環(huán)境雌激素實驗室模擬暴露方法

劉晶靚，潘學(xué)軍，黃斌，方鍇，高建培

(昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明 650093)

綜述·進展

環(huán)境雌激素實驗室模擬暴露方法

劉晶靚，潘學(xué)軍，黃斌，方鍇，高建培

(昆明理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南昆明 650093)

從實驗魚類、暴露系統(tǒng)、暴露方式、評價指標四個方面對國內(nèi)外環(huán)境雌激素的實驗室暴露研究方法進行了介紹，為環(huán)境雌激素的暴露機制、毒性機理及雌激素效應(yīng)的研究提供了理論依據(jù)和實驗指導(dǎo)。

環(huán)境雌激素;實驗魚類;實驗室暴露;評價指標

環(huán)境雌激素(environmental estrogens，EEs)是指能通過與雌激素受體結(jié)合或影響細胞信號途徑等其他方式模仿雌激素，發(fā)揮類似于內(nèi)生雌激素的作用，從而擾亂生物機體正常激素作用的化合物［1］。雌激素按來源通常分為外源性雌激素(壬基酚、雙酚A、已烯雌酚、炔雌醇等)和內(nèi)源性雌激素(雌二醇、雌酮、雌三醇等)。環(huán)境雌激素的存在會干擾人類及野生動物內(nèi)分泌系統(tǒng)，從而對機體的生殖發(fā)育、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多方面產(chǎn)生異常的效應(yīng)。大量的環(huán)境調(diào)查和實驗室研究表明，環(huán)境雌激素會導(dǎo)致人類睪丸癌、前列腺癌、乳腺癌、子宮癌等發(fā)病率的增加、動物生育率的下降、部分生態(tài)系統(tǒng)中動物雌雄比例的失調(diào)等［2－4］。

環(huán)境雌激素對野生動物的影響是國際上環(huán)境雌激素研究的熱點，其中水生生物的暴露結(jié)果認可性較高。魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)中處于食物鏈頂端的水生生物，具有與哺乳動物類似的生理系統(tǒng)，在魚類中發(fā)現(xiàn)的雌激素效應(yīng)可以用來預(yù)測環(huán)境雌激素對人類的影響。因此，在實驗動物的選擇上，魚類成為了環(huán)境毒理學(xué)者的首選［5］。

本文從實驗魚類、暴露系統(tǒng)、暴露方式、評價指標四方面對國內(nèi)外典型環(huán)境雌激素實驗室暴露的研究進行了總結(jié)，力求為環(huán)境雌激素實驗室模擬暴露中魚類實驗動物的選擇、環(huán)境雌激素實驗室暴露機制、長期慢性毒性機制及雌激素效應(yīng)的研究提供實驗和理論依據(jù)。

1 實驗魚類

魚類在水生生態(tài)系統(tǒng)中處于食物鏈頂端，可在其各組織和脂肪中富集環(huán)境雌激素，當濃度達到閾值時便會影響其生長、發(fā)育、成熟、繁殖，甚至導(dǎo)致死亡。目前在國際上使用較多的實驗魚類主要包括青鳉、黑頭軟口鰷、斑馬魚和虹鱒等［6］。我國魚類實驗動物的研究相對較落后，但一些研究機構(gòu)也已篩選出一些比較有特色的實驗魚種，其中稀有鮈鯽作為實驗魚類在環(huán)境雌激素的研究中得到了廣泛應(yīng)用。

1.1 青鳉

青鳉(Oryzias iatipes)是一種淡水鳉科魚類，分布于日本、朝鮮、中國臺灣和東南亞等國家或地區(qū)。青鳉個體小，全長3.0～4.0 cm，成熟期短(6～8周)，卵殼透明易觀察，適合在實驗室條件下飼養(yǎng)和培育。成年魚的性別可以通過觀察臀鰭和背鰭的形狀進行較準確的區(qū)分。早在上世紀50年代青鳉就被用作實驗魚類，其基礎(chǔ)生物學(xué)的研究比較充分［7］，目前全世界眾多研究機構(gòu)使用青鳉作為實驗魚類進行環(huán)境雌激素的研究［8］。

