超微粉碎對紅花籽粕蛋白質(zhì)形態(tài)和理化功能性的影響

張愛琴，孫乾，李芳，羅豐收，孔令明*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052) 2(新疆輕工職業(yè)技術學院，新疆 烏魯木齊，830021)

紅花(CarthamustinctoriusL.)，別名紅藍花、刺紅花。紅花籽中亞油酸的含量相對較高，具有活血化瘀、止痛的功效。紅花籽粕即為紅花籽經(jīng)一系列榨油方式之后的棄物，油料在生產(chǎn)加工中會產(chǎn)生剩余的餅粕，而這些籽粕中富含25%～35%的蛋白質(zhì)，脫脂后的籽粕蛋白含量更是高達45%，且紅花籽蛋白的溶解、乳化和起泡性均良好，為營養(yǎng)均衡的優(yōu)質(zhì)蛋白。在這些優(yōu)質(zhì)蛋白中，18種氨基酸都較為齊全，占到人體必需氨基酸的30%以上[1]。目前，大量的植物餅粕被用作動物飼料，或者被直接填埋拋棄，對榨油后餅粕中含有豐富的蛋白質(zhì)利用率很低，這不僅造成了資源浪費，也給環(huán)境造成了極大的危害。

粉碎技術是食品生產(chǎn)加工過程中不可或缺的一部分，也是21世紀一種新型的加工技術，運用物理手段對食品進行一定超微粉碎處理，可以把3 mm以上的物質(zhì)粉碎至10～25 μm，并且具有快速、低溫、粒度小、分布均、省原料、利用率高等優(yōu)點，可以增大物質(zhì)的表面積，使物質(zhì)具有較好的分散性、溶解性，并對營養(yǎng)成分破壞較小。超微粉碎技術在食品加工中已被廣泛應用，不僅可提高食品的口感，更可促進物質(zhì)的利用率。

通過對紅花籽的超微粉碎，可以得到在形態(tài)上受到了一定改變的紅花籽粕蛋白，相比普通方式處理的紅花籽粕具有更好的流動性，且在蛋白的功能特性上有良好的改善。對紅花籽粕蛋白的深入性研究，不僅可以加強對植物蛋白的綜合性利用，也為植物性蛋白的基礎性研究提供了相關的實踐依據(jù)[2]，更為油料餅粕有效利用提供技術支撐。

1 試驗材料和設備

1.1 材料與試劑

紅花籽粕，新疆莊子公司提供；花生油，超市購買。

牛血清白蛋白(南京比迪生物)，甘氨酸(河北順博化工產(chǎn)品有限公司)，低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)MarkerⅠ、α-巰基乙醇、Tris堿、雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、四甲基乙二胺、AM(電泳級)，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JY600電泳儀，上海圣科儀器設備有限公司；MV-IIA雙垂直板電泳槽，鄭州卓鑫儀器有限公司；BSD-WX1350脫色搖床，新疆伊犁州數(shù)顯脫色搖床生產(chǎn)廠；EM-30 Plus型掃描電鏡，韓國COXEM公司；DV-3T粉體流變儀，山東實驗室儀器有限公司；400Y超微粉碎機，鉑歐五金廠；，F(xiàn)W80高速萬能粉碎機，北京諾誠嘉信儀器有限公司；SZG-01真空冷凍干燥機，無錫市精誠粉體有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定

變性梯度凝膠電脈(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel delctrophoresis, SDS-PAGE)是目前較為通用的測定蛋白質(zhì)的方法之一，原理是利用蛋白質(zhì)分子中亞基分子量的區(qū)別性，對其進行一定的離子型外力作用，導致亞基移動被改變，從而得到定向分離。因其具有較高的分辨率和較好的重復性被廣泛地運用[3]。

1.3.2 蛋白質(zhì)微觀形態(tài)的觀測

(1)稱取紅花籽粕1 g，干燥、粉碎、過篩[4]。

(2)將篩后的紅花籽粕以料液比1∶10(g∶mL)形成溶液，并用0.1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至8.0。在溫度50 ℃，時間60 min下，對紅花籽粕蛋白進行堿提。上離心機4 800 r/min，15 min，測定上清液體積，并轉(zhuǎn)移到1 000 mL定容瓶中定容[5]。

