多柱色譜技術(shù)進(jìn)展

王曉飛, 孫楷越, 張 博

(廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 福建 廈門(mén) 361005)

色譜技術(shù)自20世紀(jì)初出現(xiàn)以來(lái),在物質(zhì)分離和純化領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)今隨著固定相合成工藝的進(jìn)步和儀器制造技術(shù)的發(fā)展,色譜性能得到了顯著的提升。例如亞2 μm和核殼色譜固定相的出現(xiàn),以及耐壓性能更強(qiáng)、死體積更小色譜儀的研制,都顯著提高了液相色譜的分離性能和效率[1-3]。此外,芯片和微流體技術(shù)在色譜領(lǐng)域的應(yīng)用也使色譜分離系統(tǒng)越來(lái)越小型化[4-7]。在快速發(fā)展的色譜技術(shù)中,同時(shí)利用多根色譜柱進(jìn)行分離分析逐漸得到了關(guān)注[8]。在面對(duì)批量樣品和復(fù)雜生物樣品的分離分析時(shí),傳統(tǒng)的單柱色譜技術(shù)往往無(wú)法滿足分離能力和分析通量的挑戰(zhàn),而串聯(lián)或并聯(lián)的多柱組合色譜技術(shù)則能很好地滿足這樣的需求[8]。例如,在復(fù)雜生物樣本分析中,基于多柱的多維分離已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究[9-11];使用多柱并行分離,一次操作可同時(shí)處理數(shù)個(gè)樣品,可以顯著提高藥物分析和手性固定相篩選的工作通量[12];此外,基于微流控芯片技術(shù),在芯片上刻蝕多個(gè)分離通道,可以實(shí)現(xiàn)高通量的微分離分析[13,14](見(jiàn)圖1)。

多柱技術(shù)的發(fā)展獲益于色譜柱技術(shù)的創(chuàng)新以及分離/檢測(cè)接口的改進(jìn),多柱色譜分析技術(shù)的應(yīng)用可以更好地解決分離科學(xué)所面臨的挑戰(zhàn),例如提高效率、減少消耗和降低環(huán)境污染,這也符合綠色分析化學(xué)的原則[15]。在本文中,我們討論了多柱色譜技術(shù)的研究及應(yīng)用,指出多柱技術(shù)不僅能夠提高分離性能和效率,還可以為生命科學(xué)與生物醫(yī)藥研究提供更深入、更全面的數(shù)據(jù),多柱色譜技術(shù)將是未來(lái)分離科學(xué)發(fā)展的重要方向之一。

圖 1 典型多柱技術(shù)應(yīng)用示例Fig. 1 Typical multi-column chromatography applications

圖 2 典型多維氣相色譜(MDGC)系統(tǒng)配置圖[27]Fig. 2 Typical multidimensional gas chromatography (MDGC) configurations[27] 1D: first-dimension column; 2D: second-dimension column; ΔP: pneumatic control; INJ: injector; DET: universal, specific or mass-selective detector or infrared spectroscopy.

1 多維色譜系統(tǒng)中的多柱技術(shù)

為了獲得更大的峰容量和更高的分離效率,多維色譜系統(tǒng)多數(shù)由一系列不同且相對(duì)獨(dú)立的正交色譜分離系統(tǒng)組成,包括二維氣相色譜(GC×GC)、二維液相色譜(LC×LC)和二維液相色譜氣相色譜混合系統(tǒng)(LC×GC)。多維色譜至少需要兩根色譜柱,是典型的多柱技術(shù)應(yīng)用形式,已被廣泛應(yīng)用于科研與生產(chǎn)中。

1.1 多維氣相色譜系統(tǒng)

圖 3 二維陣列毛細(xì)管液相色譜系統(tǒng)[39]Fig. 3 Two-dimensional capillary arrayliquidchromatography system[39] a. Schematic diagram of column array-based 2D-LC system; b. post-column micro valve at open state; c. post-column micro valve at close state.

