• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酸吸入致大鼠肺纖維化初步探索

    2010-09-09 09:20:38陳石張德平
    關(guān)鍵詞:博來霉素肺纖維化膠原

    陳石,張德平

    (1.南京市胸科醫(yī)院呼吸科,江蘇南京 210029;2.南京市鼓樓醫(yī)院呼吸科,江蘇南京 210008)

    研究報(bào)告

    酸吸入致大鼠肺纖維化初步探索

    陳石1,張德平2

    (1.南京市胸科醫(yī)院呼吸科,江蘇南京 210029;2.南京市鼓樓醫(yī)院呼吸科,江蘇南京 210008)

    目的研究實(shí)驗(yàn)性酸吸入與大鼠肺間質(zhì)纖維化的相關(guān)性及其可能的作用機(jī)制,并與傳統(tǒng)的博來霉素致纖維化作一比較。方法健康雄性SD大鼠120只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、博來霉素組、高濃度鹽酸組、中濃度鹽酸組和低濃度鹽酸組,每組24只。博來霉素組氣管內(nèi)一次性注入博來霉素誘導(dǎo)纖維化,鹽酸組每周氣管內(nèi)滴注不同濃度鹽酸1次,正常對(duì)照組每周氣管內(nèi)滴注生理鹽水1次。各組分別于造模后第7、14、28及42天隨機(jī)處死6只,取肺組織行HE、Masson染色評(píng)價(jià)肺組織病理變化,用RT-PCR方法測(cè)定肺組織轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)的mRNA表達(dá),用免疫組化的方法半定量測(cè)定I型膠原蛋白、結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)。結(jié)果鹽酸組肺泡炎程度始終顯著高于對(duì)照組,在開始2周內(nèi)達(dá)到一個(gè)高峰,隨后仍舊維持一個(gè)相對(duì)較高狀態(tài),28 d達(dá)到或者超過博來霉素組水平。鹽酸組纖維化程度隨時(shí)間逐漸增強(qiáng),顯著高于對(duì)照組,但始終未超過博來霉素組。鹽酸組肺組織TGF-β1mRNA在28 d時(shí)達(dá)到博來霉素組水平,至42 d時(shí)全面超過博來霉素組水平。博來霉素組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織I型膠原表達(dá)均顯著高于正常陰性對(duì)照組及3個(gè)鹽酸組。高、中濃度鹽酸組CTGF表達(dá)從14 d起高于正常陰性對(duì)照組,且隨滴注次數(shù)及時(shí)間增加而增強(qiáng)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)從一個(gè)角度反映了經(jīng)常性胃食管酸反流引起的酸吸入與肺纖維化的相關(guān)性,為揭示胃食管反流病(GERD)與特發(fā)性肺纖維化(IPF)的關(guān)系提供了初步的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

    肺纖維化;胃食管反流病;鹽酸;博來霉素

    胃食管反流病(GERD)與多種呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān),如慢性咳嗽、哮喘、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、慢性阻塞性肺疾病[1-5]。但它對(duì)肺部的纖維化及損傷有時(shí)卻被忽略。而近年來隨著24h食管pH監(jiān)測(cè)儀等先進(jìn)儀器的應(yīng)用,讓人們逐漸認(rèn)識(shí)到胃食管反流可能對(duì)特發(fā)性肺纖維化的影響。從1976年Mays等[6]第一次報(bào)道了臨床上GERD與肺纖維化的相關(guān)性至今,有多篇文獻(xiàn)報(bào)道特發(fā)性肺纖維化(IPF)與GERD的相關(guān)性[7-9]。最近Raghu[10]進(jìn)行了一項(xiàng)類似的統(tǒng)計(jì)研究,65名確診為IPF的患者,GERD的發(fā)病率高達(dá)87%。因此人們推測(cè)GERD引起的酸吸入可能與肺纖維化存在某種聯(lián)系[30]。

    Popper等[11]報(bào)道了向動(dòng)物氣管內(nèi)滴入酸可以引起動(dòng)物肺損傷及纖維化。在酸性條件下肺泡細(xì)胞可能被酸破壞,使肺表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生減少,加之富含蛋白成分的血漿滲出,可進(jìn)一步加重肺組織損傷及纖維化程度。

    但至今尚沒有一種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從病理、蛋白表達(dá)、mRNA基因水平等多角度揭示實(shí)驗(yàn)酸吸入引起肺纖維化的動(dòng)態(tài)演變過程。本實(shí)驗(yàn)分別用病理切片分析、免疫組化蛋白半定量鑒定、PCR等多種方法,觀察鹽酸(胃酸的主要成分)對(duì)肺部造成的損傷,以及它和肺纖維化之間可能存在的相關(guān)性進(jìn)行研究,探討二者之間聯(lián)系可能的病理生理機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑

    博來霉素A5針劑(天津太河制藥有限公司)、鹽酸(南京化學(xué)試劑有限公司)、半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑、Trizol(美國Invitrogen公司)、SuperscriptTMⅢReverse Transcriptase (SuperscriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄酶)試劑盒(美國Invitrogen公司)、Oligo(dT)(美國Invitrogen公司)、PCR試劑盒(TaKaRa TaqTM,大連寶生物工程有限公司)、鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)單克隆抗體(美國R&D公司)、大鼠CTGF單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),I型膠原單克隆抗體(美國sigma公司產(chǎn)品)、PV-6000二步法免疫組化試劑盒(北京中衫金橋生物公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物模型的建立和分組:健康雄性SD大鼠120只,體重180~200 g,南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供【SCXK(蘇)2005-0002】。隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(N組)、博來霉素組(B組)、高濃度鹽酸組(H組)、中濃度鹽酸組(M組)及低濃度鹽酸組(L組),每組24只。鹽酸臨用前用蒸餾水稀釋成0.2、0.1及0.05 mol/L 3個(gè)濃度組,每周給予3個(gè)鹽酸組氣管內(nèi)滴注1次(2 m L/kg)。正常組每周氣管內(nèi)給予等體積生理鹽水1次。博來霉素組一次性氣管內(nèi)給予博來霉素(5 mg/kg)。

