下一代測(cè)序技術(shù)在胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

謝美娟 楊學(xué)習(xí) 李明

?綜 述?

下一代測(cè)序技術(shù)在胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用

謝美娟 楊學(xué)習(xí) 李明★

以下一代測(cè)序技術(shù)（next?generation sequencing，NGS）為代表的基因組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展給全面深度的染色體篩查和基因診斷提供了機(jī)會(huì)。NGS也迅速應(yīng)用于胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（preimplantation genetic screening，PGS）臨床檢測(cè)中，成為常規(guī)檢測(cè)技術(shù)，經(jīng)濟(jì)與可靠使其具有更廣闊的應(yīng)用前景。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）技術(shù)的進(jìn)步使得NGS在PGD和PGS的臨床應(yīng)用中能夠更加全面了解植入前胚胎的遺傳學(xué)信息，可以檢測(cè)到更加細(xì)微的差異；基于NGS技術(shù)的PGS和PGD將給移植成功率和試管嬰兒（in?vitrofertilization，IVF）出生率帶來明顯提升。本文主要介紹PGD/PGS的定義、傳統(tǒng)的PGD/PGS檢測(cè)技術(shù)，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)以及NGS在PGD/PGS中的應(yīng)用。

胚胎植入前診斷；胚胎植入前篩查；下一代測(cè)序

2015年12月 9日《Reproductive Biology and Endocrinology》雜志報(bào)道了輔助生殖技術(shù)（assisted reproduction techniques，ART）生育治療的國(guó)際調(diào)查結(jié)果，與前2年相比，不孕患者的數(shù)量逐年上升［1］；盡管體外受精?胚胎移植（in vitrofertilization and embryo transfer，IVF?ET）可以用于不孕的治療，但這個(gè)過程還是低效的，成功率仍然較低。胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)主要包括胚胎植入前遺傳學(xué)診 斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）和胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（preimplantation genet?ic screening，PGS），是指在人工輔助生殖過程中，對(duì)胚胎進(jìn)行種植前活檢和遺傳學(xué)分析，以選擇無遺傳學(xué)疾病的胚胎植入子宮，從而獲得正常胎兒的診斷/篩查方法。這2種技術(shù)建立在IVF基礎(chǔ)之上，可直接篩除有問題的、不健康的胚胎，挑選正常的胚胎植入子宮，可阻斷致病基因的縱向傳遞，降低反復(fù)流產(chǎn)率，提高患者的臨床妊娠率，避免因引產(chǎn)給孕母帶來的身心創(chuàng)傷。PGD和PGS作為ART 的工具應(yīng)用也在逐漸增多［2?6］。本文主要介紹PGD/PGS的定義、傳統(tǒng)的PGD/PGS檢測(cè)技術(shù)、單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)（whole genome amplifica?tion,WGA）技術(shù)以及下一代測(cè)序基因組擴(kuò)增技術(shù)（next?generation sequencing，NGS）在 PGD/PGS 中的應(yīng)用。

作者單位：南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

1 PGD/PGS概況

早在60年代，Edwards就提出了胚胎植入前遺傳學(xué)診斷的設(shè)想［7］，直到 1990 年 Handyside等［8］對(duì)1例性連鎖遺傳病夫婦成功地進(jìn)行了PGD，并獲得妊娠，標(biāo)志著PGD應(yīng)用于輔助生殖臨床的開始。PGD是通過對(duì)早期胚胎部分細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)分析和篩查，將無遺傳病的胚胎移植入宮腔，從而獲得健康的胎兒。我國(guó)第一例PGD在2000年由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院莊廣倫實(shí)驗(yàn)室完成，隨后姚元慶團(tuán)隊(duì)也在這方面陸續(xù)有報(bào)道［9］；PGD發(fā)展至今，其診斷的疾病種類也在逐漸增加，從最初對(duì)單基因遺傳病的診斷到染色體異常、人類腫瘤易感基因的分析、線粒體病、人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）配型胚胎的檢測(cè)等［2］。

PGS又稱“PGD?非整倍體篩查”，是指運(yùn)用PGD相同的技術(shù)手段檢測(cè)早期胚胎染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)，從而挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低多胎妊娠。研究發(fā)現(xiàn)，隨著女性年齡的增長(zhǎng)，胚胎染色體異常的發(fā)生率逐年增高［10］，胚胎中的染色體異常是造成IVF反復(fù)失敗和早期流產(chǎn)的重要原因［11?12］。因此，PGS 主要針對(duì)的人群為女方高齡、不明原因反復(fù)流產(chǎn)、IVF反復(fù)失敗以及男性導(dǎo)致的不孕不育等。自Munné等［13］在1993年第一次報(bào)道了對(duì)胚胎進(jìn)行PGS以后，經(jīng)PGS誕生的嬰兒也越來越多［14?15］。