基于兩根分離性能正交的氣相色譜柱構(gòu)建GC×GC系統(tǒng)(見(jiàn)圖2),可使分辨率、靈敏度都得到數(shù)倍增加。GC×GC系統(tǒng)可以提供復(fù)雜揮發(fā)性樣品的更豐富的成分信息[16],因此在天然產(chǎn)物、石油化工和煙草等成分復(fù)雜樣品的分析中,GC×GC平臺(tái)得到了廣泛應(yīng)用[17-24]。在每一維分離中,色譜柱長(zhǎng)度、直徑和固定相種類(lèi)的選擇是決定GC×GC分離性能的關(guān)鍵因素[25-27]。除了柱型的選擇,多維分離系統(tǒng)間的接口是影響GC×GC發(fā)展與應(yīng)用的另一個(gè)關(guān)鍵技術(shù),接口技術(shù)與色譜柱中載氣的壓力和速度密切相關(guān),進(jìn)而影響到色譜系統(tǒng)的分離能力。Khan等[16]設(shè)計(jì)了一種全二維氣相色譜系統(tǒng),通過(guò)改善接口,引入了第二維壓力調(diào)諧系統(tǒng),并證明通過(guò)第二維的壓力調(diào)諧,可以調(diào)控極性和非極性化合物在第二維分離系統(tǒng)中的出峰位置。Yan等[28]設(shè)計(jì)了一種全新的并行全二維氣相色譜系統(tǒng)(2GC×2GC),它整合了兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的二維柱系統(tǒng),通過(guò)反向熱調(diào)制(contra-directional thermal modulation)控制兩個(gè)GC×GC分離系統(tǒng),使峰容量比單個(gè)GC×GC系統(tǒng)加倍,并對(duì)啤酒花精油中的復(fù)雜成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明,基于4種正交分離性能的色譜柱,2GC×2GC可提供全面互補(bǔ)的化合物信息。隨著新型接口和分析策略的研制和發(fā)展,基于不同選擇性柱型的多維GC系統(tǒng)將為復(fù)雜揮發(fā)性樣品的分析提供更多物質(zhì)信息。

1.2 多維液相色譜系統(tǒng)

在二維液相色譜系統(tǒng)(LC×LC)的操作過(guò)程中,第一維色譜分離后,各個(gè)組分經(jīng)過(guò)濃縮、捕集或分流后分別進(jìn)入第二維分離系統(tǒng)進(jìn)一步分離;與一維液相色譜系統(tǒng)相比,二維液相色譜系統(tǒng)具有更高的峰容量和分離度[29],近年來(lái)在復(fù)雜體系的分離中得到了廣泛應(yīng)用,如蛋白質(zhì)分離分析[30,31]、代謝組學(xué)分析[32]、中藥成分分析[33,34]和生物樣品中農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)[35]等。二維液相色譜有離線分離和在線分離兩種分析策略,離線二維分離具有更廣的溶劑選擇、成本低和峰容量大等優(yōu)勢(shì)[34],不受流動(dòng)相兼容性的約束[33],在線分離則需要解決不同分離維度間流動(dòng)相與流速的兼容性等挑戰(zhàn)[36]。