    1.2.2 取材:各組分別在造模后第7、14、28及42天隨機(jī)處死6只大鼠。氯胺酮腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死大鼠,開胸取肺組織,用生理鹽水將肺組織漂洗數(shù)次,右肺上葉經(jīng)4%甲醛液固定,常規(guī)石蠟包埋,HE染色、Masson三色染色及免疫組織化學(xué)染色。

    1.2.3 肺組織病理分析:肺組織經(jīng)不同濃度酒精常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片后,分別給予HE和Masson三色染色。根據(jù)Szapiel等[12]的方法評(píng)價(jià)肺泡炎和肺纖維化的程度。肺泡炎分4級(jí):無肺泡炎(-),評(píng)0分;輕度肺泡炎(+),評(píng)1分,表現(xiàn)為單核細(xì)胞浸潤使肺泡隔增寬,僅限于局部和近胸膜部,面積小于全肺的20%,肺泡結(jié)構(gòu)正常;中度肺泡炎(++),評(píng)2分,受累面積占全肺的20%~50%,近胸膜部較重,重度肺泡炎(+++),評(píng)3分,面積大于50%,偶見肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞及出血造成實(shí)變。肺纖維化分4級(jí):無纖維化(-),評(píng)0分;輕度纖維化(+),評(píng)1分,受累面積小于20%,纖維化累及胸膜及胸膜下的肺間質(zhì),肺泡的結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂;中度纖維化(++),評(píng)2分,病變范圍約占全肺的20%~50%,纖維化區(qū)域從胸膜延伸,仍屬局部性;重度纖維化(+++),評(píng)3分,病變范圍大于50%,并有融合,可見大小不等的囊氣腔。

    1.2.4 肺組織中TGF-β1-mRNA的表達(dá):采用半定量RT-PCR測(cè)定,Trizol法提取肺組織總RNA后,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,序列如下:(1) TGF-β1:上游5′-GCTAATGGTGGACCGCAAC-3′,下游:5′-GCAGTGAGCACTGAAGCGA-3′,目的片段長度340 bp;(2)β-actin:上游:5′-GAGACCTTCAA CACCCCAGC-3′,下游:5′-CACAGAGTACTTGCGCT CAG-3′,目的基因片段長度654 bp。PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/m L溴化乙啶)后,凝膠成像及分析系統(tǒng)下掃描分析,用TGF-β1及β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度比值表示每個(gè)標(biāo)本的相對(duì)mRNA水平。

    1.2.5 肺組織中CTGF與I型膠原的表達(dá)測(cè)定:采用免疫組化EnVision二步法,分別按CTGF與I型膠原檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行,

    1.2.6 結(jié)果分析:免疫組化結(jié)果以肺組織中出現(xiàn)棕黃色為陽性顯色,并用Image-pro plus專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)分別對(duì)CTGF與I型膠原的表達(dá)進(jìn)行定量分析,在400倍視野下,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,測(cè)定積分吸光度來代表CTGF的表達(dá)量,在100倍視野下,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,測(cè)定積分吸光度來代表I型膠原的表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 肺組織病理學(xué)改變

    2.1.1 肺泡炎程度比較:正常陰性對(duì)照組(N組)肺泡壁薄,結(jié)構(gòu)正常,無特殊改變。博來霉素陽性對(duì)照組(B組)氣管內(nèi)滴注博來霉素7d后,大鼠肺泡間隔及肺泡內(nèi)即出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng),可見大量的炎癥細(xì)胞浸潤,顯著強(qiáng)于正常陰性對(duì)照組(N組)(P<0.01);此后隨時(shí)間推移,炎癥細(xì)胞減少,逐漸以纖維化改變?yōu)橹?,可見多灶性,大小不等的纖維化區(qū)域。而在3個(gè)鹽酸組肺泡炎癥在開始兩周內(nèi)達(dá)到一個(gè)高峰,隨后仍舊維持一個(gè)相對(duì)較高狀態(tài),自28 d達(dá)到或者超過博來霉素陽性對(duì)照組(B組)水平。各組肺泡炎程度見表1。

    表1 各組大鼠肺泡炎評(píng)分結(jié)果(±s)Tab.1 The alveolitis scores in each group of rats(±s)

    表1 各組大鼠肺泡炎評(píng)分結(jié)果(±s)Tab.1 The alveolitis scores in each group of rats(±s)

    注:與N組比較,★P<0.01;與L組比較,▲P<0.05;與H組比較,◆P<0.05,◆◆P<0.01Note:Compared with the normal group,★P<0.01;Compared with the group L,▲P<0.05;compared with the group H,◆P<0.05,◆◆P<0.01

    組別(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N組(Normal group)0.17±0.41 0.33±0.52 0.17±0.41 0.00±0.00 B組(Bleomycin group)2.17±0.75★▲2.00±0.89★1.17±0.75★◆◆1.00±0.63★◆◆H組(Group H)2.17±0.75★▲2.33±0.52★2.17±0.41★2.00±0.00★M組(Group M)1.50±0.55★1.67±0.52★1.67±0.52★1.50±0.55★L(fēng)組(Group L)1.33±0.82★1.83±0.98★1.50±0.55★◆1.33±0.52★◆

