到5 ml 含氟康唑[藥物濃度1/2 最低抑菌濃度(MIC)值]的酵母膏胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)液中，35℃、150 r/min 震蕩培養(yǎng)，24 h 后離心富集細(xì)胞，接種于高濃度氟康唑YPD 中培養(yǎng)，藥物濃度由1/2 MIC 增加為MIC、MIC2……，直至YPD 培養(yǎng)液中MIC 為128 mg/L 時(shí)，菌株仍可生長，并進(jìn)行體外藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，如果菌株對(duì)氟康唑MIC 值＞64 μg/ml，此時(shí)判定敏感株被誘導(dǎo)為耐藥株[8]。

1.2.2 耐藥子代穩(wěn)定性測(cè)試 耐藥子代在無藥SDA培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)傳代，每3 代檢測(cè)其MIC 值，重復(fù)檢測(cè)3 次[8]。

1.2.3 小鼠感染模型的構(gòu)建 將標(biāo)準(zhǔn)株CBS8904、CBS2479 和氟康唑體外誘導(dǎo)的穩(wěn)定耐藥株8904R、2479R 制成濃度為3.2×107CFU/ml 的菌懸液，小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組每組20 只，每只小鼠尾靜脈注射0.3 ml 不同菌液；對(duì)照組5 只，每只小鼠尾靜脈注射0.3 ml 生理鹽水。記錄1 個(gè)月內(nèi)小鼠的存活情況，并對(duì)所有死亡小鼠進(jìn)行解剖，獲取腦、心、肝、脾、肺、腎等組織進(jìn)行組織病理檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 軟件作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株誘導(dǎo)耐藥的結(jié)果

2.1.1 藥敏結(jié)果 氟康唑誘導(dǎo)耐藥菌株在無沙堡藥培養(yǎng)基（SDA）上傳代多次，隨后進(jìn)行藥敏檢測(cè)，結(jié)果如表1 所示，與親代敏感株相比，耐藥株8904R 和2479R 對(duì)氟康唑的MIC 值明顯升高，對(duì)伊曲康唑和伏立康唑的MIC 值也有小幅度上升，而對(duì)兩性霉素B、氟胞嘧啶和卡泊芬凈的耐藥性基本未發(fā)生變化。其中，誘導(dǎo)所得環(huán)境耐藥菌株8904R 對(duì)氟康唑的MIC 值由0.25 μg/ml 上升為＞64 μg/ml，升高了256 倍以上；臨床耐藥株2479R 的MIC 值由0.5 μg/ml 上升為＞64 μg/ml，升高了128 倍以上。

表1 親代、誘導(dǎo)耐藥菌株體外藥敏的MIC值（μg/mL）

2.1.2 氟康唑誘導(dǎo)前后菌株的形態(tài)學(xué)改變 臨床敏感株CBS2479 表面顆粒狀凸起，呈放射狀分布，中間略厚；氟康唑誘導(dǎo)的耐藥株2479R 由菌絲相向酵母相轉(zhuǎn)化，表面光滑，邊緣可見少量放射狀菌絲分布。環(huán)境敏感株CBS8904 菌落與誘導(dǎo)所得8904R 均呈菌絲相，前者菌落呈放射狀分布，表面呈顆粒狀凸起，邊緣較整齊，菌落厚度均一；后者菌落表面呈粉末狀，中間部位凸出明顯，邊緣較?。▓D1）。

2.2 T.asahii小鼠感染模型的構(gòu)建

2.2.1 感染小鼠組織形態(tài)學(xué)改變 將死亡小鼠進(jìn)行解剖，獲取腦、心、肝、脾、肺、腎組織，觀察各組織形態(tài)學(xué)變化。對(duì)照組小鼠各臟器表面光滑，均無充血現(xiàn)象；分別感染CBS8904、CBS2479、8904R 和2479R 的實(shí)驗(yàn)組小鼠的組織形態(tài)學(xué)變化較一致，肝臟和腎臟的體積均明顯增大并出現(xiàn)水腫，組織表面可見散在點(diǎn)狀出血，其中肝臟表面可見大量針尖至粟粒大小膿性結(jié)節(jié)（圖2），腦、心、脾、肺等組織形態(tài)與對(duì)照組相同，未見明顯差異。

2.2.2 感染小鼠組織病理學(xué)變化 在感染小鼠的組織中，肝臟和腎臟的形態(tài)學(xué)變化最明顯，因此對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟和腎臟進(jìn)行組織病理學(xué)HE 染色及亮綠染色。觀察染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染CBS8904、CBS2479、8904R 和2479R 的實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟和腎臟內(nèi)均發(fā)現(xiàn)大量孢子（圖3），但各實(shí)驗(yàn)組肝臟和腎臟內(nèi)孢子的數(shù)量及分布并未發(fā)現(xiàn)明顯差異。

圖1 T.asahii 誘導(dǎo)前后菌株的形態(tài)學(xué)差異

2.3 小鼠被不同菌株感染后死亡情況

分別將環(huán)境敏感株CBS8904、環(huán)境耐藥株8904R、臨床敏感株CBS2479 和臨床耐藥株2479R 菌懸液通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)；對(duì)照組注射等量生理鹽水。通過對(duì)小鼠存活數(shù)量的統(tǒng)計(jì)計(jì)算出CBS8904 組與8904R 組小鼠生存率分別為45% 和55%，CBS2479 組 與2479R組生存率分別為20%和60%。從圖4 中可以看出，感染環(huán)境敏感株與環(huán)境耐藥株導(dǎo)致的小鼠死亡率之間無顯著差異（P＞0.05），而感染臨床敏感株小鼠的死亡率明顯高于臨床耐藥株感染小鼠（P＜0.05）。

