蘆薈大黃素對培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞Smad 2與I型膠原表達(dá)及細(xì)胞周期的影響*

楊成華 程基焱

1 西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,四川省瀘州市 646000; 2 達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院

成纖維細(xì)胞主要分布于結(jié)締組織等部位。目前認(rèn)為，成纖維細(xì)胞可以合成和分泌膠原蛋白及產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，在組織愈合、瘢痕產(chǎn)生等過程中扮演主要角色[1-2]。Smad蛋白存在于人和動(dòng)物多種細(xì)胞中，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，對創(chuàng)傷修復(fù)等生理病理過程有重要作用，是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)受體復(fù)合物的下游信號。Smad蛋白可以將TGF-β信號直接由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)。因此，Smad蛋白可能在成纖維細(xì)胞參與創(chuàng)傷修復(fù)及瘢痕愈合中起到重要的作用。蘆薈大黃素(Aloe-emodin)是大黃、蘆薈等多種中藥的有效成分，屬植物型藥劑。大黃、蘆薈在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中已經(jīng)有了悠久的歷史，除了可以用于中醫(yī)的辨證施治以外，還可以用于保健和日用化工品中，主要功效有利于護(hù)發(fā)和護(hù)膚[3-4]。

本研究通過用體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞，用蘆薈大黃素進(jìn)行干擾，檢測蘆薈大黃素對成纖維細(xì)胞的增殖及對其Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響，分析蘆薈大黃素對成纖維細(xì)胞相關(guān)生理活動(dòng)的影響和意義，為成纖維細(xì)胞的功能調(diào)控、調(diào)控機(jī)制的研究及創(chuàng)傷愈合、疤痕修復(fù)等方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及主要試劑、設(shè)備 人皮膚成纖維細(xì)胞：皮膚來自于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科小兒包皮環(huán)切術(shù)皮膚真皮；蘆薈大黃素：上海晶都生物技術(shù)有限公司；量子點(diǎn)標(biāo)記試劑盒：武漢珈源量子點(diǎn)技術(shù)開發(fā)有限責(zé)任公司；Ⅰ型膠原、Smad 2一抗：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；熒光顯微鏡：日本 奧林巴斯(OLYMPUS，BX51)公司；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀：美國 BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組干擾 將皮膚真皮原代培養(yǎng)，傳代，純化，細(xì)胞濃度為1.0×108/L，接種于24孔培養(yǎng)板(鋪蓋玻片)，即每組24例樣本量。培養(yǎng)條件：溫度37℃、小牛血清10%、DMEM培養(yǎng)基、CO25%。蘆薈大黃素以二甲基亞砜為溶劑溶解稀釋，分為3個(gè)不同劑量的組別，即低劑量組(50μg/ml treatment group，50-TG)，采用50μg/ml進(jìn)行干擾；中劑量組(100μg/ml treatment group，100-TG)，采用100μg/ml進(jìn)行干擾；高劑量組(500μg/ml treatment group，500-TG)采用500μg/ml進(jìn)行干擾；以及對照組(control group，CG)0μg/ml。48h后終止干擾。取出細(xì)胞爬片，90%乙醇固定30min，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 染色及檢測 量子點(diǎn)標(biāo)記：細(xì)胞爬片經(jīng)0.1% Triton-X 100，3%雙氧水處理，滴加1∶100稀釋的Ⅰ膠原蛋白一抗(鼠抗鼠)37℃ 4h，滴加1∶100稀釋的I膠原蛋白一抗(兔抗鼠)37℃ 4h，PBS洗滌，量子點(diǎn)標(biāo)記二抗(抗鼠、抗兔)復(fù)合物37℃孵育20min，PBS洗滌，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察成像并照相，記錄觀察結(jié)果。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 取培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞成細(xì)胞懸液，離心，冰乙醇固定，離心。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，PI染液孵育。以488nm氬離子激光激發(fā)，每組取8例樣本量，應(yīng)用BD CSCalibur(美國 BD公司)流式細(xì)胞儀的FAC Station、Cell QUEST Pro數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測和結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 量子點(diǎn)免疫熒光結(jié)果 干擾48h后，對照組和實(shí)驗(yàn)組Smad 2顯示為綠色熒光，Ⅰ膠原蛋白顯示為紅色熒光(圖1、2)。分析結(jié)果顯示， Smad 2主要表達(dá)在細(xì)胞核，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯增高，與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅰ型膠原主要表達(dá)細(xì)胞質(zhì)，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯降低，與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 免疫染色熒光強(qiáng)度

注：*對照組與實(shí)驗(yàn)組之間比較，P<0.05；△對照組與實(shí)驗(yàn)組之間比較，P<0.05。結(jié)果*1P=0.018,*2P=0.008,*3P=0.011,△4P=0.001,△5P=0.003,△6P=0.003。

圖1 Smad 2免疫熒光染色結(jié)果(×200)

注：A：CG， B：50-TG， C：100-TG， D：500-TG。

圖2 I型膠原免疫熒光染色結(jié)果(×200)

注：A：CG， B：50-TG， C：100-TG， D：500-TG。

2.2 成纖維細(xì)胞流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測結(jié)果 對照組、實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞所占比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；S期細(xì)胞所占比例，G2期細(xì)胞所占比例各組之間比較，無明顯變化規(guī)律，見表2。