    2.1.2 纖維化程度比較:Masson三色染色判斷肺組織纖維化程度,正常陰性對(duì)照組(N組)大鼠肺組織含有少量膠原纖維,未見特殊異常改變。博來霉素陽性對(duì)照組(B組)大鼠早期即出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化,肺間質(zhì)纖維化逐漸加重,至28d達(dá)到頂峰,后逐漸有所下降。鹽酸組早期纖維化程度低,隨時(shí)間推移和滴注鹽酸次數(shù)的增加,纖維化程度逐漸增強(qiáng),雖然沒有達(dá)到博來霉素陽性對(duì)照組的纖維化程度,但顯著強(qiáng)于正常陰性對(duì)照組(P<0.01),但3個(gè)鹽酸組的纖維化程度都沒有超過博來霉素陽性對(duì)照組。結(jié)果見表2和圖1(彩插8)。

    表2 各組大鼠肺纖維化評(píng)分結(jié)果(±s)Tab.2 The pulmonary fibrosis scores of rats in each group(±s)

    表2 各組大鼠肺纖維化評(píng)分結(jié)果(±s)Tab.2 The pulmonary fibrosis scores of rats in each group(±s)

    注:與N組比較,★P<0.05,★★P<0.01;與B組比較,■P<0.05;與H組比較,◆P<0.05Note:Compared with the normal group,★P<0.05,★★P<0.01;Compared with the bleomycin group,■P<0.05;Compared with the group H,◆P<0.05

    組別(Group)7d 14d 28d 42d N組(Normal group)0.00±0.00 0.00±0.00 0.17±0.41 0.33±0.52 B組(Bleomycin group)1.33±0.52★★2.00±0.63★★2.50±0.55★★1.83±0.41★★H組(Group H)0.67±0.52★★■1.00±0.63★★■1.33±0.52★★■1.67±0.52★★M組(Group M)0.67±0.52★★■0.83±0.75★★■1.17±0.41★★■1.50±0.55★★L(fēng)組(Group L)0.50±0.55★■0.67±0.52★■0.83±0.75★★■1.00±0.63★★■◆

    2.2 肺組織中TGF-β1m RNA的表達(dá)

    博來霉素陽性對(duì)照組(B組)TGF-β1mRNA在7、14 d表達(dá)顯著高于其他各組(P<0.05),但表達(dá)水平逐漸下降,至第28天時(shí)與正常陰性對(duì)照組(N組)差異無顯著性(P>0.05)。3個(gè)鹽酸組在第7、14天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著低于博來霉素陽性對(duì)照組(P<0.05),自第28天起3個(gè)濃度鹽酸組肺組織TGF-β1 mRNA表達(dá)水平與博來霉素陽性對(duì)照組差異無顯著性(P>0.05),42 d時(shí)3個(gè)濃度鹽酸組TGF-β1 mRNA表達(dá)水平已經(jīng)高于博來霉素陽性對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果見表3、圖2。

    表3 大鼠肺組織中TGF-β1mRNA的表達(dá)結(jié)果(±s)Tab.3 The expression of TGF-β1 mRNA in the rat lung tissues(±s)

    表3 大鼠肺組織中TGF-β1mRNA的表達(dá)結(jié)果(±s)Tab.3 The expression of TGF-β1 mRNA in the rat lung tissues(±s)

    注:與N組比較,*P<0.05;與B組比較,▲P<0.05;與H組比較,◆P<0.05Note:Compared with the normal group,*P<0.05;Compared with the bleomycin group,▲P<0.05;Compared with the group H,◆P<0.05

    組別(Group)7d 14d 28d 42d N組(Normal group)0.46±0.12 0.44±0.08 0.43±0.16 0.45±0.10 B組(Bleomycin group)0.86±0.24*0.95±0.18★0.73±0.13*0.47±0.11 H組(Group H)0.62±0.06*▲0.70±0.08*▲0.82±0.11*0.87±0.11*▲M組(Group M)0.58±0.08▲0.62±0.09*▲0.72±0.21*0.79±0.22*▲L組(Group L)0.53±0.11▲0.59±0.16*▲0.63±0.12*◆0.72±0.06*▲

    注:Maker:DL2000 marker;B:博來霉素陽性對(duì)照;N:正常對(duì)照組;H:高濃度鹽酸組;M:中濃度鹽酸組; L:低濃度鹽酸組;β-act:內(nèi)參圖2各實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織28 d時(shí)TGF-β1 mRNA的表達(dá)Note:Maker:DL2000 marker;B:Bleomycin group;N:Normal group;H:H igh-dose HCl group;M:Middle-dose HCl group;L:Low-dose HCl group;β-act:Internal standardFig.2 The expression of TGF-β1 mRNA in the rat lung tissues at 28 d

    2.3 肺組織CTGF的表達(dá)

    CTGF是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長和ECM合成的宿主因子,是TGF-β1促纖維化效應(yīng)的下游介質(zhì),在肺纖維化過程中發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道CTGF蛋白在肺纖維化中表達(dá)顯著增加,與肺間質(zhì)纖維化的程度密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明CTGF在正常陰性對(duì)照組(N組)肺組織均為弱表達(dá)或不表達(dá)。博來霉素陽性對(duì)照組(B組)CTGF的表達(dá)在從7 d開始出現(xiàn)升高,14 d達(dá)到高峰,以后出現(xiàn)下降。高、中濃度鹽酸組(H、M組)CTGF表達(dá)隨時(shí)間增加而增強(qiáng),自42d起與博來霉素組差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)果見表4及圖3(彩插8)。