1.2 黑頭軟口鰷

黑頭軟口鰷(Pimephale spromelas)，一種普通的淡水小型鯽科魚類，被廣泛用于水生毒性測試，目前是經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)和美國環(huán)境保護局(USEPA)推薦的魚類實驗動物。早期分布范圍局限于北美中部，現(xiàn)在已經(jīng)被引種到北美的大部分地區(qū)。黑頭軟口鰷個體小，全長為3.5～7.5 cm，4～5個月就達到性成熟。最重要的是，黑頭軟口鰷經(jīng)實驗室模擬暴露后的產(chǎn)卵量、孵化率、受精率等繁殖指標不太容易受實驗室人為操作的影響［9］。同時眾多的實驗結(jié)果表明，黑頭軟口鰷是進行環(huán)境雌激素研究較理想的實驗魚類［10，11］。

1.3 斑馬魚

斑馬魚(Brachydanio rerio)是一種鯉科小型魚類，原產(chǎn)于印度和緬甸東部。斑馬魚個體小，全長4～5cm，生命周期短(4個月)。斑馬魚在性分化之前處于雌雄同體階段，無顯著的第二特征，成年雌雄依靠體色以及臀鰭來區(qū)分［12］。斑馬魚最早用于遺傳學(xué)研究，但隨著轉(zhuǎn)基因斑馬魚的問世，在環(huán)境雌激素研究中的適用范圍也變得非常廣泛［13，14］。

1.4 虹鱒

虹鱒(Oncorhynchus mykiss)是冷水性魚類，個體較大。虹鱒達到性成熟的時間長，繁殖的季節(jié)性強，性成熟個體沿側(cè)線有一條寬的彩虹色帶。在毒性測試中，虹鱒不適合性分化、性成熟以及繁殖效應(yīng)的評估［15］，在環(huán)境雌激素的研究中多用其幼魚作為實驗魚類［16，17］.

1.5 稀有鮈鯽

稀有鮈鯽(Obiocypris rarus)是我國西南地區(qū)特有的一種小型鯉科魚類。該魚個頭小，生命力強，適合在實驗室飼養(yǎng)。其繁殖周期短，產(chǎn)卵批次多，繁殖力比較強。稀有鮈鯽對化學(xué)毒物較敏感，與世界上常用的小型實驗魚類相比具有相似的生物學(xué)特點，在中國稀有鮈鯽已成為一種理想的毒性實驗材料而得到廣泛運用［18］。

除稀有鮈鯽外，我國用于環(huán)境雌激素研究的魚種還有一些比較有特色的實驗魚類。如中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心選擇的泥鰍［19］，廣州中山大學(xué)和華東師范大學(xué)選擇的鯽魚［20］等。同時，本實驗室也嘗試選擇高背鯽魚作為實驗魚類，對其進行實驗室模擬暴露，并與滇池網(wǎng)箱放養(yǎng)結(jié)合起來研究外源性雌激素(EE2)和內(nèi)源性雌激素(E2)的單一及混合雌激素效應(yīng)。高背鯽魚是滇池特有的土著魚類，也是滇池主要的捕撈對象。該魚適應(yīng)性強，生長快，性成熟早，繁殖能力強，并以雌核發(fā)育生殖方式繁殖后代。因此選擇具有滇池特色的高背鯽魚作為實驗魚類，對開展滇池水環(huán)境中雌激素物質(zhì)的生物效應(yīng)研究具有重要意義。

2 暴露系統(tǒng)

暴露途徑主要有水體暴露、喂食和體內(nèi)注射三種。其中水體暴露因最接近魚類的自然生存方式而成為最常用的暴露方法。水體暴露分為靜水暴露、半靜水暴露和流水式暴露。在進行魚類暴露實驗時，若使用靜水或半靜水會對魚類的生長和繁殖產(chǎn)生較大的影響，特別是進行長期的暴露實驗，其結(jié)果在很大程度上受到置疑，因此在對魚類進行環(huán)境雌激素實驗室暴露時，應(yīng)選擇流水式暴露系統(tǒng)以確保其暴露濃度的穩(wěn)定和精準［21］。

國際上對環(huán)境雌激素進行實驗室模擬暴露的科研機構(gòu)大部分采用流水式暴露系統(tǒng)，但目前對于這一系統(tǒng)并沒有可參考的規(guī)范，一般都是各個實驗室根據(jù)自己的實際情況自行設(shè)計制作。圖1是目前應(yīng)用最為廣泛的流水式暴露系統(tǒng)示意圖。它主要包括進水處理系統(tǒng)、暴露物處理系統(tǒng)、混合系統(tǒng)、暴露系統(tǒng)、光照系統(tǒng)、出水處理系統(tǒng)及水管系統(tǒng)等［22］。