(3)用蒸餾水將其洗至中性并去除多余水分，濃縮后進行真空冷凍干燥。將冷凍干燥機處理過的紅花籽粕蛋白樣品經(jīng)超微粉碎和普通粉碎2種方式加以處理，運用掃描電子顯微鏡(SEM)進行微觀結構觀測和分析[6]。

1.3.3 蛋白粉物理性測定

用蒸餾水將其洗至中性，將冷凍干燥機處理過的紅花籽粕蛋白樣品經(jīng)超微粉碎和普通粉碎2種方式加以處理。

(1)將預處理后的樣品放入石英杯中密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)取待測樣品放入粉體流變儀中。流變儀的測定一般分為初攪拌和正式攪拌2個步驟：初攪拌使紅花籽粕蛋白的粉體樣品在石英杯中的分布較為勻稱；第二階段的正式攪拌時，攪拌器分別以15、30、45和60 mm/s的速度進行2次加壓攪拌。

(3)測定紅花籽粕的結塊性、黏著性和流動性[7]。

1.3.4 蛋白粉功能性測定

1.3.4.1 乳化及乳化穩(wěn)定性的測定

(2)稱取40 mL蛋白溶液樣品，加40 mL花生油；使用均質(zhì)機做均質(zhì)處理。

(3)將蛋白溶液于4 000 r/min離心15 min，測定其乳狀液的乳化層高度(h1)和總液體高度(h)。乳化性計算公式為[8-9]：

(1)

(4)使用水浴鍋在85 ℃水浴下，對離心后的混合液做30 min的保溫處理，冷卻至室溫后，測定其乳狀液的乳化層高度(h1)并記錄30 min后的乳化層高度(h2),乳化穩(wěn)定性計算公式為[10]：

(2)

1.3.4.2 起泡及起泡穩(wěn)定性的測定

轉(zhuǎn)染48 h后，MTT檢測各組SHG-44細胞增殖水平，結果顯示，miR-543 mimic組與mimic NC組相比細胞增殖水平明顯降低(P＜0.01)，miR-543 inhibitor組與inhibitor NC組相比細胞增殖水平明顯升高(P＜0.01)，見圖2;由此可見miR-543過表達可抑制SHG-44細胞增殖，抑制miR-543的表達可促進SHG-44細胞增殖。

(1)取1 g紅花籽粕蛋白,加100 mL蒸餾水進行溶解，調(diào)pH至7.0，并在100～600 W超聲功率下處理15 min。

(2)將樣品均質(zhì)3 min，快速記錄均質(zhì)停止時泡沫的體積(V1)和液體總體積(V0)，起泡性計算公式為[11]：

(3)

(3)測定起泡性后，放置于室溫下充分靜置30 min，再次測定泡沫體積(V2)[11]。泡沫穩(wěn)定性計算公式為[12-13]：

(4)

1.3.4.3 紅花籽粕蛋白質(zhì)溶解度的測定

(1)取1 g紅花籽粕蛋白，加100 mL蒸餾水進行溶解，調(diào)pH值至7.0，并在100～600 W超聲功率下處理15 min；

(2)離心機4 000 r/min離心15 min，取上清液；

(3)用考馬斯亮藍的方法檢測所取的上清液中蛋白質(zhì)的含量，按公式(5)計算溶解度[14-15]：

(5)

式中：ρ,蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度,g/mL；V,溶液體積,mL；m,樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量,g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測量數(shù)據(jù)采用PG Flash軟件可將自定義的測量程序下載到儀器上實現(xiàn)自動化操作，且儀器自帶RheocalcT軟件，并結合Excel 2003對數(shù)據(jù)進行采集和分析。數(shù)據(jù)進行3次重復試驗，取平均值。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE的測定和分析