但隨著全二維液相色譜概念的提出,以及方法學(xué)[37]、系統(tǒng)控制[35]和微加工技術(shù)[38]的改進(jìn),全多維液相色譜技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)的不足,得到了迅速發(fā)展,并已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。相對(duì)于多維氣相色譜,多維液相色譜系統(tǒng)有更多不同分離機(jī)理的色譜柱可供選擇,如離子交換色譜(IEC)、反相色譜(RPLC)、親和色譜(AC)、尺寸排阻色譜(SEC)和正相色譜(NP)等,通過(guò)構(gòu)建豐富多樣的多維正交分離系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)特定的分離目的。Liu等[39]建立了二維毛細(xì)管陣列LC×LC系統(tǒng),包含一根強(qiáng)陽(yáng)離子交換毛細(xì)管柱(SCX)作為第一維分離系統(tǒng)、10個(gè)微型三通閥和10根反相毛細(xì)管柱(RPLC)陣列作為第二維分離系統(tǒng),結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDI)檢測(cè),從肝癌組織中檢測(cè)到數(shù)千種多肽,并鑒定出1 202種蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖3)。LC×LC系統(tǒng)也廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分離檢測(cè),Zeng等[40]成功構(gòu)建了多通道二維色譜系統(tǒng),并通過(guò)分離純化藍(lán)莓提取物中的生物活性物質(zhì)驗(yàn)證了其分離能力;LC×LC分離也應(yīng)用于聚合物中單/雙官能團(tuán)物質(zhì)檢測(cè),基于這些信息可以更準(zhǔn)確地判斷聚合物的功能特性[41]?；诙嘀呗缘亩嗑S色譜法已越來(lái)越多地受到分析人員的青睞,并廣泛應(yīng)用于諸多研究領(lǐng)域中復(fù)雜樣品的分離分析。隨著接口技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和成熟,多維色譜法將得到更為廣泛的應(yīng)用。

2 芯片色譜中的多柱技術(shù)

基于芯片的微型色譜分離系統(tǒng)可以減少樣品和試劑消耗,并且還大幅減少了分析時(shí)間和成本[42],因此已成為新興的研究方向[43-46]。隨著微流控技術(shù)、微加工技術(shù)的發(fā)展和改進(jìn),基于芯片的多柱技術(shù)也得到了發(fā)展和應(yīng)用。

芯片液相色譜發(fā)展相對(duì)較慢,這主要是因?yàn)殡y以在芯片微通道內(nèi)構(gòu)建穩(wěn)定均一的柱床。而采用通道表面涂覆[47,48]、原位整體柱[49,50]技術(shù)的芯片色譜系統(tǒng),其分離性能和樣品負(fù)載量又遠(yuǎn)小于顆粒填充柱床系統(tǒng)[45]。Nagy等[51]報(bào)道了一種多通道液相色譜芯片的簡(jiǎn)單制造方法,該方法采用無(wú)柱塞技術(shù),在芯片通道內(nèi)填充了常規(guī)色譜固定相顆粒,單個(gè)芯片上可以同時(shí)制備3～12個(gè)平行的色譜分離柱,從而獲得了較高的樣品分析通量。Huang等[52]構(gòu)建了基于納米銀-氧化石墨烯(Ag/GO)納米材料的陣列式多通道玻璃芯片前處理裝置,并結(jié)合HPLC-FLD法同時(shí)對(duì)草魚(yú)中的雙酚A(BPA)和壬基酚(NP)進(jìn)行痕量檢測(cè),BPA和NP分別可以達(dá)到113和92倍的富集。這一基于芯片的陣列色譜柱可以重復(fù)使用至少15次,且該方法的檢出限顯著降低。Shintani等[53]報(bào)道了一種小型化多通道高效液相色譜系統(tǒng),包括單個(gè)高壓梯度泵、基于芯片的樣品進(jìn)樣單元、單片硅膠毛細(xì)管柱陣列和基于光纖的多通道UV檢測(cè)單元。該系統(tǒng)可同時(shí)分離檢測(cè)多個(gè)樣品,并可獲得高重現(xiàn)性的分離效果(RSD<0.9%),在組學(xué)分析和組合化學(xué)中有應(yīng)用潛力。為了解決芯片通道內(nèi)柱床填充均一度的問(wèn)題,Huft等[54]提出了一種低壓顆粒柱床填充技術(shù):在分離通道旁開(kāi)出微米尺寸的旁路通道,實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量柱床快速填充。此技術(shù)為芯片多柱填充提供了新的解決方案。基于此技術(shù),Huft等[55]繼而開(kāi)發(fā)出了并行多柱的芯片HPLC系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)樣品加載、梯度生成、分離、熒光檢測(cè)和樣品回收等步驟。Nagy等[56]通過(guò)COMSOL Multiphysics軟件模擬多柱并行芯片色譜系統(tǒng)中的壓力和速度分布,找到最優(yōu)的通道幾何形狀和壓力條件,并使用12道并行芯片色譜系統(tǒng)驗(yàn)證了模擬結(jié)果。這種方法大大縮短了復(fù)雜幾何形狀多柱芯片色譜系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和制作時(shí)間(見(jiàn)圖4)。與傳統(tǒng)色譜儀器相比,芯片色譜系統(tǒng)需要更高的加工精密度和集成度、更高的信噪比、更快的響應(yīng)和更小的檢測(cè)尺寸,因而對(duì)微加工技術(shù)提出了更高要求。同時(shí),隨著微納分析技術(shù)的發(fā)展,多柱芯片色譜系統(tǒng)除滿足常規(guī)化學(xué)分離外,在不久的將來(lái)還有望實(shí)現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)、樣品前處理、篩選和后處理等多級(jí)單元操作的集成。