    表4 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織CTGF表達(dá)(A值,±s)Tab.4 The expression of CTGF in rat lung tissue at different time points in each group(A,±s)

    表4 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織CTGF表達(dá)(A值,±s)Tab.4 The expression of CTGF in rat lung tissue at different time points in each group(A,±s)

    注:與N組比較,*P<0.05;與B組比較,▲P<0.05;與H組比較,◆P<0.05Note:Compared with the normal group,*P<0.05;Compared with the bleomycin group,▲P<0.05;Compared with the group H,◆P<0.05

    組別(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N組(Normal group)1269.67±427.30 1388.83±200.71 1415.17±376.54 1313.17±434.63 B組(Bleomycin group)3906.83±798.86*4873.67±730.18*3887.17±728.11*3143.17±598.97*H組(Group H)1839.50±473.74▲2233.33±616.78*▲2646.33±861.03*▲3044.00±649.84*M組(Group M)1759.83±270.66▲1784.00±313.46▲2325.83±684.07*▲2739.67±634.44*L組(Group L)1469.50±301.67▲1657.67±314.71▲◆1961.00±320.52▲2408.50±606.19*▲

    2.4 肺組織I型膠原的表達(dá)

    由于纖維化的肺中過度的TGF-β1和CTGF的表達(dá),導(dǎo)致I型和III型膠原的增生,膠原在肺間質(zhì)中沉積,使肺組織基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂形成纖維化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,博來霉素陽性對(duì)照組(B組)大鼠各時(shí)間點(diǎn)肺組織I型膠原表達(dá)均顯著高于正常陰性對(duì)照組(N組)(P<0.05),與肺組織病理形態(tài)學(xué)改變相一致;高中低3個(gè)濃度鹽酸組(H、M、L組)各時(shí)間點(diǎn)I型膠原表達(dá)始終低于博來霉素組(P<0.05)。中低濃度鹽酸組自28d起I型膠原纖維表達(dá)強(qiáng)于正常陰性對(duì)照組(P<0.05),但始終沒有達(dá)到高濃度鹽酸組及博來霉素組的I型膠原表達(dá)程度。結(jié)果見表5、圖4(彩插8)。

    表5 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織I型膠原表達(dá)(I A值,×103,±s)Tab.5 The expression of collagen type I in the rat lung tissues at different time points in each group(I A,×103,±s)

    表5 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠肺組織I型膠原表達(dá)(I A值,×103,±s)Tab.5 The expression of collagen type I in the rat lung tissues at different time points in each group(I A,×103,±s)

    注:與N組比較,*P<0.05;與B組比較,▲P<0.05;與H組比較,◆P<0.05Note:Compared with the normal group,*P<0.05;Compared with the bleomycin group,▲P<0.05;Compared with the group H,◆P<0.05

    組別(Group)7 d 14 d 28 d 42 d N組(Normal group)14.12±5.31 15.51±4.66 14.69±5.86 18.49±4.94 B組(Bleomycin group)39.91±13.73*58.31±21.37*82.99±11.53*79.95±10.97*H組(Group H)21.84±7.24▲37.28±13.67*▲46.72±15.96*▲60.12±10.19*▲M組(Group M)18.65±6.32▲22.63±11.25▲◆33.03±3.67*▲◆40.37±14.89*▲◆L組(Group L)14.20±5.23▲16.80±7.77▲◆28.36±11.22*▲◆36.82±8.79*▲◆

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)通過反復(fù)多次微量低濃度酸注入,既模擬胃食管反流引起的微量誤吸,又可以觀察酸對(duì)肺纖維化發(fā)生發(fā)展所起的作用以及纖維化程度與酸的濃度的關(guān)聯(lián)性,防止了肺水腫的發(fā)生。通過觀察7、14、28及42 d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的肺組病理學(xué)改變、TGF-β1mRNA、TGF-β下游因子CTGF的表達(dá)、I型膠原纖維定量來了解實(shí)驗(yàn)性酸吸入對(duì)肺組織的真正影響。

    博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型雖然無法完全模擬人類IPF的慢性纖維化進(jìn)展過程[13],但由于目前尚無更好的動(dòng)物模型,仍是目前公認(rèn)的和人類肺間質(zhì)纖維化最相似的動(dòng)物模型[14-15]。因此本實(shí)驗(yàn)選用博來霉素造模作為陽性對(duì)照組,生理鹽水組作為陰性對(duì)照組,與3個(gè)不同濃度的鹽酸組進(jìn)行比較。

    肺組織病理結(jié)果顯示,正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)正常,而博來霉素組大鼠早期即出現(xiàn)肺間質(zhì)纖維化,后期隨時(shí)間推移有所下降,與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[16]。而3個(gè)鹽酸組的肺泡炎呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì),從28 d起全面超過博來霉素組。這表明3個(gè)鹽酸組的肺泡炎從范圍和程度上不斷增加。并隨時(shí)間推移和滴注鹽酸次數(shù)的增加,纖維化程度逐漸增強(qiáng)。

