自身免疫性大皰性皮膚病患者免疫學(xué)檢測結(jié)果分析

劉瑋，曾志良，馬玲，陳柳青

(武漢市第一醫(yī)院皮膚科，湖北 武漢430000)

天皰瘡(Pemphigus，以下簡寫為P)和大皰性類天皰瘡(bullous pemphigoid，以下簡寫為BP)是兩類典型而又常見的自身免疫性大皰性皮膚病(autoimmune blistering disease，AIBD)[1]， 他們的發(fā)病均由自身抗體介導(dǎo)，但是兩種疾病的自身抗體譜是不一樣的[2]。P患者的自身抗原是橋粒芯蛋白（desmogleins），一種細(xì)胞橋粒粘附分子?？箻蛄Ｐ镜鞍卓贵w（-Dsgs）抑制了角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞間粘附，從而導(dǎo)致表皮內(nèi)水皰形成[3]。BP患者的自身抗原是分子量為180kDa的大皰性類天皰瘡抗原2（BPAG2），稱為 BP180。BP180 是半橋粒的成分，并且是跨膜蛋白，能促進(jìn)真皮與表皮的粘附?？笲P180抗體為BP的主要致病抗體，其抗原位點(diǎn)主要在NC16A區(qū)域[4]。以往的文獻(xiàn)顯示，直接免疫熒光（DIF）為診斷大皰性皮膚病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[5]，但臨床實(shí)際運(yùn)用卻存在假陽性與假陰性。目前國內(nèi)已經(jīng)有商品化的針對Dsgs和BP180抗體的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒。為了探討Dsgs和BP180抗體的檢測在大皰性皮膚病中的診斷價(jià)值，本次研究，收集武漢及周邊地區(qū)的大皰性皮膚病患者的DIF和ELISA檢測結(jié)果進(jìn)行分析，為大皰性皮膚病的診療提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

選擇2016年12月－2017年12月在武漢市第一醫(yī)院皮膚科診治患者，根據(jù)臨床表現(xiàn)和組織病理結(jié)果分為：明確診斷為天皰瘡P組（32例，男性14例，女性 18例，年齡 53.78±15.92）和大皰性類天皰瘡BP組（24例，男性10例，女性14例，年齡67.92±16.06）；排除大皰性皮膚病患者為對照組（30例，男性17例，女性13例，年齡49.24±19.29）；病理診斷不明確，臨床表現(xiàn)疑似大皰性皮膚病患者為疑似組（14例，男性6例，女性8例，年齡 53.22±16.89）。

DIF在患者水皰皮損周圍用2%利多卡因局部麻醉后，無菌手術(shù)操作下切取皮損周圍正常皮膚標(biāo)本，-18℃冰凍切片，厚度5μm，干燥固定。用PBS洗兩遍，5mins，蒸餾水洗一遍，然后分別滴加兔抗人FITC(異硫氰酸熒光素)熒光標(biāo)記抗體IgG、IgM、IgA和C3在皮膚組織標(biāo)本上，置于濕盒內(nèi)，放入37℃恒溫干燥箱孵育30min。將濕盒取出，用PBS浸泡2次，5mins，然后蒸餾水浸泡1次，1min，自然晾干，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，見到棘細(xì)胞間或基底膜（BMZ）下線、網(wǎng)狀熒光為陽性。

ELISA采用MBL公司 （日本株式會(huì)社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測抗Dsg1 IgG，抗Dsg3 IgG和BP180-NC16A IgG抗體試劑盒。BP180、Dsg1和Dsg3均按如下操作流程檢測：使用新鮮患者血清10ul加1ml反應(yīng)緩沖液（1：101稀釋），反應(yīng)微孔內(nèi)加入100ul稀釋后樣品，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)血清 1（0U/ml）、標(biāo)準(zhǔn)血清 2（100U/ml）孵育60mins，20~30℃，洗板四次，每孔加入 100ul酶標(biāo)記抗體 （分別為-BP180、-Dsg1和-Dsg3）， 孵育60mins，洗板四次，每孔加入100ul酶基質(zhì)液孵育30mins后加入100ul終止液，在450nm/620nm下讀取吸光度值。按照試劑盒廠家賦予的計(jì)算公式：樣本值 （U/ml）=（樣本孔OD值-標(biāo)準(zhǔn)血清1孔OD值）×100/(標(biāo)準(zhǔn)血清2孔OD值-標(biāo)準(zhǔn)血清1孔OD值)計(jì)算三種抗體的滴度。各抗體陽性參考值如下：抗 BP180抗體≥9U/ml，抗 Dsg1抗體≥20U/ml，抗Dsg3抗體≥20U/ml。

2 結(jié)果

2.1 Dsg1、Dsg3、BP180 和 DIF 檢測結(jié)果陽性率ELISA法檢測Dsg1、Dsg3抗體在P組的陽性率為78.1%、31.3%，總陽性率為100%（兩者之一為陽性）和其他三組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；ELISA法檢測BP180抗體在BP組的陽性率為83%和其他三組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；DIF檢測結(jié)果在P組和BP組的陽性率均為75%，和其他兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。天皰瘡患者的Dsgs抗體具有較高的陽性檢出率，大皰性類天皰瘡患者的BP180抗體具有較高的陽性檢出率，天皰瘡和大皰性類天皰瘡患者的DIF檢測結(jié)果陽性率一致。見表1。

