無(wú)精癥和少精子癥患者的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)檢測(cè)

張志英

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南省鄭州市 450052

調(diào)查顯示，近年來(lái)我國(guó)男性不育發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者的正常生活。相關(guān)資料顯示，多種因素均會(huì)引起男性不育，其中30%以上為染色體異常和基因突變所致[1]。本文以近年來(lái)本院所收治無(wú)精癥和少精子癥患者300例作為觀察對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析和分子遺傳學(xué)分析，旨在探討無(wú)精癥和少精子癥患者中遺傳性缺陷的分布特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月—2017年12月本院收治的無(wú)精癥和少精子癥患者300例，均符合WHO相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)：精液常規(guī)分析中鏡檢未見(jiàn)精子即為無(wú)精癥；精子密度在20×106/ml以下者即為少精子癥。入選患者均已排除合并輸精管阻塞者、激素水平異常者、泌尿生殖道感染者。患者年齡20～45歲，平均年齡(30.4±5.9)歲；其中包括135例無(wú)精癥，165例少精子癥。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)分析：取患者外周血淋巴細(xì)胞0.5ml，在肝素抗凝后在RPMI-1640培養(yǎng)液中接種，并置于37℃中培養(yǎng)72h，按照常規(guī)操作流程進(jìn)行染色體的培養(yǎng)、收獲和G顯帶，在鏡檢中中期分裂相細(xì)胞數(shù)目在20個(gè)以上即為培養(yǎng)成功，對(duì)5個(gè)核型進(jìn)行分析。

1.2.2 分子遺傳學(xué)分析：(1)提取DNA：取外周血樣2ml在EDTA抗凝管中保存，采用天根生化科技有限公司所生產(chǎn)全血基因組提取試劑盒進(jìn)行DNA抽提，并采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA含量進(jìn)行測(cè)定。(2)遺傳因子缺失檢測(cè)：采用多重PCR技術(shù)對(duì)7個(gè)序列表達(dá)標(biāo)簽位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，包括AZFa區(qū)(sY255、sY254位點(diǎn))、AZFb區(qū)(sY134、sn27位點(diǎn))、AZFc區(qū)(sY255、sY254位點(diǎn))、AZFd區(qū)(sn52位點(diǎn))，同時(shí)以ZFX/ZFY和SRY作為對(duì)照組，對(duì)上述序列進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為上海生工生物公司提供，按照涂向東等報(bào)道中所提出的方法進(jìn)行相關(guān)操作。Y染色體AZF因子缺失判斷：根據(jù)正常男性Y染色體AZF因子分布，與受檢片段進(jìn)行對(duì)比。其中若待檢標(biāo)本所有位點(diǎn)均出現(xiàn)擴(kuò)增則視為無(wú)缺失；待檢標(biāo)本在部分位點(diǎn)在單獨(dú)擴(kuò)增和多重PCR中均未出現(xiàn)產(chǎn)物則視為存在缺失。

2 結(jié)果

2.1 核型分析 由表1數(shù)據(jù)可知，300例不育癥男性中共計(jì)存在51例核型異常，占總體的17.00%。其中，無(wú)精癥中存在29例核型異常，異常核型均為(47，XXY)，占整體的21.48%。少精子癥中存在22例核型異常，占整體的13.33%。

表1 300例不育男性核型分析結(jié)果

2.2 AZF微缺失 由表2數(shù)據(jù)可知，300例不育男性中共計(jì)檢出AZF微缺失28例，占整體的9.33%。其中，135例無(wú)精癥患者中共計(jì)檢出AZF微缺失13例，占無(wú)精癥整體的9.63%；165例少精子癥患者中共計(jì)檢出AZF微缺失15例，占少精子癥整體的9.09%。

表2 300例不育癥男性AZF微缺失檢測(cè)結(jié)果

3 討論

染色體核型分析是男性不育患者的重要篩查指標(biāo)，相關(guān)資料顯示，染色體異常因素是最為常見(jiàn)的男性不育原因[2]。在本文中，135例無(wú)精子癥患者中共計(jì)檢出29例核型異常，均確診為Klinefelter征，異常率為21.48%。此類患者主要為先天性曲細(xì)精管發(fā)育異常，導(dǎo)致其失去生育能力，并造成第二性征發(fā)育不全。既往研究證實(shí)，Klinefelter征主要為卵子在形成過(guò)程中X染色體未能成功分離，從而導(dǎo)致受精卵出現(xiàn)染色體異常。異常X染色體造成患者睪丸功能異常，生殖器發(fā)育不良，從而造成精子發(fā)育障礙[3-4]。本文中，165例少精子癥患者中共計(jì)出現(xiàn)22例核型異常，占整體的13.33%，其中以染色體平衡易位為主。相關(guān)資料顯示，染色體易位可造成不對(duì)稱單價(jià)體、多價(jià)體的產(chǎn)生，導(dǎo)致精母細(xì)胞分化異常，無(wú)法正常形成精子。除X染色體異常外，Y染色體上基因結(jié)構(gòu)不完整也是造成男性不育的重要原因。本文中，4例[46，X,inv(Y)]型核型異?；颊咧校琘染色體倒位造成其結(jié)構(gòu)異常，從而引起精母細(xì)胞未能正常分化。2例45,X(7)/46,X,r(Y)(37)核型異?；颊邉t為Y染色體畸變所致結(jié)構(gòu)異常，又被稱為環(huán)狀Y染色體，此類染色體異常導(dǎo)致相關(guān)基因缺失，從而引起少精癥。

Kleiman SE等研究指出，15%左右男性不育患者為Y染色體上AZF區(qū)域微缺失所致。其中，對(duì)于AZFa區(qū)域缺失患者，在臨床主要表現(xiàn)為睪丸體積縮小，從而造成精子生成異常；AZFb區(qū)域缺失則會(huì)造成精母細(xì)胞無(wú)法正常分化，從而引起無(wú)精癥；AZFc區(qū)域。AZFd區(qū)域缺失則會(huì)造成精子數(shù)量異常或精子分化異常。隨著近年來(lái)臨床醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，AZF區(qū)域微缺失檢測(cè)已成為男性不育基因診斷的必備措施。300例不育男性中共計(jì)檢出AZF微缺失28例，占整體的9.33%，其中26例分布于AZFc、AZFd區(qū)域。相關(guān)資料顯示，AZFc、AZFd區(qū)域接近高度重復(fù)異染色質(zhì)區(qū)域，此區(qū)域Y染色體穩(wěn)定性較差，造成遺傳物質(zhì)丟失風(fēng)險(xiǎn)升高。

需要注意的是，染色體核型異常和AZF微缺失可能同時(shí)存在，或僅存在單一類型[5]。因此，對(duì)于少精子癥、無(wú)精癥等男性不育患者，不僅需要對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查已確定染色體核型異常，同時(shí)需采用分子生物學(xué)方法對(duì)其Y染色體上AZF微缺失狀況進(jìn)行測(cè)定，從而取得明確的遺傳學(xué)診斷結(jié)果，確定精子異常原因，為臨床治療和干預(yù)提供可靠依據(jù)[6]。

綜上所述，染色體核型異常和Y染色體AZF區(qū)域微缺失是造成男性不育中少精子癥和無(wú)精癥出現(xiàn)的重要原因，對(duì)患者進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析和分子生物學(xué)檢測(cè)，以明確不育癥原因，對(duì)于臨床治療的開(kāi)展具有十分重要的意義。