    在參與肺纖維化的細(xì)胞因子中,TGF-β是作用最為關(guān)鍵的細(xì)胞因子[17]。其中TGF-β1與肺纖維化關(guān)系最為密切,在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。CTGF是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長和ECM合成的宿主因子,是TGF-β1促纖維化效應(yīng)的下游介質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道[18]CTGF蛋白在肺纖維化中表達(dá)顯著增加,與TGF-β1、I型膠原蛋白表達(dá)量呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),3個(gè)濃度鹽酸組肺組織TGF-β1mRNA表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組,且有逐漸增加的趨勢(shì),至第28天和博來霉素組無顯著性差異,CTGF表達(dá)規(guī)律也與此類似,這充分說明鹽酸對(duì)纖維化形成有一定的促進(jìn)作用,可以從基因水平上調(diào)肺組織內(nèi)的TGF-β1及其下游介質(zhì)CTGF蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)肺纖維化發(fā)生發(fā)展。

    由于TGF-β1和CTGF的表達(dá)增加,導(dǎo)致I型膠原的增生[19],膠原在肺間質(zhì)中沉積,使肺組織基質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂形成纖維化[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高中低3個(gè)濃度鹽酸組各時(shí)間點(diǎn)I型膠原表達(dá)都未達(dá)到博來霉素組水平。但都有表達(dá)增加,體現(xiàn)了反復(fù)酸吸入致纖維化并逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,微量酸造成的纖維化速度較為緩慢,但由于反復(fù)不斷的鹽酸滴注刺激引起異常及過度修復(fù),使纖維化進(jìn)程呈進(jìn)行性加重,可能比博來霉素更好的模擬肺纖維化的病程,更加符合生理學(xué)演進(jìn)和疾病發(fā)生發(fā)展過程。

    由于實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)周期限制,雖然鹽酸組的纖維化程度得到體現(xiàn),但實(shí)驗(yàn)性酸吸入的濃度、頻率與天然的胃酸濃度以及GERD胃食管反流的頻率尚存在差距。同時(shí),還應(yīng)該認(rèn)識(shí)到:肺纖維化的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,多種因素的參與并相互作用,還需要用各種手段監(jiān)測(cè)更多的相關(guān)因子來觀察酸對(duì)大鼠肺部的具體作用及其與纖維化之間的關(guān)系。

    綜上所述,實(shí)驗(yàn)性酸吸入可導(dǎo)致肺纖維化。本實(shí)驗(yàn)從一個(gè)角度反映了經(jīng)常性胃食管酸反流引起的酸吸入與肺纖維化的相關(guān)性,雖然并不能完全模擬重建胃食管反流引起酸吸入對(duì)肺部的真正影響,但通過本實(shí)驗(yàn)可以更好地為揭示人類GERD與IPF的關(guān)系提供了初步的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

    (本文圖1、3、4見彩插8。)

    [1]Hawry?kiewicz I,P?ywaczewski R,Dziedzic D,et al. Gastroesophageal reflux disease(GERD)in patients with obstructive sleep apnoea syndrome(OSAS)[J].Pneumonol Alergol Pol,2006,74:361-364.

    [2]Weldon DR.Gastroesophageal reflux disease and sinusitis:their role in patients with chronic cough[J].A llergy Asthma Proc,2006,27:36-44.

    [3]Havemann BD,Henderson CA,El-Serag HB.The association between gastro-oesophageal reflux disease and asthma:a systematic review[J].Gut,2007,56:1654-1664.

    [4]Kempainen RR,Savik K,Whelan TP,et al.High prevalence of proximal and distal gastroesophageal reflux disease in advanced COPD[J].Chest,2007,131:1666-1671.

    [5]王萍,秦雪冰,王瑞娟,等.胃食管反流與慢性阻塞性肺疾病急性加重的關(guān)系探討[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志,2007,6:177-179,193.

    [6]Mays EE,Dubois JJ,Hamilton GB.Pulmonary fibrosis associated with tracheobronchial aspiration:a study of the frequency of hiatal hernia and gastroesophageal reflux in interstitial pulmonary fibrosis of obscure etiology[J].Chest,1976,69(4):512–515.

    [7]Johnson DA,Drane WE,Curran J,et al.Pulmonary disease in progressive systemic sclerosis:a complication of gastroesophageal reflux and occult aspiration[J]?Archiv Intern Med,1989,149 (3):589-593.

    [8]Tobin RW,Pope CE,Pellegrini CA,et al.Increased prevalence of gastroesophageal reflux in patients with idiopathic pulmonary fibrosis[J].Am J Resp Crit Care Med,1998,158(6):1804-1808.

    [9]Salvioli B,Belmonte G,Stanghellini V,et al.Gastrooesophageal reflux and interstitial lung disease[J].Digest Liver Dis,2006,38(12):879-884.

    [10]Raghu G,F(xiàn)reudenberger TD,Yang S,et al.High prevalence of abnormal acid gastro-oesophageal reflux in idiopathic pulmonary fibrosis[J].Eur Resp J,2006,27(1):136-142.

    [11]Popper H,Juettner F,Pinter J.The gastric juice aspiration syndrome(Mendelson syndrome).Aspects of pathogenesis and treatment in the pig[J].Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 1986;409:105-117

    [12]Szapiel SV,Elson NA,F(xiàn)ulmer JD,et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude,athymic mouse[J]. Am Rev Respir Dis,1979,120,(4):893-899.

    [13]Moeller A,Rodriguez-Lecompte JC,Wang L,et al.Models of pulmonary fibrosis[J].Drug Discov Today:Disease Models,2006,3:243-249.