進水處理系統(tǒng):自來水經(jīng)活性炭吸附處理后進入貯水池，貯水池中包括控溫棒、增氧曝氣裝置。對自來水進行曝氣增氧及適當加溫，通過蠕動泵或玻璃轉(zhuǎn)子流量計來控制其流速后進入混勻器，為整個暴露系統(tǒng)提供新鮮水。實驗中需監(jiān)測的水質(zhì)指標包括:pH、硬度、溶解氧、溫度、余氯含量、氨含量、電導(dǎo)率等。

圖1 流水式暴露系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of a flow－through exposure system

暴露物處理系統(tǒng):配置好濃度的暴露物儲備液經(jīng)注射泵供應(yīng)到混勻器中。多通道的注射泵擁有多個玻璃注射器，可裝入不同暴露物或不同濃度的同一暴露物，方便進行多種濃度及物質(zhì)的暴露研究。

混合系統(tǒng):經(jīng)進水處理系統(tǒng)處理過的自來水和暴露物質(zhì)同時加到混勻器中，通過磁力攪拌器將兩者充分混勻后注入暴露缸，或依靠物理紊流混勻，無需動力。

暴露系統(tǒng):由魚缸和出水管組成。魚缸采用一次成型的玻璃缸或不銹鋼水箱，出水管在避免魚隨水流出的同時，保證了整個系統(tǒng)的正常流通。

光照系統(tǒng):該系統(tǒng)由日光燈和電子定時器組成，通過設(shè)定照明和關(guān)閉的時間來控制暴露系統(tǒng)的光照周期。

出水處理系統(tǒng):為減少實驗過程中對環(huán)境的污染，出水不能直接排入下水道，而應(yīng)先經(jīng)過活性炭處理后再排出。

水管系統(tǒng):整個系統(tǒng)的水管均為不銹鋼水管，保證實驗過程中背景化學(xué)品溶出量的減少。

3 暴露方式

環(huán)境中存在著大量的環(huán)境雌激素，在了解單種環(huán)境雌激素的雌激素活性同時，還需聯(lián)系實際環(huán)境研究多種環(huán)境雌激素的相互作用及作用的方式，因此在實驗室模擬暴露中環(huán)境雌激素暴露分為單一暴露和混合暴露這兩種暴露方式。

3.1 單一暴露

單一暴露是只選擇一種環(huán)境雌激素，設(shè)定不同的濃度來對實驗魚類進行實驗室暴露研究。單一環(huán)境雌激素暴露可以對單種環(huán)境雌激素在實驗魚類內(nèi)的雌激素活性及其作用機制進行詳細深入的研究，能獲得單種環(huán)境雌激素的毒理學(xué)數(shù)據(jù)。對于環(huán)境雌激素的研究而言，單一暴露是基礎(chǔ)和必要的。目前，關(guān)于單一環(huán)境雌激素實驗室模擬暴露的報道非常多，主要集中在炔雌醇、烷基酚和雙酚A等化合物的研究。

3.2 混合暴露

混合暴露是兩種或兩種以上的環(huán)境雌激素，同樣設(shè)定多種濃度對實驗魚類進行實驗室暴露實驗。與單一暴露相比，混合暴露更注重雌激素之間的相關(guān)作用［23］。在實際的環(huán)境體系中存在著多種具有不同雌激素活性的化合物，基于單種物質(zhì)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)很難正確評估其生態(tài)效應(yīng)及風(fēng)險，因此研究混合雌激素活性比研究單一雌激素更符合實際環(huán)境所存在的狀態(tài)。

周密詳盡的暴露實驗設(shè)計可最大限度地獲得可靠的暴露結(jié)果，有助于揭示環(huán)境雌激素對實驗魚類產(chǎn)生的一系列雌激素效應(yīng)。因此在選擇好適宜的實驗魚類和暴露方式后，還需確定好暴露物質(zhì)的濃度分組、在實驗中除暴露實驗組外還需要設(shè)立對照組(溶劑對照和空白對照)和平行組，從而提高實驗結(jié)果的可靠性。同時實驗魚類生命階段(生命早期階段、性分化階段、未成熟階段、成熟階段、繁殖階段和整個生命周期)的選擇也決定了整個暴露研究的結(jié)果.

