外泌體的研究進(jìn)展

宋賽賽，賀嬌，程琳

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008；2.陜西省精神衛(wèi)生中心，陜西 西安 710061）

0 引言

外泌體是由機(jī)體大多數(shù)細(xì)胞分泌的。1983 年，Johnstone[1]等首次在網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)外泌體的。研究人員在觀察轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的活動(dòng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟期間，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體被打包，并且被網(wǎng)織紅細(xì)胞分泌到胞外小泡中。便認(rèn)為它是網(wǎng)織紅細(xì)胞中的物質(zhì)被溶酶體破壞后分泌到胞外的垃圾。盡管外泌體發(fā)現(xiàn)的較早，但是由于人們對(duì)外泌體的認(rèn)識(shí)還不足，所以在過(guò)去的幾十年里，它不受研究人員的關(guān)注。據(jù)最早報(bào)道，部分研究人員認(rèn)為外泌體主要由免疫細(xì)胞（樹突狀細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞巨噬細(xì)胞）與腫瘤細(xì)胞分泌的。但是人們對(duì)外泌體的了解也更深入，更全面，認(rèn)識(shí)到外泌體是包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞分泌的囊泡小體，血液，尿液等體液均能檢測(cè)到外泌體[2]。并發(fā)現(xiàn)其具有一定的生物學(xué)活性，它能夠在血管之間自由移動(dòng)，參加細(xì)胞與細(xì)胞之間溝通，參與凝血，血管生成等活動(dòng)。因此，近幾年，研究人員掀起了研究外泌體的熱潮。

1 外泌體的組成

由胞內(nèi)分泌到胞外的小囊泡，稱為胞外囊泡。囊泡有三大類，根據(jù)直徑的大小及形態(tài)學(xué)差異，囊泡分三種，直徑由小到大順序依次為：外泌體（40-100 nm)，微泡(100-1000 nm)，凋亡小體(1000-5000 nm)[2]。外泌體直徑與病毒直徑范圍接近，約40-100 nm，密度在1.10-1.18g/mL，使用蔗糖密度梯度離心法提取外泌體時(shí)，外泌體可以在密度為1.13-1.19 g/mL 的蔗糖中沉降。電鏡下，外泌體主要為杯形，杯形形狀可能是由于樣品制備中外泌體脫水裂解而形成的。但是在體液中，球形結(jié)構(gòu)為其在體液中的主要形態(tài)。外泌體具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，其主要由蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，核酸組成，但是外泌體內(nèi)部缺乏高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等活細(xì)胞內(nèi)部存在的細(xì)胞器[3]。

1.1 外泌體所含蛋白質(zhì)

外泌體來(lái)源很廣，種類繁多，外泌體的母代細(xì)胞可以決定外泌體蛋白的成分及含量。

外泌體中蛋白質(zhì)分子，一部分為常見蛋白，出現(xiàn)在所有外泌體中。如細(xì)胞骨架蛋白（微管蛋白，肌動(dòng)蛋白），四跨膜蛋白（CD9，CD63），脂質(zhì)相關(guān)蛋白，熱休克蛋白家族（HSP90）等。另一部分蛋白和細(xì)胞來(lái)源相關(guān)，如與內(nèi)膜系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白ALIX，Tsg101 及ESCRT 家族蛋白等，但外泌體不含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白如鈣聯(lián)蛋白Calnexin。因此我們可以使用CD63,CD9 以及鈣聯(lián)蛋白衡量外泌體提取方法是否可行，以及判斷使用此方法提取的外泌體純度是否可靠，如提取外泌體后進(jìn)行蛋白免疫印跡法，若在CD63 或者CD9 等外泌體通用蛋白的相應(yīng)位置上出現(xiàn)條帶，則證實(shí)提取到外泌體，若存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白如鈣聯(lián)蛋白，則在其分子量相應(yīng)的位置上出現(xiàn)條帶，則證實(shí)提取的外泌體不純，若無(wú)條帶，則證實(shí)此種提取方法獲取的外泌體純度高。

此外外泌體細(xì)胞來(lái)源的蛋白具有相對(duì)特異性：如B 淋巴細(xì)胞分泌的外泌體表面有MHC-II 類分子；腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜帶大量腫瘤抗原[4]。此外，外泌體部分蛋白也可以用于疾病的早期診斷，如胎球蛋白A 可作為急性腎損傷的標(biāo)志物[5]。再如乳腺癌的外泌體促凋亡蛋白生存素2B（Survivin2B），于乳腺癌早期患者中，表達(dá)較多，晚期弱表達(dá)甚至不表達(dá)，與腫瘤分級(jí)呈負(fù)相關(guān)[6]。因此，外泌體生存素2B 可作為乳腺癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。

1.2 外泌體所含脂質(zhì)

外泌體富含脂質(zhì)，外泌體膜與細(xì)胞膜較接近，富含鞘磷脂，膽固醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇等成分，同時(shí)也含有細(xì)胞來(lái)源的脂質(zhì)。這些脂質(zhì)成分，既能維持外泌體脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)膜的流動(dòng)，保護(hù)外泌體的內(nèi)容物miRNA，mRNA，蛋白質(zhì)等成分的完整，膜上的脂質(zhì)分子又能作為信號(hào)分子，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。

