膽囊癌組織多個(gè)腫瘤相關(guān)基因甲基化的檢測(cè)及其意義

孔雷，徐瑞云，吳慶華，李能平，秦建民，楊華麗

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院 普外科，上海 201821；2.上海東方肝膽外科醫(yī)院安亭新院 普外科，上海 201805；3.上海市第四人民醫(yī)院 超聲科，上海 200081）

膽囊癌（gallbladder cancer，GC）是膽道惡性腫瘤中一種主要類(lèi)型，約占膽道惡性腫瘤的1/2左右。GC的臨床特點(diǎn)是惡性度高、預(yù)后很差，確診時(shí)大多數(shù)病例處于晚期。早期發(fā)現(xiàn)、手術(shù)治療是GC的有效治療手段，放化療等均無(wú)明顯療效。GC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，膽囊結(jié)石、腺瘤、膽囊腺肌癥等與GC的發(fā)病密切相關(guān)[1]。GC的臨床診斷多借助于影像學(xué)檢查，還沒(méi)有一種簡(jiǎn)便可靠的特異性的腫瘤學(xué)標(biāo)記物可以應(yīng)用[2-4]。研究表明，甲基化修飾是一種表觀遺傳學(xué)的修飾方式，腫瘤相關(guān)基因異常甲基化，特別是抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展中起重要作用。相比其他胃腸道腫瘤甲基化研究，膽囊癌的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)多個(gè)腫瘤相關(guān)基因在膽囊癌中的甲基化狀態(tài)，分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，探討基因異常甲基化在GC發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象及組織標(biāo)本

選取2014年1月至2017年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院普外科行GC切除術(shù)患者的組織學(xué)標(biāo)本。21例GC患者，其中男8例，女13例；平均年齡（59.6±7.1）歲（41～78歲）。Nevin分期：I期1例，II期2例，III期6例，IV期7例，V期5例。病理分級(jí)：中低分化19例，高分化2例。組織學(xué)分型：腺癌15例，鱗癌2例，腺鱗癌4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。另外隨機(jī)選取同期20例慢性膽囊炎標(biāo)本作為對(duì)照組，其中男8例，女12例；平均年齡（55.1±8.5）歲（36～81歲）。兩組患者的性別、年齡等一般情況相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。所有組織標(biāo)本取材后立即放入液氮中保存，隨后置入-80 ℃冰箱保存。另取部分組織進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.2 方法

1.2.1 膽囊組織基因組DNA提取、甲基化水平檢測(cè)：采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取膽囊組織基因組DNA。UV 3000紫外分光光度儀檢測(cè)基因組DNA濃度和純度。使用Methylamp Global DNA Methylation Quantification Ulrta Kit試劑盒檢測(cè)基因組總甲基化水平。根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求，純化的200 ng組織DNA經(jīng)過(guò)孵育、漂洗后，甲基化的DNA與其特異性的抗體結(jié)合后，采用BIO-RAD680酶標(biāo)儀讀取樣本在450 nm處的吸光度值并計(jì)算基因組甲基化水平。

1.2.2 膽囊組織基因組DNA亞硫酸鹽修飾：紫外分光光度儀檢測(cè)基因組DNA濃度和純度后，OD260/OD280比值處于1.8～2.0之間的樣本DNA用于甲基化修飾。采用Intergen CpGenome DNA modification kit甲基化修飾試劑盒進(jìn)行基因組DNA亞硫酸鹽修飾。DNA經(jīng)過(guò)NaOH變性、亞硫酸鹽修飾、50 ℃水浴避光過(guò)夜。經(jīng)過(guò)修飾后的基因組DNA，甲基化的胞嘧啶保持不變；而未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增為T(mén)，而5-mC不變。根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求，取基因組DNA 500 ng，用PCR級(jí)去離子水稀釋至20 μL，然后加入130 μL CT轉(zhuǎn)化劑，經(jīng)過(guò)孵育、脫硫、洗脫等步驟后，亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA置于-80 ℃冰箱保存，用于甲基化特異性PCR反應(yīng)。