2 傳統(tǒng)的PGD/PGS檢測(cè)技術(shù)

首例成功誕生的經(jīng)PGD合并表型正常的嬰兒采用的是PCR技術(shù)，該技術(shù)主要用于性別和單基因病的診斷，然而該技術(shù)存在著5%～20%的等位基因脫扣發(fā)生率［16］。熒光原位雜交（fluorescentin si?tuhybridization，F(xiàn)ISH）作為最初PGD/PGS標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于染色體檢測(cè)，可以篩選出染色體正常的胚胎，使得更多的不孕夫婦孕育了自己的健康后代［17］。此方法簡(jiǎn)單快速，但由于探針的交叉影響并不能一次全面地檢測(cè)所有染色體。而且容易受到細(xì)胞固定和信號(hào)重疊等因素的影響，導(dǎo)致分辨率和準(zhǔn)確率降低。隨后，為了填補(bǔ)分子遺傳學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)間的空白，比較基因組雜交（compara?tive genomic hybridization，CGH）技術(shù)出現(xiàn)，其優(yōu)點(diǎn)是可以分析全部染色體，臨床上很多生殖中心采用該方法對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生非整倍體胚胎的夫婦進(jìn)行胚胎染色體非整倍性改變的全面檢測(cè)［18］以及PGD［19］。但它分析時(shí)間長(zhǎng)，不能檢測(cè)出多倍體，也不能檢出平衡的、復(fù)雜的染色體畸變。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片技術(shù)可檢測(cè)全部染色體非整倍體和部分單基因遺傳病，并為每枚胚胎提供獨(dú)特的DNA圖譜；但其耗時(shí)過長(zhǎng)，且成本高、數(shù)據(jù)分析困難?？傮w來說，CGH和SNP芯片技術(shù)的臨床應(yīng)用在一定程度上改善了不孕夫婦的臨床結(jié)局［20?21］，但這些技術(shù)又有各自的局限。隨著眾多報(bào)道［22?23］NGS 應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查得到了高檢出率與準(zhǔn)確度，學(xué)者們開始考慮將NGS應(yīng)用于PGD/PGS，以選出優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行植入。

3 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)

NGS是單細(xì)胞水平上對(duì)基因組進(jìn)行測(cè)序的利器，WGA是下一代測(cè)序在PGD和PGS臨床應(yīng)用的關(guān)鍵一步，其高度均一性和保真度是精確測(cè)定拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）和單核苷酸變異（single nucleotide variants，SNV）等基因組變異的必要條件。WGA與測(cè)序技術(shù)結(jié)合能夠全面了解胚胎植入前的遺傳學(xué)信息，但擴(kuò)增產(chǎn)量及SNV識(shí)別假陽性及假陰性的能力限制了當(dāng)前流行的WGA方法。WGA技術(shù)發(fā)展至今主要分為2種類型：基于熱循環(huán)以PCR為基礎(chǔ)的WGA技術(shù)，如簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucle?otide primer PCR，DOP?PCR）、連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR（ligation mediated PCR，LM?PCR）、擴(kuò)增前引物延伸反應(yīng)（primer extension pre?amplification，PEP）以及多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（multiple an?nealing and looping?based amplification，MALBAC）技術(shù)等；基于等溫反應(yīng)不以PCR為基礎(chǔ)的WGA技術(shù)，如多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplifi?cation，MDA）。這里主要介紹臨床上較為常用的2種單細(xì)胞WGA技術(shù)，MDA和MALBAC。

3.1 MDA

MDA的原理是六聚體引物與變性DNA隨機(jī)結(jié)合，在等溫以及Phi 29聚合酶作用下，發(fā)生鏈置換合成反應(yīng)，每個(gè)置換后的單鏈作為模板，與引物結(jié)合，可擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA。MDA作為一種可獲得高產(chǎn)量以及高保真產(chǎn)物的WGA方法，減少擴(kuò)增偏倚，而且產(chǎn)物片段大小高于其他PCR方法，該方法在2002年首次被報(bào)道［24］。MDA具有產(chǎn)量高、擴(kuò)增片段長(zhǎng)（平均片段長(zhǎng)度可達(dá)10 kb）、均一性好、保真性高、覆蓋率高等優(yōu)點(diǎn)；但是也有報(bào)道其存在一定的缺陷：受細(xì)胞模板起始量影響大，當(dāng)擴(kuò)增模板起始量極少時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物的覆蓋率、準(zhǔn)確度下降［25］；還存在一定的等位基因脫扣（allele drop?out，ADO）率且其ADO率也與起始模板量有關(guān)［26］。MDA方法部分程度上解決了擴(kuò)增偏向的問題，實(shí)現(xiàn)了比PCR更均一的擴(kuò)增，該酶的高保真性也阻止了錯(cuò)誤的進(jìn)一步擴(kuò)大。