    [14]張曉曄,志村早苗;增田轍,等.博來霉素靜脈注射制備小鼠肺間質(zhì)纖維化模型[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2007,15(4): 241-243

    [15]胡靜,劉旭凌.經(jīng)鼻滴入博來霉素致小鼠肺纖維化模型的建立及其病理演變[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2009,17(5):351-353

    [16]張德平,莊誼,孟凡青,等.γ干擾素對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺纖維化大鼠肺泡炎和肺纖維化的影響[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志,2006,5:189-192.

    [17]Lasky JA,Brody AR.Interstitial fibrosis and growth factors[J]. Environ Health Peep,2000,108:751-762.

    [18]葉旭軍,徐啟勇,葉燕青.結(jié)締組織生長因子在博來霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化模型中的表達(dá)及意義[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2004,27(6):407-409.

    [19]Thannickal VJ,Toews GB,White ES,et al.Mechanisms of pulmonary fibrosis[J].Annu Rev Med,2004,55:395-417

    [20]Ghosh AK.Factors involved in the regulation of type I collagen gene expression:implication in fibrosis[J].Exp Biol Med,2002,227(5):301-314.

    Correlation of Experim ental Acid Aspiration and Pulm onary Fibrosis in Rats

    CHEN Shi1,ZHANG De-ping2
    (1.Nanjing Chest Hospital,Nanjing 210029,China;2.The Affiliated Drum Tower Hospital,Nanjing University Medical College.Nanjing 210008)

    ObjectiveTo study the pathology and possible mechanism of experimental hydrochloric acid(HCl) inhalation induced pulmonary fibrosis in rats and make a comparison with traditional bleomycin-induced fibrosis.M ethods 120 male SD rats were random ly divided into nomal control group,bleomycin group,high-dose HCl group,middle-dose HCl group and low-dose HCl group.The bleomycin group was intratracheally injected bleomycin once to induce pulmonary fibrosis.The three HCl groups were intratracheally injected HCl once per week.The control group was given saline in the same way.Six rats of each group were random ly sacrificed on day 7,14,28 and 42,respectively.The histological changes of the lung tissue were evaluated by HE and Masson's trichrome staining.The mRNA expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1)was assayed by RT-PCR,and the CTGF and collagen type I protein expressions were analyzed by immunohistochemistry.ResultsThe hydrochloride group had a significantly higher extent of alveolitis(P<0.01),reaching a peak at the first 2 weeks,and then still maintained at a relatively high status,and from 28 d to reach or exceed that in the bleomycin group.Hydrochloric acid group fibrosis gradually increases over time,significantly higher(P<0.01 or 0.05),but not consistently exceeded that in the bleomycin group(P>0.05).Similar results appeared in the TGF-β1mRNA,I-collagen and CTGF expression in immunohistochemical assessment.ConlusionThe results of this studyindicate from the point of view a relationship between recurrent gastro-esophageal acid reflux caused by acid inhalation and pulmonary fibrosis,and provides preliminary experimental evidence for the relationship between gastroesophageal reflux disease(GERD)and idiopathic pulmonary fibrosis(IPF).