圖 4 基于芯片的多柱色譜分離系統(tǒng)[56]Fig. 4 Multi-column chromatographic separations on microchip[56] (a) Photographic and (b) schematic representation of the microchip with 12 parallel C18 packings (0.1 mm×0.03 mm×10 mm, as width×height×length).

3 多柱毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳(CE)又稱(chēng)高效毛細(xì)管電泳(HPCE),以毛細(xì)管作為分離通道,由高壓直流電場(chǎng)驅(qū)動(dòng),廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離,如蛋白質(zhì)分析和DNA測(cè)序。在高通量測(cè)序方法出現(xiàn)之前,DNA測(cè)序是一個(gè)繁瑣的過(guò)程[57]。20世紀(jì)90年代早期研制出毛細(xì)管陣列電泳和配套的檢測(cè)系統(tǒng)[58-62],第一代商品化96道毛細(xì)管電泳測(cè)序儀在1998年出現(xiàn),如GE Healthcare MegaBACE 1000和ABI Prism 3700 DNA分析儀[57]。多柱陣列CE提高了DNA測(cè)序的效率,降低了測(cè)序成本,并實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化,可以輕松實(shí)現(xiàn)DNA的高通量測(cè)序(見(jiàn)圖5)。

多柱CE技術(shù)也被用于目標(biāo)分析物的富集以提高檢測(cè)靈敏度。Britz-Mckibbin等[63]描述了基于96通道毛細(xì)管陣列電泳和紫外檢測(cè)的嘌呤代謝物富集和檢測(cè)系統(tǒng),該系統(tǒng)具有高靈敏度和高通量的特性。在Cheng等[64]的研究中,以2～20根并行毛細(xì)管電泳陣列對(duì)樣品中汞離子(Hg2+)和甲基汞(MeHg)進(jìn)行富集和分離,顯著降低了目標(biāo)物的檢出限;他們指出,通過(guò)使用并行毛細(xì)管電泳陣列可以提高靈敏度,且靈敏度的提高與分離柱數(shù)成正比,同時(shí)分離效率和分辨率不受平行多柱的影響。

多柱毛細(xì)管電泳系統(tǒng)具有一系列優(yōu)勢(shì)。其由高壓直流電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)，且無(wú)需使用固定相顆粒填充柱床,更容易實(shí)現(xiàn)多柱聯(lián)用而無(wú)需考慮柱型和輸液系統(tǒng)?；谝陨弦蛩?多柱CE系統(tǒng)已逐漸成熟并商業(yè)化,并已為生命科學(xué)研究做出了顯著的貢獻(xiàn)。

圖 5 雙色共焦熒光毛細(xì)管陣列掃描儀的示意圖[59]Fig. 5 Schematic of the two-color, confocal-fluorescence capillary array scanner[59]

4 高通量手性固定相的篩選

手性色譜是目前使用最廣泛的拆分對(duì)映體的方法[65],目前約有1 300種手性色譜固定相(CSP),其中約170種已經(jīng)商品化[66],并不斷有新型CSP被開(kāi)發(fā)應(yīng)用。為了滿足新型手性化合物分離分析的需求,開(kāi)發(fā)快速的CSP篩選方法非常重要。通過(guò)使用短柱和提高柱效縮短單次分離時(shí)間[67,68]、單次運(yùn)行多次進(jìn)樣[69,70]、快速超臨界流體梯度[71,72]和平行多柱篩選[73]均能有效提高分析通量。