4 評價指標

在環(huán)境雌激素對魚類實驗室模擬暴露后，我們可以在分子、細胞、組織、個體及種群水平等多方面來表征環(huán)境雌激素的暴露及效應(yīng)的生化、生理、行為或能量上的變化。評價指標包括行為觀察;死亡率、生長率;各組織中環(huán)境雌激素的濃度及生物富集因子;性腺指數(shù)(GSI)和肝臟指數(shù)(HSI);血清中卵黃蛋白原含量(Vtg);魚鰓、性腺、肝、腎等靶器官的病理學(xué)變化;繁殖指標等。

4.1 臟器系數(shù)

通過檢測實驗魚類的臟器系數(shù)可獲得靶器官病理性增長或萎縮的信息，有助于初步判斷環(huán)境雌激素在生物體內(nèi)的作用位點，并能為深入研究其雌激素效應(yīng)提供信息。臟器系數(shù)一般包括性腺指數(shù)(gonadosomatic index，GSI)和肝臟指數(shù)(hepatosomatic index，HSI)。它們分別是將性腺或肝臟的質(zhì)量與魚體總質(zhì)量的比值乘以100而獲得的值。Scholz等［24］發(fā)現(xiàn)在10 ng/L和100 ng/L EE2實驗室模擬暴露中，青鳉的GSI顯著小于空白對照組，該結(jié)果表明青鳉性腺發(fā)育受到了抑制，EE2對青鳉的性腺存在較強毒性作用。Zha等［25］發(fā)現(xiàn)，在10 μg/L、30 μg/L NP和1 ng/L EE2處理組中，雄性稀有鮈鯽的GSI顯著高于空白對照組，而雌性稀有鮈鯽的GSI值只有在5 ng/L和25 ng/L EE2處理組中才明顯下降，結(jié)果表明當GSI作為測試終點時，雄性稀有鮈鯽對NP和EE2的暴露較雌性更為敏感。此外，該研究還指出稀有鮈鯽的HSI值并不隨NP和EE2濃度的增大而表現(xiàn)出明顯變化趨勢。性腺指數(shù)和肝臟指數(shù)在實驗室模擬暴露研究中并不難獲得，而且他們都能較靈敏地反映環(huán)境雌激素對魚體的長期作用效應(yīng)，因此大部分的相關(guān)研究都將臟器指數(shù)作為評估雌激素效應(yīng)的靈敏指標之一。

4.2 卵黃蛋白原含量

卵黃蛋白原(vitellogenin，Vtg)是一種理想的雌激素或類雌激素效應(yīng)的生物標志物［26］。正常情況下，雄魚體內(nèi)沒有卵黃蛋白原，只有發(fā)育成熟的雌魚才能產(chǎn)生卵黃蛋白原，但是雄魚在外源雌激素的暴露下能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生卵黃蛋白原。因此通過檢測實驗魚類血漿、肝組織或整體勻漿中卵黃蛋白原的含量，可以明確指示出環(huán)境雌激素的暴露狀況。同時，其含量的改變還是眾多組織病理學(xué)及生殖效應(yīng)變化的直接原因。卵黃蛋白原的分析檢測方法包括免疫雜交分析、放射性免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附法及間接指示法等，其中酶聯(lián)免疫法(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)目前被較多用于卵黃蛋白原含量的檢測［27］。在眾多天然和人工合成的雌激素物質(zhì)中，EE2、E2、BPA、NP和OP受到了人們較多的關(guān)注。在大量的實驗室模擬暴露研究中發(fā)現(xiàn)，EE2、E2和E1具有很強的雌激素活性，在很低的濃度下就能誘導(dǎo)雄魚和幼魚體內(nèi)產(chǎn)生Vtg［28］;而BPA、NP和OP是具有弱雌激素活性的環(huán)境雌激素，他們在一定濃度下也會誘導(dǎo)Vtg的產(chǎn)生［13，16］。Thorpe等［17］的研究表明，經(jīng)14d的暴露，EE2、E2和E1均能誘導(dǎo)虹鱒幼魚體內(nèi)Vtg水平的顯著性升高，根據(jù)劑量－效應(yīng)曲線計算出EE2、E2和E1的半數(shù)有效濃度分別為0.95、26和60 ng/L，由此看出這三種雌激素的活性大小順序為EE2＞E2＞E1。卵黃蛋白原(Vtg)作為一個重要的雌激素生物標志物，具有特異性和靈敏度高等特點，在環(huán)境雌激素的研究方面顯示出了獨有的優(yōu)勢。

4.3 組織病理學(xué)