1.2.3 甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)：針對(duì)細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制基因P16、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制基因P15、人DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白基因（hMLH1）、APC基因、PTEN基因和RUNX3基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域設(shè)計(jì)PCR引物。分別采用甲基化和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。甲基化特異性PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括修飾完畢的基因組DNA 2 μL、上下游引物各1 μL、1×PCR buffer II（Perkin-Elmer）、1 IU AmpliTaq Gold polymerase （Perkin-Elmer）、2 mmol/L MgCl、0.25 mmol/L Dntp。MSP循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性30 s，特定溫度退火45 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸7 min，共40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，體外甲基化DNA（in vitro methylated DNA，Intergen）作為陽(yáng)性對(duì)照，不含DNA的蒸餾水作為陰性對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR產(chǎn)物，利用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色，于紫外燈下觀察分析結(jié)果。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料兩組間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因甲基化與臨床病理特征的關(guān)系

6個(gè)基因的甲基化狀態(tài)與患者的性別、年齡、組織學(xué)類(lèi)型、病理分級(jí)及Nevin分期均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05） （表1）。P16基因的甲基化狀態(tài)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性（P＜ 0.05），其余五個(gè)基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性（表1）。

表1 膽囊癌組織異常甲基化與臨床病理特征的關(guān)系 （例）

2.2 膽囊癌組織和慢性膽囊炎組織基因組總甲基化水平檢測(cè)結(jié)果

GC組織基因組總甲基化水平[（4.1±0.8）%]明顯低于慢性膽囊炎基因組總甲基化水平[（6.8±1.2）%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

2.3 甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果顯示，在21例膽囊癌組織中，均存在異常甲基化狀態(tài)，其中2例（9.5%）為1個(gè)基因甲基化，8例（38.1%）為2個(gè)基因同時(shí)存在甲基化，6例（28.6%）為3個(gè)基因同時(shí)存在甲基化，3例（14.3%）為4個(gè)基因同時(shí)存在甲基化，2例（9.5%）為5個(gè)基因同時(shí)存在甲基化。

圖1 膽囊癌組織基因甲基化特異性PCR產(chǎn)物電泳分析

在6個(gè)基因中，GC組織甲基化率較高的3個(gè)基因APC、P16和RUNX3分別為14例（66.7%）、12例（57.1%）和11例（52.4%） （電泳結(jié)果，圖1），明顯高于另外3個(gè)基因P15、PTEN和hMLH1在GC組織中的甲基化率分別為8例（38.1%）、7例（33.3%）和6例（28.6%）（P＜ 0.05）。20例慢性膽囊炎組織僅有2例發(fā)生單個(gè)且均為不同基因（分別為P15和PTEN基因）的甲基化。GC組與慢性膽囊炎組兩者之間甲基化率具有明顯差異（P＜ 0.05）。

3 討論

DNA異常甲基化包括基因組整體的低甲基化以及特定區(qū)域的高甲基化，前者引發(fā)基因突變頻率增加；后者可破壞基因組正常的甲基化程序、干擾基因正常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增值失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在臨床上，GC一經(jīng)診斷絕大多數(shù)患者處于晚期，預(yù)后極差。相比肝癌和胃腸道腫瘤，GC還沒(méi)有一種特異性的和針對(duì)性的腫瘤學(xué)標(biāo)記物可以應(yīng)用于GC的診斷和治療[5]。DNA的異常甲基化通常發(fā)生在腫瘤顯著惡性表型出現(xiàn)之前，故其檢驗(yàn)可預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生，具有臨床應(yīng)用價(jià)值[6]。

在基因組整體低甲基化狀態(tài)下，通過(guò)5-mC的自發(fā)性脫氨和增加外來(lái)致癌物的親和力等方式，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定、突變頻率增加。在其他實(shí)體性腫瘤中，基因組總甲基化水平降低是普遍現(xiàn)象。本研究顯示，GC的基因組總甲基化水平顯著低于慢性膽囊炎，與前述結(jié)論一致。因此，有學(xué)者建議把基因組的總甲基化水平作為一種生物學(xué)標(biāo)記物用于腫瘤的篩查和預(yù)后判斷[7-9]。