    Pulmonary fibrosis;GERD;Hydrochloric acid;bleomycin;Rat

    R-33

    A

    1005-4847(2010)04-0335-06

    2009-09-27

    江蘇省醫(yī)學(xué)135重點(diǎn)人才資助項(xiàng)目(編號(hào):RC2001005)。

    陳石(1981-),男,研究方向:間質(zhì)性肺病。E-mail:cshonest1981@sina.com

    張徳平,E-mail:dpzhang207@yahoo.com.cn

    猜你喜歡
    博來霉素肺纖維化膠原
    我國研究人員探索肺纖維化治療新策略
    中老年保健(2022年2期)2022-11-25 23:46:31
    遺傳性T淋巴細(xì)胞免疫缺陷在百草枯所致肺纖維化中的作用
    硫化氫對(duì)博來霉素致肺纖維化大鼠TGF-β1介導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程影響
    液相色譜法測(cè)定注射用鹽酸博來霉素組分
    特發(fā)性肺纖維化合并肺癌
    膠原無紡布在止血方面的應(yīng)用
    抑制PARP1活性對(duì)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的改善作用
    沙利度胺治療肺纖維化新進(jìn)展
    紅藍(lán)光聯(lián)合膠原貼治療面部尋常痤瘡療效觀察
    重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合順鉑和博來霉素治療肺癌惡性胸腔積液的效果比較
    欧美黄色淫秽网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| a级毛片在线看网站| 波多野结衣av一区二区av| 精品高清国产在线一区| 一区二区三区精品91| 夜夜爽天天搞| 精品国产亚洲在线| 国产精品永久免费网站| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 午夜福利影视在线免费观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 69av精品久久久久久| 亚洲久久久国产精品| 午夜a级毛片| 午夜两性在线视频| 欧美乱色亚洲激情| 老司机深夜福利视频在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| av网站免费在线观看视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久香蕉国产精品| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 黄色视频不卡| 久久久久久大精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文字幕高清在线视频| aaaaa片日本免费| 黄色片一级片一级黄色片| 性欧美人与动物交配| 精品欧美一区二区三区在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 黄色片一级片一级黄色片| 午夜免费激情av| 午夜精品在线福利| 男人的好看免费观看在线视频 | 亚洲久久久国产精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品久久久久久,| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产xxxxx性猛交| 欧美黑人精品巨大| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精品在线观看二区| 9色porny在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 在线观看日韩欧美| 久久久水蜜桃国产精品网| 又黄又粗又硬又大视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲第一av免费看| 国内精品久久久久精免费| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久中文看片网| 精品人妻1区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩精品中文字幕看吧| 丁香六月欧美| 久久青草综合色| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 黄片大片在线免费观看| 国产在线观看jvid| 在线观看免费视频日本深夜| 91在线观看av| 色av中文字幕| 三级毛片av免费| 国产精华一区二区三区| 免费观看人在逋| 国产成年人精品一区二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 成人国产一区最新在线观看| 午夜激情av网站| 成人永久免费在线观看视频| 久久青草综合色| 多毛熟女@视频| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 免费看十八禁软件| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 国产一区在线观看成人免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 男女午夜视频在线观看| 悠悠久久av| 手机成人av网站| 不卡av一区二区三区| 一级毛片高清免费大全| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 十分钟在线观看高清视频www| 嫩草影院精品99| 99在线人妻在线中文字幕| 国产一卡二卡三卡精品| 久久狼人影院| 亚洲少妇的诱惑av| 国产午夜福利久久久久久| 国产在线精品亚洲第一网站| 99久久国产精品久久久| 久久午夜亚洲精品久久| cao死你这个sao货| 在线永久观看黄色视频| 午夜福利欧美成人| 亚洲国产精品999在线| 午夜免费成人在线视频| 亚洲三区欧美一区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 韩国av一区二区三区四区| 黄色a级毛片大全视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 成年女人毛片免费观看观看9| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 九色亚洲精品在线播放| 搡老岳熟女国产| 国产午夜福利久久久久久| 亚洲欧美激情在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲在线自拍视频| 午夜老司机福利片| 一本久久中文字幕| 午夜福利视频1000在线观看 | 亚洲av成人一区二区三| 黄色a级毛片大全视频| 制服人妻中文乱码| 午夜福利成人在线免费观看| 两人在一起打扑克的视频| 久久香蕉激情| 在线观看午夜福利视频| 天天添夜夜摸| 亚洲男人天堂网一区| 久久精品国产综合久久久| 欧美黄色淫秽网站| 欧美色视频一区免费| 久久精品91无色码中文字幕| 久久人妻熟女aⅴ| 香蕉丝袜av| 国产黄a三级三级三级人| 欧美午夜高清在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 自线自在国产av| 不卡一级毛片| 成人特级黄色片久久久久久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 9色porny在线观看| 制服诱惑二区| 黄色片一级片一级黄色片| 精品熟女少妇八av免费久了| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美乱妇无乱码| 久久午夜亚洲精品久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99国产精品免费福利视频| 婷婷六月久久综合丁香| 精品人妻在线不人妻| 他把我摸到了高潮在线观看| 婷婷六月久久综合丁香| 免费看美女性在线毛片视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜日韩欧美国产| 12—13女人毛片做爰片一| 国产91精品成人一区二区三区| 天天添夜夜摸| 欧美日韩福利视频一区二区| 日本vs欧美在线观看视频| 男男h啪啪无遮挡| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲精品国产区一区二| 日本 av在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 好男人在线观看高清免费视频 | 99香蕉大伊视频| 最新美女视频免费是黄的| 国语自产精品视频在线第100页| 自线自在国产av| 国产高清激情床上av| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲av片天天在线观看| 精品第一国产精品| 精品高清国产在线一区| 国产精品电影一区二区三区| 一级毛片精品| 色尼玛亚洲综合影院| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av熟女| 午夜免费激情av| a在线观看视频网站| 国产91精品成人一区二区三区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产精品免费一区二区三区在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 黄色 视频免费看| 久久天堂一区二区三区四区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 成人三级做爰电影| 亚洲天堂国产精品一区在线| 丝袜美足系列| 欧美国产精品va在线观看不卡| 成年女人毛片免费观看观看9| 高清在线国产一区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 男人操女人黄网站| 日本a在线网址| 免费人成视频x8x8入口观看| 露出奶头的视频| av在线天堂中文字幕| 成在线人永久免费视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 1024香蕉在线观看| 亚洲av成人av| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产又爽黄色视频| 999精品在线视频| 亚洲全国av大片| 激情视频va一区二区三区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产精品国产高清国产av| 免费无遮挡裸体视频| 久久国产精品影院| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜两性在线视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 在线观看一区二区三区| 88av欧美| 亚洲av美国av| 久久久国产精品麻豆| 久久久久久久精品吃奶| 黄色视频不卡| 极品教师在线免费播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲成av人片免费观看| 国产色视频综合| 99精品久久久久人妻精品| 99精品久久久久人妻精品| 狂野欧美激情性xxxx| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久伊人香网站| 丁香六月欧美| 亚洲一区二区三区不卡视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 成人国产综合亚洲| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 丝袜美腿诱惑在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 后天国语完整版免费观看| e午夜精品久久久久久久| 国产片内射在线| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 99久久99久久久精品蜜桃| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲全国av大片| 日本欧美视频一区| www.999成人在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 两性夫妻黄色片| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲国产中文字幕在线视频| 人人澡人人妻人| 天天一区二区日本电影三级 | 国产亚洲精品一区二区www| 在线观看www视频免费| 成人三级黄色视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品 国内视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲成人久久性| 免费看a级黄色片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 