圖 6 帶有圓二色光譜檢測(cè)器的5柱并行篩選HPLC系統(tǒng)[77]Fig. 6 Customized HPLC system for five-column parallel screening with circular dichroism (CD) signal pooling[77]

通過(guò)色譜柱的序列自動(dòng)切換進(jìn)行篩選是一種廣泛使用的策略[74,75],但這種方法一次只能測(cè)試一種流動(dòng)相條件。為了提高篩選效率,多柱切換和平行柱篩選方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用并可以提供更準(zhǔn)確、更快速的結(jié)果[76]。如AB Sciex公司的Eksigent Express LC系統(tǒng)、Sepiatec公司的Sepmatix系統(tǒng)都能夠提供8柱并行的篩選容量。這些并行多柱篩選系統(tǒng)可以顯著縮短方法開(kāi)發(fā)的時(shí)間,并減少溶劑消耗量。Zhang等[77]開(kāi)發(fā)了一種快速手性柱篩選的新策略,它基于多柱平行分離篩選和圓二色(CD)檢測(cè)器,集成了一個(gè)HPLC自動(dòng)進(jìn)樣器、一個(gè)輸液泵、5個(gè)并行手性柱和5個(gè)紫外檢測(cè)器,可以同時(shí)對(duì)5種手性柱進(jìn)行篩選,包括Chiralpak AD、Chiralpak AS、Chiralcel OJ、Chiralcel OD、Whelk-O1手性色譜柱。與廣泛使用的順序柱切換方法相比,該系統(tǒng)的篩選速度提高了5倍(見(jiàn)圖6)。同樣,Wang等[78]提出了一種針對(duì)3種不同手性色譜柱的篩選方法,這些色譜柱分別填充了具有互補(bǔ)選擇性的大環(huán)糖肽手性固定相;作者研究了偶聯(lián)柱的保留性和選擇性,并與單個(gè)或多種混合手性固定相進(jìn)行了比較。

需要指出,基于多柱并行篩選策略只需幾個(gè)小時(shí)即可完成固定相篩選,而傳統(tǒng)的順序篩選方法往往需要數(shù)天才能選出理想的固定相。多柱并行HPLC方法的自動(dòng)篩選策略將顯著提高生物醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)τ丑w拆分的效率。

5 高通量分離純化技術(shù)

面對(duì)樣本數(shù)量巨大的分析任務(wù)時(shí),發(fā)展高通量技術(shù)成為必然[79,80]。通過(guò)加大流動(dòng)相流速、使用粒徑更小的填料和長(zhǎng)度更短的色譜柱可以實(shí)現(xiàn)快速分離,但這都是以增加背壓和降低進(jìn)樣量為代價(jià)的;另一種提高分離通量的方法是使用多柱技術(shù)[81,82]。面向制藥工業(yè)對(duì)高通量分析的需求[83],市面上已有Eksigent Express 8008通道和NanostreamVeloce 24通道液相色譜系統(tǒng),能夠在使用多根不同固定相的色譜柱時(shí),執(zhí)行快速的梯度分離[84,85]。

Gross等[86]報(bào)道了基于雙柱的平行HPLC系統(tǒng),單次進(jìn)樣后將樣品送入兩根色譜柱,使用不同的洗脫條件和單個(gè)多波長(zhǎng)檢測(cè)器檢測(cè),通過(guò)分析芳香族化合物對(duì)該平行柱系統(tǒng)進(jìn)行了測(cè)試;結(jié)果表明,與傳統(tǒng)的單柱方法相比,該系統(tǒng)可獲得更高的分離選擇性和定量精度,使用傳統(tǒng)單柱方法分析8種目標(biāo)物(苯甲醚、苯、苯甲酰胺、氯苯、乙苯、間甲酚、鄰甲酚和甲苯)時(shí),在ZirChrom PBD和CARB兩種固定相色譜柱中均存在顯著出峰重疊,但當(dāng)以雙柱平行方式使用相同兩種固定相色譜柱進(jìn)行分析定量時(shí),能夠?qū)崿F(xiàn)較高的定量精度(通常RSD=2%)。在另一項(xiàng)研究[87]中,通過(guò)在等度洗脫條件下分離15種磺胺類(lèi)藥物,考察串聯(lián)和平行多柱技術(shù)的性能,并指出多柱串聯(lián)技術(shù)優(yōu)于平行多柱技術(shù)。