3.2 MALBAC

2012年，哈佛大學(xué)謝曉亮在《Science》上發(fā)表了單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增新技術(shù)MALBAC，即多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)［27］。MALBAC利用特殊的引物，使得擴(kuò)增子結(jié)尾互補(bǔ)成環(huán)，防止了DNA的指數(shù)性擴(kuò)增，解決了擴(kuò)增偏倚，同時(shí)保持了90%以上的基因組擴(kuò)增覆蓋度，使得檢測(cè)單細(xì)胞中較小的DNA序列變異變得更容易，分辨率提高，可以檢測(cè)單基因突變，以及同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因。2014年9月世界上首例經(jīng)MALBAC基因組擴(kuò)增高通量測(cè)序進(jìn)行單基因遺傳病篩查的試管嬰兒在北京大學(xué)第三醫(yī)院誕生。MALBAC技術(shù)具有單細(xì)胞的基因測(cè)序覆蓋率高（能夠達(dá)到93%）、ADO率低、擴(kuò)增偏倚低以及單細(xì)胞擴(kuò)增起始模板量低等優(yōu)點(diǎn)；但其也存在一定的缺點(diǎn)，比如DNA酶保真性較低，因此DNA復(fù)制時(shí)錯(cuò)誤率較高，這樣會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。此外，謝曉亮等［28］在2015年9月又發(fā)表其單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)新成果，他們開發(fā)出了一種基于乳液的擴(kuò)增方法來抑制擴(kuò)增偏移檢測(cè)單細(xì)胞拷貝數(shù)變異（CNV），同時(shí)以高精確度檢測(cè)單核苷酸變異（SNV）。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)解決了用組織樣本測(cè)序時(shí)或樣本少無法解決的細(xì)胞異質(zhì)性難題。

對(duì)于MDA和MALBAC技術(shù)的優(yōu)劣，業(yè)界還沒有統(tǒng)一的定論，在低深度測(cè)序中（25×），兩者的覆蓋度均可，均一度各執(zhí)說法。關(guān)于2種方法優(yōu)劣的比較分析已有文獻(xiàn)報(bào)道［29?30］，可基于特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的擴(kuò)增方法，對(duì)于CNV的檢測(cè)可以選用MALBAC，而MDA則由于其高保真性可用于SNV的檢測(cè)。

4 NGS在PGD/PGS中的應(yīng)用

Audibert等［1］的調(diào)查結(jié)果也顯示參與調(diào)查的生育學(xué)家們期望更多的使用PGD、PGS和其他提高著床率的技術(shù)。隨著胚胎發(fā)展實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)及PGD/PGS技術(shù)的出現(xiàn)，胚胎選擇成為不孕治療最有發(fā)展前景的領(lǐng)域。目前，NGS技術(shù)具有數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度更高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性更好等優(yōu)勢(shì)，且隨著其價(jià)格不斷下降，其在PGD/PGS方面已經(jīng)有了一定的應(yīng)用，也是被認(rèn)可的技術(shù)，只是方法學(xué)上仍在不斷改進(jìn)。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)的不斷進(jìn)步，使得單基因遺傳病和染色體病可以同時(shí)進(jìn)行診斷，這對(duì)一個(gè)胚胎的篩選有了相對(duì)更為精準(zhǔn)的結(jié)果，進(jìn)而提高篩選后再植入的成功率。近幾年，利用低通量全基因組測(cè)序以及針對(duì)致病基因進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域靶向捕獲的NGS應(yīng)用于PGD/PGS的成功案例報(bào)道逐漸增多。Treff等運(yùn)用下一代測(cè)序技術(shù)對(duì)多種單基因病如囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）、沃克華寶綜合癥（Walker?Warburg syndrome，WWS）、家族性自律神經(jīng)失調(diào)（familial dysautonomia，F(xiàn)D）、抗維生素D性佝僂病（vitamin D?resistant rickets，VDRR）、神經(jīng)纖維瘤（neurofibromatosis1，NF1）等進(jìn)行PGD，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法相比可靠性達(dá)到100%［31］；國(guó)內(nèi)也有許多的成功案例被報(bào)道：姚元慶團(tuán)隊(duì)采用下一代測(cè)序技術(shù)分析單細(xì)胞水平的染色體拷貝變化，選擇正常胚胎植入，于2014年9月順利分娩健康女嬰［32］。謝曉亮、喬杰、湯富酬團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上首次建立了一種采用下一代測(cè)序同時(shí)進(jìn)行突變位點(diǎn)、染色體異常、以及連鎖分析檢測(cè)的方法，并利用該技術(shù)成功幫助2個(gè)病例（一例是常染色體顯性遺傳疾病，另一例是發(fā)生在X染色體上的隱性遺傳疾?。?，進(jìn)行胚胎篩選后，這2對(duì)夫婦均已得到健康的后代［33］。2013年，我國(guó)湘雅醫(yī)院團(tuán)隊(duì)報(bào)道了采用NGS檢測(cè)囊胚的PGS成功病例［34］；2014年Fiorentino等［35］則對(duì)190例卵裂球WGA產(chǎn)物進(jìn)行染色體非整倍體CGH與NGS檢測(cè)方法的比較，結(jié)果表明NGS有高度的一致性，相比之下在成本和精確性上，NGS更有優(yōu)勢(shì)。到目前為止，NGS應(yīng)用于胚胎植入前非整倍體改變篩查中的價(jià)值已得到證實(shí)。這些成功案例均表明NGS技術(shù)應(yīng)用于PGD/PGS已經(jīng)比較成熟。但同時(shí)NGS在PGD/PGS中的應(yīng)用還受到一定限制，例如暫時(shí)還不具備檢測(cè)嵌合型的胚胎、單親二倍體以及檢測(cè)分辨率有限等，有待于測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步完善，或者聯(lián)合其他技術(shù)手段達(dá)到最佳的診斷。另一方面，NGS在PGD/PGS中的應(yīng)用依賴于WGA技術(shù)的進(jìn)步，而WGA還存在一定程度的ADO、擴(kuò)增偏倚等問題，因此，需要更多的探索來改進(jìn)現(xiàn)有的技術(shù)，更多的研究來進(jìn)一步明確其診斷價(jià)值。

