頂空-氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜鑒定分析飲用水中的異味成分

蔣萬楓, 張 寧, 張輝珍

(青島市食品藥品檢驗研究院, 山東 青島 266071)

水被稱為人類生命的源泉,是包括人類在內(nèi)所有生命生存的重要資源,也是生物體最重要的組成部分。飲水安全關(guān)系著億萬百姓的健康和生命安全[1]。水在常溫常壓下為無色無味的透明液體,但在生產(chǎn)加工或存儲過程中可能會產(chǎn)生異味,飲用水中出現(xiàn)異味雖然不一定會對消費(fèi)者造成直接的健康危害,但是容易引起消費(fèi)者的恐慌和對水質(zhì)的懷疑[2]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》(GB 19298-2014)、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水》(GB 8537-2018)感官要求中的滋味、氣味項目均為無異味、無異嗅。

頂空-氣相色譜是在已達(dá)到平衡的密閉容器中液體或固體分析物的頂部空間取氣態(tài)(或蒸氣)樣品,并與氣相色譜結(jié)合對氣態(tài)(或蒸氣)樣品進(jìn)行分析的一種比較特殊的分析技術(shù)[3]。飛行時間質(zhì)譜具有高分辨能力、高采集速率、精確質(zhì)量全譜采集等特點[4]。這兩項技術(shù)已廣泛應(yīng)用于風(fēng)味成分分析[5-11]。差異化分析軟件基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)的差異分析,以確定樣品組和變量之間的關(guān)系,已廣泛應(yīng)用于食品鑒定分析中[12-15]。本文利用頂空-氣相色譜的高分離能力、飛行時間質(zhì)譜的高分辨力和差異化分析軟件的高效數(shù)據(jù)分析能力,對消費(fèi)者投訴的具有異味的飲用水進(jìn)行鑒定分析,確定其中的異味成分,分析產(chǎn)生的原因,并對相應(yīng)的生產(chǎn)加工工藝提出合理化建議。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent7890A-7250型氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜、COMBI PAL型全自動三位一體進(jìn)樣器、20 mL頂空瓶、Mass Hunter定性定量分析軟件、Mass Profiler Professional (MPP)差異化分析軟件(美國Agilent公司); AL 204天平(瑞士梅特勒特里多公司); NIST譜庫(美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院);超純水機(jī)(德國賽多利斯公司)。氯化鈉(分析純)、無水硫酸鈉(分析純)、乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)(英國LGC公司)。

1.2 差異化分析實驗方法

1.2.1頂空進(jìn)樣條件

樣品量:10 mL;進(jìn)樣加熱箱溫度:70 ℃;進(jìn)樣針溫度:80 ℃;樣品加熱同時振搖頻率:500 r/min;平衡時間:20 min;進(jìn)樣量:500 μL。

1.2.2色譜條件

色譜柱:DB-1MS柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm,美國Agilent公司)。升溫程序:初始溫度50 ℃,保持1 min,以5 ℃/min的速度升溫至245 ℃,保持5 min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣模式:脈沖分流進(jìn)樣;脈沖壓力:103.4 kPa;分流比:20∶1,持續(xù)0.5 min;載氣:高純氦氣;恒流流速:1.0 mL/min。

1.2.3質(zhì)譜條件

傳輸線溫度:280 ℃;電離模式:EI源;數(shù)據(jù)采集方式:飛行時間質(zhì)譜(TOF MS);質(zhì)量掃描范圍:m/z40～800;溶劑延遲時間:0 min;采集速率:3.00 spectra/s。

1.3 乙醛測定方法

1.3.1頂空進(jìn)樣條件

樣品量:12 mL;進(jìn)樣加熱箱溫度:80 ℃;進(jìn)樣針溫度:90 ℃,樣品加熱同時振搖頻率:500 r/min;平衡時間:20 min;進(jìn)樣量:750 μL。

1.3.2色譜條件

色譜柱:DB-1MS柱(30 m×0. 25 mm×0. 25 μm);升溫程序:初始溫度50 ℃,保持3 min,以20 ℃/min的速度升溫至150 ℃,保持5 min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣模式:脈沖分流進(jìn)樣;脈沖壓力:103.4 kPa;分流比:10∶1;持續(xù)0.5 min;載氣:高純氦氣;恒流流速:0.8 mL/min。

1.3.3質(zhì)譜條件

傳輸線溫度:280 ℃;電離模式:EI源;數(shù)據(jù)采集方式:TOF MS,質(zhì)量掃描范圍:m/z40～400;溶劑延遲時間:2.3 min;采集速率:3.00 spectra/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 差異化分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