表2 流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測結(jié)果

注：*與對照組比較，P<0.05,*1P=0.021,*2P=0.013,*3P=0.013。

3 討論

“無瘢痕愈合”(Scarless Healing)是指哺乳動(dòng)物在創(chuàng)傷愈合后不留瘢痕的特殊現(xiàn)象，是創(chuàng)傷愈合的理想狀態(tài)。創(chuàng)傷后瘢痕的產(chǎn)生是由于創(chuàng)傷后大量膠原產(chǎn)生，是多年來困擾廣大醫(yī)患人員的難題。研究證實(shí)，人類胎兒無瘢痕愈合是胎兒的成纖維細(xì)胞在其特殊生理環(huán)境中產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)果，并主要與成纖維細(xì)胞內(nèi)在特性以及其產(chǎn)生的膠原蛋白類型有關(guān)。但無瘢痕愈合過程中并非因?yàn)樘簞?chuàng)傷愈合后的基質(zhì)中缺乏膠原，而主要是因?yàn)槟z原在胚胎皮膚中的成分及排列等結(jié)構(gòu)與成年皮膚表現(xiàn)出不同的特征。

膠原主要由成纖維細(xì)胞合成并分泌，是結(jié)締組織基質(zhì)中的主要成分，其中Ⅰ型膠原是創(chuàng)面存在的主要膠原。Smad蛋白家族存在于人和動(dòng)物多種細(xì)胞，對細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)等生理、病理過程有重要作用。有報(bào)道稱Smad是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)受體復(fù)合物的下游信號。其中Smad 2和Smad 3是介導(dǎo)TGF-β1作用的受體調(diào)節(jié)Smad蛋白，可能是TGF-β1信號下傳的第一個(gè)信號分子。因此，Smad 2、Smad 3可能在胚胎無瘢痕愈合中起到重要的作用[1-2，5]。

培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞的Smad 2、Ⅰ型膠原的免疫熒光檢測顯示，該細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)下均有Smad 2、Ⅰ型膠原蛋白陽性產(chǎn)物。該研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Smad 2主要表達(dá)在細(xì)胞核，Ⅰ型膠原主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)。在培養(yǎng)中用蘆薈大黃素干擾后，Smad 2實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯增高，而Ⅰ型膠原蛋白實(shí)驗(yàn)組表達(dá)明顯降低。由此可見，蘆薈大黃素可以促進(jìn)體外培育人成纖維細(xì)胞中Smad 2的表達(dá)，但是抑制該細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原的表達(dá)。結(jié)合本課題組的前期研究結(jié)果，胚胎無瘢痕愈合的主要機(jī)制可能為Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)差異及比例與成體成纖維細(xì)胞不同。因此可以認(rèn)為，在體外培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞中，該機(jī)制相似于胚胎成纖維細(xì)胞，Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)決定成纖維細(xì)胞的功能狀態(tài)不同，從而調(diào)控著是否有瘢痕形成的愈合機(jī)制。蘆薈大黃素對Smad 2、Ⅰ型膠原的調(diào)節(jié)，也說明其機(jī)制可能為通過調(diào)控Smad 2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，達(dá)到調(diào)控膠原表達(dá)的目的，并對愈合及愈合的方式具有一定的意義[3，5]。

實(shí)驗(yàn)中，在一定細(xì)胞密度內(nèi)，成纖維細(xì)胞保持不斷增殖狀態(tài)。細(xì)胞則總是處于從G1、S、G2 和M期的周而復(fù)始的細(xì)胞周期中。在細(xì)胞周期對應(yīng)的各階段，細(xì)胞分別進(jìn)行著DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞分裂等重要的生理活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆薈大黃素有明顯升高G1期成纖維細(xì)胞的比例，G1期細(xì)胞比例相對于對照組來說，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而S期、G2期細(xì)胞比例無明顯改變規(guī)律。其結(jié)果說明，蘆薈大黃素對成纖維細(xì)胞的細(xì)胞分裂的影響，主要在細(xì)胞周期的G1期。其G1比例增高，則說明細(xì)胞在G1停留時(shí)間延長、細(xì)胞向G0發(fā)展的可能性增大、細(xì)胞出現(xiàn)功能相對停滯的可能性增大，則細(xì)胞不被活化的可能性增大。結(jié)合上述成纖維細(xì)胞中Smad 2、Ⅰ型膠原表達(dá)的特點(diǎn)及組織創(chuàng)傷后修復(fù)的過程及機(jī)制，可以推導(dǎo)出蘆薈大黃素可以適當(dāng)抑制成纖維細(xì)胞的增殖，并避免創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞大量增殖并產(chǎn)生更多的膠原，聚集于創(chuàng)傷處不能降解，從而達(dá)到瘢痕組織減少的結(jié)果。這可能是大黃、蘆薈等含蘆薈大黃素的中藥可以抑制成纖維細(xì)胞的功能，調(diào)控?zé)o瘢痕愈合的作用機(jī)制之一[6]。

綜上所述，蘆薈大黃素對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的功能有明顯調(diào)控作用，可以促進(jìn)Smad 2的表達(dá)，抑制Ⅰ型膠原蛋白的合成。同時(shí)，蘆薈大黃素可以延長成纖維細(xì)胞G1期，從而影響細(xì)胞的增殖及活性，可能是蘆薈大黃素可以達(dá)到調(diào)控愈合的作用機(jī)制之一。但中藥的作用機(jī)制研究極為復(fù)雜，關(guān)于蘆薈大黃素對愈合狀態(tài)的作用機(jī)制研究還需要大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步深入的研究和探討。