5 展望

一直以來，PGD/PGS活檢的遺傳物質(zhì)從卵子的第一極體、第二極體、卵裂期胚胎的卵裂球到囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，都存在著爭(zhēng)議；極體活檢被認(rèn)為僅能反映母方的遺傳信息且容易發(fā)生退化影響診斷效率；卵裂期以及囊胚期胚胎則存在著高嵌合率等，此外，PGD/PGS是通過侵入性操作獲得診斷結(jié)果，其對(duì)子代的影響還需要長(zhǎng)期大樣本的隨訪。因此，研發(fā)一種安全又有效的篩查技術(shù)十分必要。以謝曉亮帶領(lǐng)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)宣布了全球首例接受無創(chuàng)胚胎染色體篩查（non?invasive chromosome screening，NICS）的試管嬰兒于無錫市婦幼保健院生殖中心健康誕生。無創(chuàng)PGS/PGD技術(shù)的出現(xiàn)，將徹底解決因?yàn)榕咛セ顧z存在的安全爭(zhēng)議，也意味著在不久的將來，可以更好的服務(wù)于臨床。2015年衛(wèi)計(jì)委婦幼保健服務(wù)司發(fā)布了《關(guān)于輔助生殖機(jī)構(gòu)開展高通量基因測(cè)序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷臨床應(yīng)用試點(diǎn)工作的通知》，審批通過了13家醫(yī)療機(jī)構(gòu)開展高通量基因測(cè)序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷（PGD）臨床試點(diǎn)，也意味著NGS將更加的普遍廣泛地用于臨床PGD/PGS。

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Application of the next generation sequencing technology in preimplantation genetic detection

XIE Meijuan，YANG Xuexi，LI Ming★
（School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

With the rapid development of genomics technology,next?generation sequencing(NGS)offered an opportunity for comprehensive chromosome screening and gene diagnosis.NGS can also be applied to preimplantation genetic diagnosis(PGD)and preimplantation genetic screening(PGS)and becomes a routine clinical detection technology.In addition,the economy and reliability of NGS makes it have a wider application prospects.The progress of whole genome amplification(WGA)of single cell leads to the clinical use of NGS in PGD and PGS more comprehensive to learn the genetic information of preimplantation embryos.The comprehensive chromosome screening and gene diagnosis for embryonic genome will improve the success rate of embryo transplantation and raise the birth rate,which makes NGS more and more irresistible in PGD and PGS.In this review,the PGD/PGS definition,technology of whole genome amplification and the application of NGS in PGD/PGS will be discussed.

Preimplantation genetic diagnosis;Preimplantation genetic screening;Next?generation sequencing

國(guó)家自然科學(xué)基金（81302327）；廣州市重大科技攻關(guān)項(xiàng)目子課題（2014Y2?00220）

★通訊作者：李明，E?mail:mingli2006_2006@126.com