女貞子體外抗氧化活性有效部位制備和篩選

江洪波 張志強(qiáng) 梁雪蘭 夏清

摘 要：目的：制備和篩選女貞子的抗氧化活性有效部位。方法：用乙酸乙酯萃取，柱層析和大孔樹脂分離技術(shù)，分為不同部分，并進(jìn)行DPPH·自由基的清除能力測(cè)試，評(píng)價(jià)各部抗氧化活性。結(jié)果：每個(gè)部位都不同程度具有抗氧化活性，石油醚萃取部分B活性最低，從乙酸乙酯得到的H部分抗氧化活性最高。結(jié)論：抗氧化活性最高的化合物存在于H部分。

關(guān)鍵詞：女貞子;DPPH;抗氧化;有效部位

女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實(shí)，具有養(yǎng)陰氣、平肝火、健腰膝、壯筋骨、滋補(bǔ)肝腎、烏須發(fā)等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明許多慢性疾病都與人體內(nèi)累積過多的氧自由基有關(guān)，從中藥中尋找具有抗氧化的活性成分是一條相對(duì)安全的途徑，近年研究發(fā)現(xiàn)女貞子及其化學(xué)成分具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)為篩選女貞子抗氧化活性部位，應(yīng)用溶劑提取法和萃取法、硅膠柱色譜法、大孔吸附樹脂分為12個(gè)部位A～L，通過DPPH·自由基的清除能力測(cè)試各個(gè)部位抗氧化能力，以期從中篩選出抗氧化的活性部位，為女貞子深度開發(fā)和新藥研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

女貞子藥材采自四川綿陽(yáng)四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校校內(nèi)（樣品保存于四川中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，編號(hào)NZZ2012）。

1.2 方法

1.2.1 DPPH·自由基的清除能力測(cè)試方法

取適量樣品溶于95%乙醇，配制成1mg·mL-1的溶液。準(zhǔn)確稱取20mg DPPH，溶于95%乙醇并定容于250mL容量瓶中，配制成濃度為2×10-4mol·L-1DPPH的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｍ?0mL比色管中依次加入4 mL pH6.86標(biāo)準(zhǔn)混合磷酸鹽緩沖液、4mL 2×10-4mol·L-1的DPPH溶液，搖勻。再加入1mL濃度為1mg·mL-1的樣品溶液，用蒸餾水補(bǔ)充體積至10.00mL 刻度，充分混勻，10min后用95%乙醇作參比在520nm處測(cè)定其吸光度。按照以下公式計(jì)算樣品對(duì)DPPH·自由基的清除率：

式中，Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度;Aj為不加DPPH，只加抗氧化劑及水的溶液的吸光度;Ac為不加抗氧化劑，只加D P P H及水的溶液的吸光度。

1.2.2 女貞子的粗提和DPPH·自由基的清除能力測(cè)試

取女貞子8.7kg粉碎，過1號(hào)篩，等體積甲醇浸提（48小時(shí)）3次，合并提取液。60℃減壓濃縮得浸膏（A）1.8kg。取適量甲醇提取物（A）溶于95%乙醇，配制成1mg·mL-1的溶液。按照1.2.1項(xiàng)方法測(cè)試抗氧化活性，其濃度為0.1mg·mL-1時(shí)，DPPH·自由基的清除率為46.20%。

1.2.3 女貞子提取物的萃取分離和DPPH·自由基的清除能力測(cè)試

浸膏用水混懸，分別用等體積石油醚（60～90℃）、等體積乙酸乙酯和等體積正丁醇依次萃取三次，60℃減壓濃縮分別得到110g石油醚萃取物（B）、325 g 乙酸乙酯萃取物（C）、613g正丁醇萃取物（D）和730g水溶性成分（E）。

石油醚萃取物的DPPH·自由基的清除率為11.49%，乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余水溶性成分的DPPH·自由基的清除率分別為69.28%，62.97%，58.61%。由此可見通過萃取方法分離，乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余水溶性成分的抗氧化活性最高，乙酸乙酯萃取物相對(duì)于甲醇提取物46.20%的清除率，活性提高近百分之五十。

1.2.4 乙酸乙酯萃取物分離和DPPH·自由基的清除能力測(cè)試

將乙酸乙酯萃取物加熱溶于無水乙醇，靜置析出沉淀，過濾并用無水乙醇洗滌得F，200g。剩余部分約90克拌樣上硅膠（100-200目，1kg）柱，氯仿-甲醇梯度洗脫得G，H，I部分。G，H，I部的DPPH·自由基的清除率分別為19.48%，62.80%，71.98%，65.22%。

1.2.5正丁醇萃取物分離和DPPH·自由基的清除能力測(cè)試

將正丁醇萃取物溶于適量水中，用預(yù)處理好的D101大孔樹脂0.75kg室溫吸附24小時(shí)，最后完全吸附。分別用水，40%乙醇和無水乙醇洗脫，得到J，K和L部位的DPPH·自由基的清除率分別為66.54%，66.35%，35.47%。

2 結(jié)果

測(cè)試結(jié)果顯示，通過萃取、層析等方法得到的女貞子各個(gè)部位均具有抗氧化活性。其中通過分離純化后G，H，I，J，K部分的DPPH·自由基的清除率均大于62.00%，抗氧化活性相對(duì)于甲醇粗提物A活性提高了近50%。而等濃度（0.1mg·mL-1）的維生素C，沒食子酸和綠茶多酚的DPPH·自由基的清除率分別為19.96%，65.54%，53.42%，可見G，H，I，J，K部位具有顯著的抗氧化活性。F部位的抗氧化活性雖然只有19.48%，但其總含量大，占乙酸乙酯萃取物部分的62%。女貞子的醇提物有顯著的抗氧化活性，通過萃取得到的乙酸乙酯部分和正丁醇部分抗氧化活性顯著。其中乙酸乙酯部分三萜含量最高，含量可達(dá)60%，雖然三萜類抗氧化活性相對(duì)較低，但由于量大，在女貞子整體抗氧化中有一定作用。乙酸乙酯萃取物的G，H，I部分抗氧化活性顯著，比等濃度（0.1mg·mL-1）的維生素C，沒食子酸和綠茶多酚強(qiáng)，其中部位H的 DPPH·自由基的清除率高達(dá)71.98%。G，H，I部分主要是黃酮類成分，但占提取物的比例較小。正丁醇萃取部純化部分J，K（0.1mg·mL-1）的 DPPH·自由基的清除率均大于66%，同樣比等濃度（0.1mg·mL-1）的維生素C，沒食子酸和綠茶多酚強(qiáng)。

3 討論

女貞子在我國(guó)分布廣泛，資源豐富，主要含有三萜類化合物、黃酮類、裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和對(duì)羥基苯乙醇苷類化合物。

通過分離篩選得到的幾個(gè)有效部位都有較強(qiáng)的抗氧化活性，強(qiáng)于同濃度的維生素C，沒食子酸和綠茶多酚，為女貞子抗氧化活性成分的研究和深度開發(fā)研究提供了參考依據(jù)。其中黃酮類化合物部分H抗氧化活性最強(qiáng)，我們將繼續(xù)研究，希望從中分離得到抗氧化活性較強(qiáng)的單體或其組合物。

基金項(xiàng)目：四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校項(xiàng)目基金：女貞子抗氧化活性部位制備工藝研究（16ZRYB04），女貞子抗衰老研究（17ZRYB03）

作者簡(jiǎn)介：江洪波（1976-），男，副教授，主要從事中藥活性成分研究工作。

通訊作者：張志強(qiáng)，研究方向：中藥活性成分研究。