3 討論

獲取穩(wěn)定的耐藥菌株對(duì)于真菌耐藥機(jī)制的研究十分重要，毛孢子菌病發(fā)病率較低，臨床耐藥株較難獲取，與用物理或化學(xué)方法誘導(dǎo)的基因突變所導(dǎo)致的耐藥相比，體外梯度誘導(dǎo)耐藥的方法所得的耐藥株及敏感親本株更接近臨床耐藥株產(chǎn)生的過程[9,10]。筆者選取環(huán)境敏感株CBS8904 和臨床敏感株CBS2479，采用MIC 值梯度濃度升高的方法用氟康唑?qū)? 株菌進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥并檢測(cè)菌株藥物敏感性，將誘導(dǎo)后的菌株在無藥的SDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行多次傳代，然后對(duì)其耐藥表型的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。CBS8904 菌株經(jīng)體外誘導(dǎo)耐藥后對(duì)氟康唑的MIC 值與誘導(dǎo)前相比升高了256 倍以上，而且誘導(dǎo)后的CBS2479 對(duì)氟康唑的MIC值也升高了128 倍以上，成功獲得穩(wěn)定的環(huán)境耐藥株8904R 和臨床耐藥株2479R。2 株菌誘導(dǎo)后對(duì)其他唑類抗真菌藥MIC 值輕度上升，未表現(xiàn)出明顯的交叉耐藥。

唑類藥物的耐藥機(jī)制主要有3 種[11]：第1 種是耐藥真菌細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的過度表達(dá)，其中包括ABC 超家族和異化擴(kuò)散載體超家族；第2 種是真菌生物膜的形成，這種情況會(huì)使真菌對(duì)多種唑類藥物產(chǎn)生耐藥，因此是交叉耐藥的主要機(jī)制；第3 種是唑類藥物的靶酶羊毛甾醇14-α-去甲基化酶的變異，此酶是由ERG11基因所編碼，有研究發(fā)現(xiàn)ERG11基因上的R467K 突變可降低靶酶對(duì)氟康唑的親和力，從而導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生[12]。本實(shí)驗(yàn)中氟康唑誘導(dǎo)出的耐藥菌株并未對(duì)伏立康唑和伊曲康唑產(chǎn)生交叉耐藥，推測(cè)其耐藥機(jī)制應(yīng)該屬于第3 種情況，但是本推測(cè)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2 對(duì)照組與感染組小鼠肝臟與腎臟的形態(tài)學(xué)改變

圖3 感染小鼠內(nèi)臟組織病理

圖4 不同菌株感染組小鼠生存曲線圖

環(huán)境敏感株CBS8904 被氟康唑誘導(dǎo)為8904R 后的形態(tài)并未發(fā)生明顯變化，均為菌絲相；而由氟康唑誘導(dǎo)后的臨床株CBS2479 則由表面粗糙、呈放射狀分布的菌絲相變?yōu)楸砻婀饣慕湍赶?。隨后將所得耐藥菌株及其親本菌株通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，觀察小鼠死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CBS8904 和8904R 對(duì)小鼠的病死率無明顯差異，而2479R 對(duì)小鼠的病死率卻明顯低于CBS2479。由以上結(jié)果可知，在微進(jìn)化作用下CBS2479 菌株的形態(tài)發(fā)生改變，而且致病性減弱；但環(huán)境株CBS8904 的形態(tài)與致病性卻未發(fā)生明顯變化。有研究表明，生物膜的形成與菌株的毒力、耐藥性以及宿主免疫逃逸機(jī)制等方面均有密切聯(lián)系，而菌絲和關(guān)節(jié)孢子是構(gòu)成生物膜的主要結(jié)構(gòu)[13-15]。據(jù)此可以推斷，2479R 菌株菌絲形成減少，其生物膜的構(gòu)建能力被削弱，可能是使菌株毒力下降的主要原因。但是，菌株耐藥引起的毒力變化呈多樣性[16]，耐藥性與致病性之間關(guān)系復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為單一菌株的初步結(jié)果，需要增加環(huán)境來源以及臨床來源的菌株做進(jìn)一步研究和證實(shí)，機(jī)制有待更深入的研究。

綜上所述，體外誘導(dǎo)出的環(huán)境耐藥株8904R 和臨床耐藥株2479R 與其親本在形態(tài)上均有明顯差異，其中2479R 菌株轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍赶啵辉谥虏⌒苑矫?，環(huán)境敏感株與氟康唑誘導(dǎo)出的環(huán)境耐藥株之間無明顯差異，而誘導(dǎo)出的臨床耐藥株的毒力明顯低于敏感株，這可能與菌株的形態(tài)變化有關(guān)。雖然本實(shí)驗(yàn)中臨床T.asahii耐藥菌株的毒力降低，但是隨著耐藥菌株的進(jìn)化，毒力較強(qiáng)的菌株仍有可能會(huì)出現(xiàn)，因此規(guī)范臨床用藥，避免耐藥菌株的產(chǎn)生仍然非常重要；而且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究T.asahii對(duì)唑類藥物耐藥的機(jī)制以及其形態(tài)學(xué)與毒力之間的關(guān)聯(lián)奠定了良好基礎(chǔ)，并為臨床的相關(guān)研究提供了有利的依據(jù)。