在純化工藝中,多柱技術(shù)也有廣泛的應(yīng)用,這些多柱技術(shù)可以分為連續(xù)、半連續(xù)過(guò)程[88-90]。多柱純化系統(tǒng)操作中通常有許多變量,因此方法優(yōu)化變得相當(dāng)復(fù)雜。因此,進(jìn)化算法(evolutionary algorithm)等先進(jìn)的優(yōu)化技術(shù)也被應(yīng)用于多柱色譜純化過(guò)程開(kāi)發(fā)中[91]。Heinonen等[92]設(shè)計(jì)了一種內(nèi)部循環(huán)的4柱平行純化工藝,并以木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物的分離純化驗(yàn)證了模型,不僅實(shí)現(xiàn)電解質(zhì)和非電解質(zhì)的同步分離,還獲得了優(yōu)良的分離性能:硫酸的回收率和純度分別達(dá)到98%和94%,單糖為85%和95%,乙酸為88%和93%;該純化方法不僅單糖產(chǎn)率高,洗脫液消耗量是單柱平行分批純化法的1/20。

光學(xué)檢測(cè)器由于具有多通道檢測(cè)容量,已在大多數(shù)多柱色譜中廣泛采用;而質(zhì)譜檢測(cè)器由于其在定性和定量方面的雙重優(yōu)勢(shì),也被嘗試應(yīng)用于多柱色譜系統(tǒng)中。在復(fù)雜生物樣本的分析中,通過(guò)使用兩個(gè)集成的LC單元(每個(gè)單元帶有自動(dòng)進(jìn)樣器和輸液泵組件),可以充分利用色譜柱的平衡時(shí)間來(lái)提高質(zhì)譜儀的檢測(cè)通量和使用效率[93]。該分析策略也被用于基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,可以消除色譜柱的再生/平衡時(shí)間延遲,使分析通量提高一倍[94]?；诖朔治霾呗?Livesay等[95]進(jìn)一步引入了4個(gè)平行色譜柱,這種自動(dòng)化四柱系統(tǒng)在所考察的液相色譜條件下的使用覆蓋率接近100%,顯著提高了質(zhì)譜檢測(cè)器的利用率。

另一種提高質(zhì)譜檢測(cè)通量的方法是使用多個(gè)噴霧針的離子化系統(tǒng),該方法可以同時(shí)獲得每支并行色譜柱的數(shù)據(jù),從而實(shí)現(xiàn)在單次色譜運(yùn)行時(shí)間內(nèi)同時(shí)分析多個(gè)樣品[96](見(jiàn)圖7)。基于此分析策略,Yang等[97]在HPLC系統(tǒng)中并聯(lián)4個(gè)分析柱,同時(shí)在三重四極桿質(zhì)譜儀上連接四通道的多路電噴霧接口(MUX),同時(shí)在4種不同的生物基質(zhì)中檢測(cè)并測(cè)定氯雷他定及其代謝物,結(jié)果符合美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)的精度和準(zhǔn)確度。后續(xù)的工作中,該小組[98]還進(jìn)一步構(gòu)建了并聯(lián)8柱液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)-質(zhì)譜(LC-ELSD-MS)系統(tǒng),由LCT飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和八通道多路電噴霧接口組成,可用于天然產(chǎn)物庫(kù)的建立與表征,為制藥工業(yè)和天然產(chǎn)物研究提供了高通量篩選的有力工具。并行多柱策略可以顯著提高分離分析和制備純化的通量,多柱技術(shù)的發(fā)展和多通道質(zhì)譜檢測(cè)接口的創(chuàng)新都將大大擴(kuò)展多柱色譜的應(yīng)用領(lǐng)域。