热99re8久久精品国产| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 在线观看免费视频日本深夜| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 天堂√8在线中文| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久香蕉精品热| 午夜两性在线视频| 在线天堂中文资源库| 无人区码免费观看不卡| 国产亚洲精品av在线| 国产不卡一卡二| 高清毛片免费观看视频网站| 九色国产91popny在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 啦啦啦 在线观看视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产乱人伦免费视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产av又大| 久久久久久久久中文| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 亚洲精品一区av在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 黄色 视频免费看| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久久久人人人人人| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 91老司机精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费搜索国产男女视频| 9色porny在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美一级毛片孕妇| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲人成77777在线视频| 色av中文字幕| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品精品国产色婷婷| 国产片内射在线| 国产成人欧美| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲avbb在线观看| 悠悠久久av| 国产成人精品无人区| 久久人妻av系列| 纯流量卡能插随身wifi吗| 黑丝袜美女国产一区| 久久久久精品国产欧美久久久| 丝袜在线中文字幕| 一夜夜www| 国产精品一区二区免费欧美| 村上凉子中文字幕在线| 一区二区三区精品91| 9191精品国产免费久久| 久热这里只有精品99| 操出白浆在线播放| 天天一区二区日本电影三级 | 久久影院123| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品久久视频播放| netflix在线观看网站| 一a级毛片在线观看| 久99久视频精品免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久 | 色哟哟哟哟哟哟| av在线天堂中文字幕| av天堂久久9| 午夜福利18| 午夜福利视频1000在线观看 | 免费高清在线观看日韩| 久久久久久久久免费视频了| 日本五十路高清| 久久久久九九精品影院| 美国免费a级毛片| 精品国产美女av久久久久小说| 久久这里只有精品19| 少妇 在线观看| 免费高清在线观看日韩| 天堂影院成人在线观看| 韩国精品一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 我的亚洲天堂| 亚洲国产看品久久| bbb黄色大片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | bbb黄色大片| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲国产精品999在线| 久99久视频精品免费| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲九九香蕉| 淫妇啪啪啪对白视频| 在线视频色国产色| 在线观看午夜福利视频| 9191精品国产免费久久| 18禁国产床啪视频网站| 精品国产一区二区久久| 欧美日韩精品网址| 久久久国产精品麻豆| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 午夜福利高清视频| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲精品在线观看二区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜福利免费观看在线| www.熟女人妻精品国产| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 中国美女看黄片| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美黄色片欧美黄色片| 最新在线观看一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人欧美大片| 国产91精品成人一区二区三区| 中文字幕色久视频| 大型黄色视频在线免费观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 级片在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 成人三级黄色视频| x7x7x7水蜜桃| 一区二区三区高清视频在线| 1024视频免费在线观看| 色综合婷婷激情| 啦啦啦 在线观看视频| 日本在线视频免费播放| 最好的美女福利视频网| 欧美午夜高清在线| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产午夜福利久久久久久| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 黄片大片在线免费观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲av成人一区二区三| 国产精品二区激情视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 男女午夜视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 香蕉久久夜色| 成人亚洲精品一区在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 午夜免费观看网址| 亚洲avbb在线观看| 日本欧美视频一区| e午夜精品久久久久久久| 成人av一区二区三区在线看| 精品国产一区二区三区四区第35| 很黄的视频免费| 丝袜在线中文字幕| 国产精华一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲人成77777在线视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 久久精品国产清高在天天线| 国产单亲对白刺激| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产亚洲av嫩草精品影院| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久精品人人爽人人爽视色| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产91精品成人一区二区三区| svipshipincom国产片| 美女午夜性视频免费| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲全国av大片| 精品欧美国产一区二区三| 午夜两性在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产成+人综合+亚洲专区| 深夜精品福利| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产av在哪里看| 女警被强在线播放| 亚洲三区欧美一区| 黄片大片在线免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲,欧美精品.| 日韩有码中文字幕| 欧美日本视频| 国产高清视频在线播放一区| 日本欧美视频一区| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲av成人av| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本a在线网址| 午夜久久久在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看 | 好男人电影高清在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 激情视频va一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 亚洲精品在线美女| 欧美成狂野欧美在线观看| 少妇 在线观看| 久久精品成人免费网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 18禁美女被吸乳视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 丝袜美腿诱惑在线| av电影中文网址| 黄色视频,在线免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美激情 高清一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 久久天堂一区二区三区四区| 欧美大码av| 99热只有精品国产| 精品一区二区三区av网在线观看| 宅男免费午夜| 欧美久久黑人一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 一区二区三区高清视频在线| 欧美日韩一级在线毛片| 国产高清视频在线播放一区| 好男人在线观看高清免费视频 | www.自偷自拍.com| 日本一区二区免费在线视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 999久久久国产精品视频| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 精品一区二区三区四区五区乱码| 不卡一级毛片| a在线观看视频网站| 动漫黄色视频在线观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 亚洲少妇的诱惑av| e午夜精品久久久久久久| 搡老岳熟女国产| 亚洲精品国产一区二区精华液| 色综合亚洲欧美另类图片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 十八禁网站免费在线| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 窝窝影院91人妻| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文字幕av电影在线播放| 美女免费视频网站| 桃色一区二区三区在线观看| 丁香欧美五月| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产私拍福利视频在线观看| 人人澡人人妻人| 欧美激情极品国产一区二区三区| 麻豆一二三区av精品| 99国产综合亚洲精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 色播亚洲综合网| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品久久国产高清桃花| 老司机靠b影院| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品 欧美亚洲| 精品乱码久久久久久99久播| 看片在线看免费视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 无限看片的www在线观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av片天天在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美日韩精品网址| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久久人人人人人| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 桃红色精品国产亚洲av| 老司机靠b影院| 操美女的视频在线观看| 一a级毛片在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久精品影院6| 韩国av一区二区三区四区| 国产成人精品久久二区二区91| 少妇 在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久人妻av系列| 亚洲人成77777在线视频| 成人国产综合亚洲| 大香蕉久久成人网| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成熟少妇高潮喷水视频|