組織病理學(xué)是環(huán)境雌激素研究中使用頻率較高的評價指標之一，根據(jù)魚鰓、性腺、肝臟、腎臟等組織切片的觀察結(jié)果能反映出各組織的的病理學(xué)變化。Zha等［25］曾報道稀有鮈鯽在5 ng/L和25 ng/L EE2處理組暴露28d后，肝臟出現(xiàn)了嚴重的損傷，出現(xiàn)肝細胞細胞核增加和肝細胞肥大等現(xiàn)象;Schwaiger等［29］設(shè)計了一系列NP和EE2濃度對鯉魚進行實驗室暴露，研究這兩種環(huán)境雌激素對肝臟和腎臟的組織的影響。發(fā)現(xiàn)NP不會引起任何組織的損傷，而任意EE2處理組中鯉魚的腎臟、肝臟組織都出現(xiàn)了嚴重損傷，包括肝細胞肥大、細胞核變形;腎小管中嗜曙紅物質(zhì)的積累、腎小管上皮細胞的肥大和壞死。Lange等［10］對黑頭軟口鰷進行實驗室長期模擬暴露研究，在4 ng/L EE2處理組暴露305d后，雄魚完全雌性化，精巢全部處于精卵共存狀態(tài)。腎臟在該濃度暴露后出現(xiàn)了大量的嗜曙紅物質(zhì)，上皮細胞出現(xiàn)嚴重損傷甚至壞死;在高劑量的EE2和NP處理組中還發(fā)現(xiàn)了精卵共存現(xiàn)象。

4.4 繁殖指標

魚類的整個繁殖過程都是在雌激素調(diào)節(jié)作用下進行的，因此，環(huán)境雌激素對魚類正常生殖活動的影響是實驗室模擬暴露實驗研究的重要內(nèi)容之一。通常是通過生殖力、繁殖行為、受精率、孵化率、子代存活率及畸形率等評價指標來檢測環(huán)境雌激素對魚類繁殖過程的影響。環(huán)境雌激素對魚類繁殖的影響在眾多實驗室暴露研究中得到了證實。Paw lowski等［11］在實驗室對性成熟的黑頭軟口鰷進行乙炔基雌二醇暴露，在濃度為10 ng/L和100 ng/L EE2下，其產(chǎn)卵數(shù)、受精率明顯下降;Xu等［28］發(fā)現(xiàn)長期暴露在EE2中的斑馬魚，產(chǎn)卵量和受精率不高，精子活力明顯下降;Zha等［30］對稀有鮈鯽的實驗室暴露研究表明了EE2對其子代存活率、畸形率、性別比例的顯著影響。

5 結(jié)語

從國內(nèi)外眾多實驗室的暴露研究來看，選擇合適的魚類實驗動物，建立完善的流水式暴露系統(tǒng)，尋找靈敏的評價指標是目前進行環(huán)境雌激素實驗室研究的主要手段。而我國有關(guān)環(huán)境雌激素的研究起步相對較晚，有關(guān)生態(tài)毒理學(xué)方面的研究還相對較少，因此，開發(fā)和研究合適的實驗室模擬暴露研究方法將成為我國環(huán)境雌激素研究學(xué)者的當務(wù)之急。此外，為反映實際環(huán)境中雌激素的污染的真實狀況，還應(yīng)捕撈野外水環(huán)境中的魚類進行污染物的檢測，或?qū)Ⅳ~類放進野外水環(huán)境或污水處理廠出水口進行網(wǎng)箱放養(yǎng)。因此，如何將環(huán)境雌激素的實驗室研究與野外環(huán)境研究結(jié)合起來將是下一步研究的難點和熱點。

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Research M ethod on Laboratory Exposure of Environm ental Estrogens

LIU Jing－liang，PAN Xue－jun*，HUANG Bin，F(xiàn)ANG Kai，GAO Jiang－pei
(Faculty of Environmental Science and Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming，Yunnan Province，650093，China)

In this paper，the methods of laboratory studies on fish exposure to environmental estrogens were reviewed，which included experimental fish，exposure mode，exposure system and endpoints.The good design of laboratory exposure experiments would provide theoretical basis and experimental guideline for the study on the exposure mechanism，toxicity and estrogenic effect of environmental estrogens.

Environmental estrogens;Experimental fish;Laboratory exposure;Endpoint

Q95－33

A

1005－4847(2010)04－0355－05

2009－10－26

國家環(huán)保公益性行業(yè)科研專項基金(200809136);國家自然科學(xué)基金(20767002);教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金(教外司留［2008］890號);云南省自然科學(xué)基金(2007B035M)。

劉晶靚(1985－)，女，博士研究生，研究方向:環(huán)境雌激素生物效應(yīng)。Email:liujingjing85@yahoo.com.cn

潘學(xué)軍，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。Email:xjpan@kmust.edu.cn