分別取5個帶有異味的水樣品和4個無異味的水樣品,按1.2節(jié)方法分別檢測。由于異味物質(zhì)含量低,無法從總離子流圖(見圖1)直接看出其差異性,找到異味物質(zhì),需要進(jìn)行“分子特征提取(MFE)”,通過分子特征提取色譜圖中的各化合物,將這些化合物導(dǎo)入MPP軟件,設(shè)置最小絕對豐度為10 000,所需離子數(shù)為2,保留時間偏差為0.1 min,精確計量數(shù)偏差為20 ppm(10-6,下同),進(jìn)行化合物比對,從這9個樣品中共分析出124種不同化合物,將這些化合物的信息導(dǎo)出為CEF格式文件,導(dǎo)入到Mass Hunter定性分析軟件中,再次檢查色譜圖,用“分子式查找化合物”工具專門搜索這些化合物,然后將得到的化合物返回到MPP軟件中,進(jìn)行第二輪化合物比對和過濾,防止在分子特征提取過程中遺漏化合物。

圖 1 有異味水和無異味水的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatography (TIC) of non-odorous and odorous water

2.2 差異化分析

在MPP軟件中,對導(dǎo)入的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析,從主成分分析圖(見圖2)上可以看出,在無監(jiān)督模式下有異味水和無異味水不能在3D圖上很好地區(qū)分開,說明2種水主成分差異不明顯。

圖 2 有異味水和無異味水的主成分分析圖Fig. 2 Principal component analysis of odorous and non-odorous water

分別采用按標(biāo)志篩選、按頻率篩選、按變異系數(shù)篩選等進(jìn)行處理,通過逐級篩查,化合物數(shù)量降低。在有監(jiān)督模式下,逐級篩選出有異味水和無異味水的差異化合物。通過T檢驗統(tǒng)計分析查找差異明顯的化合物,一般認(rèn)為P<0.05差異顯著。同時計算倍數(shù)變化(fold change),用標(biāo)準(zhǔn)化后的兩組數(shù)據(jù)相除得到倍數(shù),一般2倍表明兩組數(shù)據(jù)有顯著差異?；鹕綀D可反映兩種水中化合物的差異情況,其橫坐標(biāo)代表log2(fold change),縱坐標(biāo)表示-log10(P值),每個點代表一個化合物。從火山圖(見圖3)中明顯看出兩種水之間的2個差異化合物,經(jīng)NIST譜庫檢索和結(jié)構(gòu)解析,其中一個化合物為二氧化碳,另一個化合物為乙醛。二氧化碳為無色無味氣體,所以初步確定異味物質(zhì)為乙醛。

圖 3 (左)有異味水和(右)無異味水的差異火山圖Fig. 3 Differential volcanoes of (left) odorous and (right) non-odorous waterLeft and right bounded by abscissa 0.

從質(zhì)譜圖(見圖4)可以看出,m/z44.025 7、43.017 9、42.009 9、45.029 0分別為乙醛的M+、[M-H]+、[M-2H]+和其中一個碳為13C的同位素離子,另外m/z43.989 3、44.992 7分別為CO2離子及其同位素離子,所有離子質(zhì)量偏差均在5 ppm內(nèi)(見表1和圖4)。乙醛和二氧化碳分子離子的精確質(zhì)量數(shù)相差0.036 4 Da,在飛行時間質(zhì)譜上能輕易分開,提取m/z44.025 7,窗口為10 ppm,可看出乙醛在有異味的水和無異味水中的含量有明顯差別(見圖5)。經(jīng)與乙醛標(biāo)準(zhǔn)品對照,其保留時間和特征離子均一致,經(jīng)食品感官品評員鑒別有異味水的氣味和滋味與乙醛標(biāo)準(zhǔn)品的水溶液相同,確認(rèn)異味成分為乙醛。

圖 4 樣品中異味物質(zhì)的質(zhì)譜圖解析Fig. 4 Mass spectrographic analysis of odorous substances in samples

Molecular formulaIon speciesTheoretical m/zMeasured m/zOffset/ppm (10-6)C2H2O[M-2H]+42.010042.00992.76C2H3O[M-H]+43.017843.0179-1.37C2H4OM+44.025744.02570.00C13CH4OM+45.029045.02900.00CO2M+43.989343.98930.00C13CO2M+44.992644.9927-1.43