初期的GC甲基化研究局限于單個(gè)抑癌基因的異常甲基化，如P16、PTEN、APC等[10-12]。Ueki等[13]報(bào)道中國(guó)人群P16基因異常甲基化率為14.8%（8/54）。Tozawa等[14]報(bào)道日本人群P16基因異常甲基化率為22.2%（2/9）。然而，另有學(xué)者報(bào)道P16基因異常甲基化率為56%[15]。在本研究中P16基因的甲基化率為57.1%，這表明，在GC甲基化研究中，即使同一種基因，不同學(xué)者報(bào)道的甲基化率也存在顯著差異。隨著研究的深入，單個(gè)基因的研究無(wú)法準(zhǔn)確、全面的分析甲基化在GC發(fā)病機(jī)制中的作用。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)多基因的聯(lián)合檢測(cè)相對(duì)于單基因的檢測(cè)，可以明顯提高檢測(cè)的特異性和敏感性[16]。Hanse等[17]在膽道腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了多種異常表達(dá)的基因，開(kāi)啟了GC的多基因研究。Takahashi等[18]研究了24種抑癌基因在GC和慢性膽囊炎患者膽囊組織中異常甲基化情況，在GC患者中表現(xiàn)為高甲基化率的前6位的基因依次為：SHP1（80%）、3-OST-2（72%）、CDH13（44%）、P15 INK4B（44%）、CDH1（38%）、RUNX3（32%），GC組平均甲基化指數(shù)明顯高于慢性膽囊炎組。該研究提示抑癌基因的異常甲基化是GC發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)早期事件，而且存在多個(gè)基因的異常甲基化。

我們參考文獻(xiàn)中有關(guān)膽囊癌基因甲基化率的報(bào)道，選擇了APC等六個(gè)基因作為研究對(duì)象，這六個(gè)基因均與消化系腫瘤密切相關(guān)[13，15，18]。其中，APC基因是重要的Wnt信號(hào)途徑抑制因子，異常甲基化的APC基因會(huì)導(dǎo)致啟動(dòng)增殖的相關(guān)基因的異常轉(zhuǎn)錄；P16基因調(diào)控細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂和增值。在本研究中，21例GC患者中，有19例（90.5%）GC可以檢測(cè)到至少2個(gè)以上基因的甲基化。在6個(gè)基因中，APC、P16和RUNX3三種基因的甲基化率相對(duì)較高，推測(cè)該3種基因的甲基化所導(dǎo)致的基因失活促進(jìn)了GC的發(fā)生與進(jìn)展。6個(gè)基因的甲基化狀態(tài)與患者的性別、年齡、組織學(xué)類(lèi)型以及病理學(xué)分期等臨床特征均無(wú)相關(guān)性。但是，P16基因的甲基化狀態(tài)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，而其余五個(gè)基因無(wú)相關(guān)性。在文獻(xiàn)中，關(guān)于基因異常甲基化與膽囊癌的組織學(xué)類(lèi)型、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等是否相關(guān)還存在較大差異。House等[15]報(bào)道了6種候選抑癌基因在GC中的異常甲基化率高達(dá)72%，最高的前3種基因分別是P16、P73、APC；異常甲基化存在國(guó)家地域之間的區(qū)別，提示多個(gè)基因異常甲基化在GC中是一個(gè)普遍、頻繁的事件。在文獻(xiàn)報(bào)道中，同一種抑癌基因以及多種抑癌基因甲基化率存在較多差別，究其原因，與檢測(cè)方法的靈敏性、準(zhǔn)確性有關(guān)，與GC的病理學(xué)類(lèi)型、臨床分期有關(guān)，同時(shí)也與種族差異、人群分布密切相關(guān)[19]。我們認(rèn)為探討甲基化與GC臨床特征的關(guān)系還需要更大的臨床樣本、更多的相關(guān)基因及多中心研究。

總之，在表觀基因組水平制定GC完整的DNA異常甲基化變化圖譜并提供高效的腫瘤相關(guān)基因來(lái)檢測(cè)GC，探索其表觀遺傳學(xué)機(jī)制，同時(shí)將甲基化與基因沉默途徑、基因印記、性別、年齡、病理學(xué)類(lèi)型及分期等綜合分析，是進(jìn)一步努力的方向。