圖 7 四通道LC-MS接口整體系統(tǒng)布局[96]Fig. 7 Overall system layout for the four-way multiplexed LC-MS interface[96]

6 串聯(lián)多柱色譜技術(shù)

通過(guò)多柱的串聯(lián)耦合來(lái)調(diào)節(jié)固定相種類(lèi)與組成是提高色譜分離度的相對(duì)簡(jiǎn)單的解決方案。該方法使用兼容的洗脫條件和常規(guī)儀器,可以在不同類(lèi)型的色譜柱上實(shí)施[99]。串聯(lián)耦合柱(SCC)液相色譜系統(tǒng)僅需配備單個(gè)泵系統(tǒng)和單個(gè)檢測(cè)器,且在柱與柱之間不需要任何裝置來(lái)存儲(chǔ)洗脫液,因而儀器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)。同時(shí),在等度洗脫模式下,不同選擇性的色譜柱可以產(chǎn)生一定的梯度效應(yīng),能夠顯著縮短分析時(shí)間,這一優(yōu)勢(shì)在復(fù)雜混合物的分離分析中也得到了證實(shí)[100-111]。

降低色譜柱直徑是提高分析靈敏度的常用方法,但內(nèi)徑減小會(huì)限制上樣量,進(jìn)而會(huì)限制靈敏度的增加,串聯(lián)耦合內(nèi)徑逐漸減小的色譜柱則可彌補(bǔ)這個(gè)不足。de Vries等[112]設(shè)計(jì)了一個(gè)四柱串聯(lián)且內(nèi)徑逐漸減小(2.1、1.0、0.5、0.15 mm逐級(jí)遞減)的柱系統(tǒng);注射80 μL血漿,同時(shí)分析咪達(dá)唑侖和1′-羥基咪達(dá)唑侖,以此對(duì)該裝置進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明其具有穩(wěn)健的分離性能;與經(jīng)典的捕集-洗脫法相比,靈敏度提高了10～50倍;與直接micro-UHPLC方法相比,靈敏度提高了250～500倍。

7 結(jié)論與展望

作為一種新穎的分離分析策略,多柱色譜技術(shù)可以解決復(fù)雜基質(zhì)分析、大批量樣品分析和手性固定相篩選等分析難題。與傳統(tǒng)的單通道色譜不同,多柱色譜系統(tǒng)通常需要一個(gè)穩(wěn)定的多通道流動(dòng)相輸送系統(tǒng),以控制每個(gè)色譜柱中流動(dòng)相的參數(shù),如速率、成分和溫度。然而目前常見(jiàn)的兩種方案,即分流策略和多泵驅(qū)動(dòng)策略,往往占用較大空間,且不能滿足穩(wěn)定性的需求。實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的多通道流動(dòng)相輸送是多柱色譜技術(shù)發(fā)展的主要挑戰(zhàn)。

另一方面,多柱色譜中使用的色譜柱應(yīng)具有良好的重現(xiàn)性,如穩(wěn)定的背壓和分離度?；诋?dāng)前的色譜柱制造工藝,即便使用相同生產(chǎn)批次的色譜柱,也會(huì)存在柱間差異,而從大量色譜柱中挑選性能一致的色譜柱并非易事。因此,開(kāi)發(fā)快速、成本低和性能穩(wěn)定一致的制柱技術(shù)是重要且緊迫的任務(wù)。

盡管多通道光學(xué)探測(cè)器已經(jīng)成熟,但它們的同步定性和定量能力弱于質(zhì)譜檢測(cè)器。目前,多通道質(zhì)譜檢測(cè)方法仍處于起步階段。因此,發(fā)展新型多通道質(zhì)譜檢測(cè)器和檢測(cè)策略,將顯著支撐和推進(jìn)多柱色譜技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。