CD68和VEGF在膀胱癌組織及50例正常膀胱組織中的表達(dá)

張新明，郭德迎，何海填，葉宗岳，曹石金，徐 冉

(1. 深圳市蛇口人民醫(yī)院泌尿外科，廣東 深圳 518067；2. 中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院泌尿外科，湖南 長沙 410011)

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，是一種直接威脅患者生存的疾病[1]。膀胱癌手術(shù)后容易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，為臨床治療帶來難題。肌層浸潤性膀胱癌在行根治性膀胱切除后，50%以上的病人會發(fā)生轉(zhuǎn)移，5年生存率36%～54%，其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制亟待進(jìn)一步研究[2-4]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages， TAMs)也稱腫瘤組織局部浸潤巨噬細(xì)胞，在腫瘤組織微環(huán)境中發(fā)揮著免疫抑制效應(yīng)，促進(jìn)瘤內(nèi)血管新生、腫瘤增殖、侵犯及轉(zhuǎn)移[5-8]，目前已經(jīng)有大量TAMs與腫瘤關(guān)系方面的研究，但TAMs在人膀胱癌組織中的表達(dá)在國內(nèi)外尚罕見報道。CD68是一種分子量為110 kDa的糖蛋白，此抗體可作為研究人體多種組織巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物；而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)是一種選擇性的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖，在原位組織誘導(dǎo)血管生長，是腫瘤血管形成過程中的關(guān)鍵因子。本研究以CD68標(biāo)志腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，擬通過研究CD68及VEGF在膀胱癌組織中及正常膀胱組織中的表達(dá)情況，來觀察TAMs及VEGF對膀胱癌的影響，從而為膀胱癌的治療和預(yù)后判斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 于深圳市蛇口人民醫(yī)院和中南大學(xué)湘雅二院共收集2015年1月至2016年12月因膀胱腫瘤行手術(shù)治療的50例患者切除的膀胱腫瘤組織及正常膀胱組織(距腫瘤邊緣5 cm以外)的標(biāo)本?；颊吣挲g40～70歲，其中男性32例，女性18例，術(shù)后病理回報均為高級別浸潤性尿路上皮癌。所有患者術(shù)前均未接受任何放療化療，組織標(biāo)本在液氮中常規(guī)保存。按照倫理委員會的相關(guān)要求，所有患者均術(shù)前簽署手術(shù)標(biāo)本用于科研的同意書。

1.2 CD68和VEGF的表達(dá)測定 采用免疫組化法測定組織中CD68和VEGF的表達(dá)。膀胱癌組織及正常膀胱組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片制作，二甲苯脫蠟后進(jìn)行復(fù)水，30 g/L H2O2室溫孵育5～10 min消除過氧化物酶(內(nèi)源性)的活性，采用熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加50 g/L BSA 進(jìn)行常規(guī)封閉30～45 min。分別加入1∶50 稀釋的兔抗人一抗(CD68或VEGF)，4 ℃冰箱內(nèi)放置12～18 h。PBS 沖洗后加入聚合 HRP 標(biāo)記抗兔 IgG，常溫避光放置30～45 min，PBS 沖洗，用DAB顯色試劑盒顯色，再進(jìn)行常規(guī)蘇木素染色、脫水透明后封片，采用Image-pro plus 6.0計(jì)算平均光密度定量分析TAMs以及VEGF的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

免疫組化結(jié)果顯示，CD68在正常膀胱組織中表達(dá)呈陰性，而在膀胱癌組織中CD68陽性TAMs的數(shù)量明顯增加，膀胱癌組織的平均光密度值顯著高于正常膀胱組織 (P<0.01)(表1，圖1)；膀胱癌組織中VEGF的平均光密度值顯著高于正常膀胱組織 (P<0.01)(表1，圖2)。未發(fā)現(xiàn)年齡、性別差異對膀胱癌組織中的CD68和VEGF的表達(dá)的影響。

表1 兩組膀胱組織中CD68和VEGF表達(dá)平均光密度值

圖1 CD68在不同膀胱組織中的表達(dá)(免疫組化法×400)

圖2 VEGF在不同膀胱組織中的表達(dá)(免疫組化法×400)

3 討 論

近年來我國膀胱癌發(fā)病率呈明顯的上升趨勢，流行病學(xué)研究表明，50%～70%非肌層浸潤性膀胱癌在5年內(nèi)復(fù)發(fā)，而復(fù)發(fā)腫瘤中約30%表現(xiàn)為更高級別和浸潤性[9-10]。膀胱癌的病因不明，常規(guī)病理組織學(xué)在膀胱癌診斷方面受到限制[11]。因此研究導(dǎo)致膀胱癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志物具有重要的意義。最新研究表明，TAMs在實(shí)性腫瘤中起著促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用[12-14]。

TAMs是指位于腫瘤組織中的M2型巨噬細(xì)胞，腫瘤組織間質(zhì)的大部分由TAMs構(gòu)成，通過腫瘤微環(huán)境影響腫瘤生物學(xué)行為和治療效果。研究表明TAMs可分泌大量的促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子以及一系列調(diào)節(jié)血管生成的基質(zhì)金屬蛋白酶類，從而促進(jìn)腫瘤血管生成[15-17]。除了細(xì)胞因子和生長因子，TAMs還可以通過表達(dá)一些其他介質(zhì)誘導(dǎo)血管生成促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移，如環(huán)氧合酶和波形蛋白等[18]。本研究通過免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測了不同膀胱組織中TAMs標(biāo)志物CD68的表達(dá)，結(jié)果表明CD68在正常膀胱組織中表達(dá)呈陰性，而在膀胱癌組織中CD68陽性TAMs的數(shù)量明顯。

VEGF是一種細(xì)胞有絲分裂原，能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)血管生長，是參與血管形成的最重要因子。已有大量研究結(jié)果表明，VEGF在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。國內(nèi)外研究顯示，腫瘤生長及轉(zhuǎn)移依賴于血管形成[19]。本研究通過免疫組化檢測了不同膀胱組織中VEGF蛋白表達(dá)水平，結(jié)果表明膀胱癌組織中VEGF較正常膀胱組織明顯高表達(dá)，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。

本研究初步觀察到CD68及VEGF在膀胱癌組織及正常膀胱組織中的表達(dá)存在差異，提示在膀胱癌組織中TAMs及VEGF明顯活躍，故可以推測在膀胱癌組織中也存在類似其他實(shí)體腫瘤組織中的TAMs對腫瘤細(xì)胞的生長的促進(jìn)作用。同時有理由相信TAMs對VEGF的形成也可能有促進(jìn)作用，它通過直接或間接刺激VEGF的形成，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、活化、遷移，形成新的毛細(xì)血管，為腫瘤生長提供營養(yǎng)支持，進(jìn)而促進(jìn)了膀胱癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。這為下一步深入研究TAMs是如何刺激VEGF的分泌，以及如何阻斷TAMs對VEGF的促進(jìn)作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，從而可能對膀胱癌的預(yù)防及治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響?？傊琓AMs及VEGF在膀胱癌的發(fā)生及發(fā)展中的相互關(guān)系值得進(jìn)一步研究。