圖 5 有異味水和無異味水中乙醛的質(zhì)譜圖Fig. 5 Mass spectrum of odorous and non-odorous water

2.3 乙醛檢測方法優(yōu)化

在上述鑒定異味水中異味物質(zhì)的過程中,所采用的試驗方法并非針對乙醛建立的。因而不是最優(yōu)的方法,為提高方法的檢出限,需要針對乙醛對方法進(jìn)行優(yōu)化。頂空處理實驗中通常在水溶液中加入鹽類物質(zhì),以此降低有機(jī)物在水中的溶解度,提高頂空富集效率,氯化鈉與硫酸鈉是最常使用的鹽類,所以本試驗選取了這兩種鹽進(jìn)行對比。一般情況下,加入的鹽越多,頂空富集效率越高,響應(yīng)值越高。在初始選擇加入鹽的種類時,分別加入飽和氯化鈉和飽和硫酸鈉,即分別在10 mL樣品中加入3.6 g氯化鈉和4.0 g硫酸鈉,考察其影響,結(jié)果表明,加入硫酸鈉的樣品響應(yīng)值較大。除鹽效應(yīng)外,影響頂空響應(yīng)的因素還有加熱時間、加熱溫度、樣品量和加鹽量,為此設(shè)計了一個四因素三水平的正交試驗,從試驗結(jié)果(表2)可以看出,響應(yīng)值隨樣品量和溫度的升高而增加,隨時間的延長先增加后下降,隨加鹽量增加而減少。所以最終確定方法為樣品量為12.5 g,加熱溫度為80 ℃、加熱時間20 min,加入硫酸鈉的量為2 g。

表 2 乙醛檢測方法正交試驗優(yōu)化結(jié)果表

2.4 方法學(xué)驗證

將乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液配成0.010、0.020、0.050、0.100和0.500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列,按優(yōu)化好的乙醛檢測條件進(jìn)行檢測,以乙醛的峰面積(y)為縱坐標(biāo),以對應(yīng)的質(zhì)量濃度(x, mg/L)為橫坐標(biāo),在0.010～0.500 mg/L范圍內(nèi),求得線性回歸方程y=1.05×105x-1.34×104,相關(guān)系數(shù)R2=0.997。按照樣品分析的全部步驟,根據(jù)GB/T 27404-2008附錄F的要求重復(fù)20次測定空白樣品,計算20次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差S,按3倍和10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計算乙醛的檢出限和定量限分別為0.003 3和0.010 mg/L。

2.5 樣品加標(biāo)回收率及精密度

向水樣中分別加入0.020和0.050 mg/L乙醛標(biāo)準(zhǔn)溶液,用1.3節(jié)方法進(jìn)行測定,平行測定6次,低濃度平均回收率為91.3%,高濃度平均回收率為94.8%。日間精密度為1.70%～8.72%,日內(nèi)精密度為0.17%～9.85%。

2.6 實際樣品檢測

對市場上銷售的11種飲用水進(jìn)行了乙醛檢測,其中9種聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)瓶裝水中乙醛的含量為0.017～0.075 mg/L不等,聚碳酸酯(PC)桶裝水未檢出乙醛(見表3)。影響乙醛產(chǎn)生的因素有加熱時間、加熱溫度、粒料濕度等,另外,儲存溫度和光照也會影響乙醛從瓶到水的遷移速度[16,17], PET在高溫下熱氧化降解后易產(chǎn)生乙醛。不同文獻(xiàn)報道的乙醛的閾值(人的嗅覺或味覺能夠感知到的最低濃度)不同,在空氣中的閾值有0.001 3 ppm(10-6)和0.018 ppm[18],清水中的閾值為0.032～0.500 mg/L[19]。經(jīng)過本實驗室的比較,認(rèn)為其在飲用水中的閾值為0.030 mg/L,超過此數(shù)值氣味比較明顯,能夠很容易分辨出來。PET在制胚和吹瓶過程中均有加熱工藝,為分析乙醛是在哪個過程中產(chǎn)生的,分別取5 g粒料、瓶胚和瓶,用液氮冷凍后粉碎,頂空加熱80 ℃,保持20 min,用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜檢測乙醛的響應(yīng)值,峰面積分別為59 906、11 479 432、11 784 644,可以看出乙醛主要來自制胚過程,建議生產(chǎn)廠家優(yōu)化制胚參數(shù),改善生產(chǎn)加工工藝,降低乙醛的產(chǎn)生,保證飲用水質(zhì)量安全。

表 3 飲用水中乙醛的含量

PET: polyethylene terephthalate; PC: polycarbonate.

3 結(jié)論

使用頂空-氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜分別采集有異味和無異味的飲用水,通過差異化分析軟件鑒定分析出了異味化合物,利用結(jié)構(gòu)解析確定為乙醛。建立了三水平四因素的正交試驗,對樣品量、頂空溫度、頂空時間、樣品中加鹽量等試驗條件進(jìn)行了優(yōu)化,確立的方法具有較低的檢出限,較高的精密度和準(zhǔn)確度。通過實際樣品的檢測數(shù)據(jù),分析出了產(chǎn)生異味的原因,并對相應(yīng)的生產(chǎn)加工工藝提出了合理化建議。