紅花籽粕蛋白是由20%～25%的清蛋白、50%球蛋白的活性蛋白與1%～4%的醇溶蛋白、20%～25%谷蛋白的貯藏蛋白構成，成分相對比較復雜[16-17]。

1-普通粉碎；2-超微粉碎

圖1 紅花籽粕蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖

Fig.1 SDS-PAGE gel electrophoresis of safflower seed meal protein

由圖1可以看出，大部分的紅花籽粕蛋白質(zhì)量分布于20～45 kDa之間，這種分布在一定程度上可以說明其所含的蛋白較為集中；且分子質(zhì)量均在66.2 kDa以下，主要以小分子構成，這種相對比較集中的成分便于在蛋白的功能特性、改性上加以綜合利用。

2.2 不同粉碎處理對蛋白微觀形態(tài)變化的影響

由圖2可以看出，經(jīng)掃描電鏡(SEM)掃描后，普通粉碎處理的蛋白結構相比超微粉碎處理的蛋白結構具有更大的比表面積和較大的團聚塊狀結構；而經(jīng)超微粉碎處理的蛋白則顯得更加細小化、分散化，顆粒呈現(xiàn)出無序的不規(guī)則形，顆粒大小較為勻稱，顆粒之間的空隙明顯加大。這也說明，經(jīng)超微粉碎處理后的蛋白具有更加良好的分散性[18]。

a-普通粉碎;b-超微粉碎

圖2 不同粉碎處理后紅花籽粕蛋白的微觀形態(tài)

Fig.2 Microstructure of safflower seed meal protein after different smashing treatments

2.3 不同粉碎處理對蛋白結塊性、黏著性以及流動性的影響

2.3.1 不同粉碎處理對蛋白結塊性的影響

在食品加工過程中，超微粉碎技術使得蛋白粉末的結塊現(xiàn)象較為嚴重，甚至會影響食品的品質(zhì)，但可使食品咀嚼感及營養(yǎng)吸收率提高[19]。這種現(xiàn)象，也有可能是因為在試驗操作中，超微粉碎要比一般粉碎更容易吸收空氣中的水分所導致。

由圖3可以得知，通過普通粉碎與超微粉碎的相對比，經(jīng)超微粉碎出現(xiàn)的結塊強度是普通粉碎結塊強度的2.5倍，而超微粉碎技術的結塊平均強度高達178.673，是普通粉碎的近2倍。超微粉碎可以增大蛋白質(zhì)的接觸面積，從而使得蛋白質(zhì)分子間的作用力變大，而這種作用力的增大，可以間接影響蛋白粉的休止角、堆積密度等特性，在一定程度上改變蛋白質(zhì)粉在實際生產(chǎn)中的性狀[20-21]。

a-普通粉碎;b-超微粉碎

圖3 紅花籽蛋白質(zhì)在不同粉碎處理下的結塊性示意圖

Fig.3 The caking of safflower protein under different comminution

2.3.2 不同粉碎處理對蛋白粘著性的影響

由圖4可以得知，經(jīng)超微粉碎后的蛋白，分子間的內(nèi)聚力為16.962，可以看出其具有較大的黏性。而經(jīng)普通粉碎的蛋白，其分子間的內(nèi)聚力僅為11.643，黏性小。一方面是因為紅花籽粕蛋白質(zhì)粉末在超微粉碎的處理下可以增大蛋白質(zhì)的可塑性和黏性，蛋白質(zhì)在超微粉碎處理下，接觸面增大導致蛋白質(zhì)顆粒間的摩擦力增大，分子間作用力增強[22]。

2.3.3 不同粉碎處理對蛋白流動性的影響

粉體的流動系數(shù)比值越接近系數(shù)1，則說明粉體在動態(tài)流動性上更趨于一種穩(wěn)態(tài)，這使得粉體的產(chǎn)品質(zhì)構更加穩(wěn)定，更加不宜被壓縮，也更不易被分層，流變性能更好[23]。經(jīng)儀器測定和數(shù)據(jù)分析可以得出(見圖5)，經(jīng)超微粉碎后的蛋白粉末流動性是普通粉碎的1.06倍，相比超微粉碎，普通粉碎接近于1.00的流動性顯得更具有一定優(yōu)勢性。

a-普通粉碎;b-超微粉碎

圖4 紅花籽粕蛋白質(zhì)在不同粉碎處理下的粘著性示意圖

Fig.4 Illustration of adhesion of safflower seed meal to different comminution treatments

a-普通粉碎;b-超微粉碎

圖5 紅花籽粕蛋白質(zhì)在不同粉碎處理下的流動性示意圖

Fig.5 Schematic diagram of fluidity of safflower seed meal under different comminution treatment