2.2 DIF檢測陽性抗體分布 P組檢出IgA 1例、IgG 13例、C3 16例，P組抗體類別主要為IgG和C3；BP組檢出IgG 3例、C3 13例，BP組抗體類別主要為C3或IgG；因此天皰瘡患者和大皰性類天皰瘡患者DIF檢測的陽性抗體類別主要為IgG和（或）C3，也可有IgA檢出，和文獻(xiàn)顯示一致。見表2。

3 討論

在幾乎所有的天皰瘡（P）和大皰性類天皰瘡（BP）患者，DIF結(jié)果鏡下可見角質(zhì)形成細(xì)胞和表皮基底膜帶（BMZ）C3和（或）IgG沉積，因此 DIF一直是診斷天皰瘡和大皰性類天皰瘡敏感而又可靠的方法，被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]。本次研究天皰瘡患者和類天皰瘡患者DIF陽性率為75%，DIF陽性結(jié)果中P組和BP組抗體類別均為IgG或C3，P組抗體類別檢測到IgA一例，這和文獻(xiàn)顯示一致[7]。但是對照組DIF也有陽性標(biāo)本檢出，由于一些結(jié)締組織病患者也可見表皮下IgG和C3沉積，這對于診斷大皰性皮膚病是一種假陽性誤差。而DIF檢測陽性率（75%）低于ELISA方法（100%和83%），產(chǎn)生這種結(jié)果可能由于臨床取材水皰附近位置皮膚的差異，這可能是造成DIF結(jié)果假陰性誤差的來源[8]。因此DIF檢查結(jié)果需要結(jié)合病理診斷和臨床表現(xiàn)才能診斷大皰性皮膚病。

DSG抗體在P組的陽性率為100%，對照組和BP組為0%，說明DSG抗體診斷天皰瘡的特異性很好。在疑似組，即為組織病理結(jié)果為僅見表皮下水皰時(shí)，DSG檢測陽性率也有21.4%，說明在病理取材水皰陳舊或鏡下組織結(jié)構(gòu)不明顯時(shí)，DSG抗體檢測可以很好的輔助診斷天皰瘡[9]。這和來自新疆的陳禎祥[10]等的研究結(jié)果一致，他們用ELISA方法檢測的Dsg抗體的特異度為100%，認(rèn)為Dsg抗體檢測陽性結(jié)果可以診斷天皰瘡，陰性結(jié)果則可排除診斷。李彥希[11]等的研究結(jié)果則認(rèn)為ELISA方法檢測DSG抗體可以作為大皰性疾病的篩查方法，如結(jié)果與臨床吻合則無需進(jìn)一步檢測，如結(jié)果與臨床診斷有爭議，可進(jìn)一步做病理及免疫熒光檢測。此外，有文獻(xiàn)指出DSG抗體滴度在天皰瘡患者治療過程中顯著性降低，和天皰瘡患者的治療效果呈正相關(guān)[12]，天皰瘡患者血清中Dsg1和Dsg3抗體表達(dá)的差異和皮損定位（皮膚主導(dǎo)型、粘膜主導(dǎo)型和皮膚粘膜混合型）也有一定的聯(lián)系，這有待本科室進(jìn)一步的臨床研究。

表1 四組患者檢測結(jié)果[例（%）]

表2 四組DIF陽性抗體分布（例）

BP180抗體檢測在BP組的陽性率為83%，這和文獻(xiàn)顯示的ELISA方法檢測BP180抗體的敏感性為70%-90%相一致[13]。由此，有些BP患者的BP180檢測結(jié)果為陰性，產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的原因可能為：1.有些BP患者的抗原位點(diǎn)在BP180-NC16A之外[14]；2.BP180自身抗體亞型差異，BP患者活動(dòng)期致病性抗體亞型主要是IgG1，緩解期多為IgG4[15]；3.BP患者早期出現(xiàn)蕁麻疹樣皮損時(shí)，血清中升高的是BP180-NC16A IgE[16]。在P組和對照組的BP180抗體陽性率為0%和10%，說明P的致病抗體不同于BP，在非BP患者血清中也可以檢測到BP180抗體。本次研究對照組陽性檢出病例為無菌性膿皰病。由于BP180是大皰性類天皰瘡、妊娠性類天皰瘡、瘢痕性類天皰瘡、線狀I(lǐng)gA大皰性皮病等一類自身免疫性大皰病的自身抗體攻擊的靶點(diǎn)[17]，在 Christine Muglia[18]的報(bào)告中指出，在老年病人出現(xiàn)嚴(yán)重水皰的時(shí)候，BP180抗體檢測只能作為BP診斷的一個(gè)輔助手段，BP180抗體滴度很低的時(shí)候，如果DIF多次取材為陰性，組織病理結(jié)果也不支持應(yīng)該高度懷疑BP的診斷。

綜上所述，ELISA和DIF這兩種方法都是臨床可行的輔助診斷大皰性皮膚病的檢測方法，但均存在方法學(xué)的局限性和致病機(jī)制的未知性，因此需要臨床醫(yī)生綜合考慮及全面的評價(jià)其檢測結(jié)果，以減少大皰性皮膚病的誤診率，減輕對患者的傷害，更好的指導(dǎo)臨床治療。