這可能是因為超微粉碎過于細微，改變了分子間的靜電荷，使得靜電荷中相互排斥性增大，導致分子間作用力加大，因此使得其流動性減小。

2.4 不同粉碎處理對蛋白功能特性的影響

根據(jù)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的分類，分別考察了蛋白的溶解性、乳化性以及起泡性在不同破碎處理條件下的變化，結果如圖6所示。紅花籽粕蛋白粉在超微粉碎處理后和普通粉碎處理后的相比較中，在功能特性上(溶解度、乳化性和起泡性)都得到了較好的改善。經(jīng)超微粉碎處理的紅花籽粕比普通粉碎處理的紅花籽在溶解性、乳化性和起泡性上分別提高了56.83%、41.60%和36.53%。各項功能性指標的提升可能是因為超微粉碎的強物理性導致了大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟男》肿游镔|(zhì)，而蛋白質(zhì)的高級結構也相對發(fā)生了一定的變化。超微粉碎技術可讓蛋白質(zhì)的空間結構發(fā)生變化，從而使得變性折疊的蛋白質(zhì)再次延展，因為蛋白質(zhì)的顆粒變得越來越細小而接觸面增大了，使得蛋白質(zhì)功能特性得以恢復。

圖6 不同破碎處理對紅花籽粕的功能特性的影響

Fig.6 The functional properties of safflower seed meal are affected by different crushing treatments

因此，超微粉碎技術對于紅花籽粕蛋白功能特性的改善具有較好的作用，尤其是在提高蛋白的溶解性上。這一點使得該技術在食品工業(yè)上的適用范圍更加廣泛，對于在其他領域的應用，也提供了更多的可行性。

3 結論

(1)紅花籽粕蛋白的成分較為復雜，分子質(zhì)量一般分布在10.5～66 kDa，但是營養(yǎng)成分分布較為均衡。超微粉碎后，蛋白質(zhì)顆粒的表面積增大，易溶于水，且經(jīng)過電鏡掃描顯示，蛋白質(zhì)顆粒破碎的大小已達到納米級，這使得營養(yǎng)物質(zhì)更加有利于吸收。

(2)在經(jīng)過超微粉碎處理后，紅花籽粕蛋白的顆粒大小勻稱，蛋白的孔隙率和表面能增大，緊密的組織結構被破壞。通過質(zhì)構流變儀的測定可知，超微粉碎與普通破碎相比，紅花籽粕蛋白質(zhì)的顆粒流動性不會發(fā)生較大變化。

(3)超微粉碎與普通粉碎相比，紅花籽粕蛋白的流變性和功能性都有了一定的變化，分子內(nèi)部以及分子間的結合力逐漸消失，超微粉碎的結塊強度是普通粉碎結塊強度的2.5倍，而超微粉碎技術的結塊平均強度高達178.673，是普通粉碎的近2倍。這種強烈的物理因素導致了一定的物理改性效果。

(4)通過對紅花籽粕超微粉碎和普通粉碎2種方式的對比，并測定和分析其物理性和功能性，可以得出在超微粉碎處理下，紅花籽粕蛋白粉末的物理性和功能特性都有了明顯的改善。經(jīng)超微粉碎處理的紅花籽粕比普通粉碎處理的紅花籽在溶解性、乳化性和起泡性上分別提高了56.83%、41.60%和36.53%。超微粉碎不僅一定程度上增大了物料的表面積，還使得其具有良好的分散性、溶解性等，這相對可以提高食品的口感，更加適于人體的消化和吸收，提高了產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化利用率。