1.3 外泌體所含核酸

除蛋白，脂質(zhì)外，外泌體含有大量的微小RNA（MicroRNA，miRNA） 和 信 使RNA（message RNA，mRNA），核糖體RNA（rRNA），線粒體DNA（mtDNA）等。一直以來(lái)，我們多是依靠腫瘤的大小、惡性程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分期與分級(jí)，來(lái)判斷疾病及其預(yù)后。如今，外泌體攜帶的核酸可以作為疾病早期診斷的標(biāo)志物，如食管癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-21 可以輔助食管癌的診斷[7]，外泌體miR-145 可作為糖尿病腎病的早期診斷，再如胃癌來(lái)源的外泌體攜帶的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)在進(jìn)行腫瘤診斷上，比CEA，CA199 更有診斷價(jià)值。此外，外泌體攜帶的核酸，可以調(diào)節(jié)靶細(xì)胞基因的調(diào)控。如乳腺癌來(lái)源的外泌體通過(guò)分泌miR-10，下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞緊密蛋白的表達(dá)，增加血管內(nèi)皮的通透性，促進(jìn)乳腺癌的血源性轉(zhuǎn)移[8]。

2 外泌體之外的幾種胞外囊泡

機(jī)體分泌的囊泡不僅有外泌體，還有微泡和凋亡小體。雖然這些小囊泡都是由細(xì)胞分泌的，內(nèi)部均包含從母帶細(xì)胞中獲得的胞漿，但是它們之間也有差異。微泡和外泌體主要是由活細(xì)胞釋放的，而凋亡小體主要是由凋亡細(xì)胞釋放的。在實(shí)驗(yàn)中，由于微泡直徑與外泌體較接近，故兩者容易混淆。

2.1 微泡

一開始，Chargaff[9]認(rèn)為微泡是無(wú)血小板血漿中的沉淀物質(zhì)，能產(chǎn)生凝血酶。隨后，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，微泡，主要是由血小板，紅細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等胞膜出芽形成的[10]。它具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，直徑是在100-1000 nm 之間，與病毒直徑范圍接近，但是在血漿中，可以觀察到，微泡的直徑在100-400納米之間。微泡與外泌體較相似，可以與靶細(xì)胞膜直接融合，介導(dǎo)細(xì)胞間物質(zhì)交換與子代與親代之間信息溝通。有研究表明，紅細(xì)胞釋放微囊泡的數(shù)量容易受到環(huán)境因素的影響，故不能穩(wěn)定釋放。然而，腫瘤細(xì)胞不易受到環(huán)境因素影響，穩(wěn)定釋放微囊泡。由于微泡的數(shù)量，反映疾病與機(jī)體生理狀態(tài)。目前，人們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)微泡數(shù)量，盡管其具有局限性，不能檢測(cè)直徑小于200 nm 的囊泡，但它仍是檢測(cè)微泡應(yīng)用最廣泛的技術(shù)。

2.2 凋亡小體

凋亡小體，主要是由凋亡細(xì)胞釋放的，其直徑為1 ～5 μm。它的特點(diǎn)是凋亡小體磷脂酰絲氨酸外化同時(shí)其內(nèi)部可能含有碎片DNA。凋亡小體的主要功能是能夠向靶細(xì)胞轉(zhuǎn)移基因，從而可以促進(jìn)吞噬細(xì)胞出現(xiàn)T 細(xì)胞表位，促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞自身抗原等[11]。

3 外泌體與細(xì)胞間通訊方式

一直以來(lái)，我們認(rèn)為，細(xì)胞之間的交流都是通過(guò)細(xì)胞間接觸或者分子來(lái)實(shí)現(xiàn)的，如激素，如神經(jīng)遞質(zhì)等。但是自從外泌體被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)它也是細(xì)胞間信息傳遞的方式之一，它作為細(xì)胞間交流的媒介，參與細(xì)胞間物質(zhì)傳遞與信息傳遞。外泌體可以直接或者間接與靶細(xì)胞接觸，來(lái)進(jìn)行信號(hào)傳遞的。外泌體與細(xì)胞信息交流可能通過(guò)以下幾種：

3.1 外泌體或其釋放的物質(zhì)與細(xì)胞膜表面配體結(jié)合

這是由受體配體作用以及細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸介導(dǎo)的。細(xì)胞分泌的外泌體表面的Wnt 蛋白與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的分化[12]。此外，一部分外泌體可以向細(xì)胞外釋放一些因子，如白介素等，這些因子與靶細(xì)胞結(jié)合，介導(dǎo)一定的生物學(xué)功能。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以在在酸性條件向胞外釋放EGF、VEGF 等成分，這些成分作用到血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體導(dǎo)致血管形成，腫瘤生長(zhǎng)[13]。

3.2 外泌體被受體細(xì)胞內(nèi)吞

這種方式也是極常見的一種作用方式。細(xì)胞吞入的物質(zhì)為液體與極小的顆粒物質(zhì)，這屬于胞飲形式。受體細(xì)胞的內(nèi)吞活動(dòng)依賴于囊泡的大小，而囊泡的大小取決于囊泡所含有的內(nèi)容物。大的囊泡，則需要通過(guò)受體細(xì)胞的胞吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此過(guò)程是細(xì)胞骨架蛋白（微管蛋白，肌動(dòng)蛋白）介導(dǎo)的。同時(shí)，該過(guò)程受到受體細(xì)胞吞噬能力的影響。外泌體內(nèi)吞進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，它便與靶細(xì)胞器膜融合，向細(xì)胞質(zhì)釋放攜帶的內(nèi)容物作用于受體細(xì)胞，但是最終這些內(nèi)容物會(huì)被受體細(xì)胞溶酶體降解。研究發(fā)現(xiàn)，受體細(xì)胞內(nèi)吞外泌體，則可以通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞作用和網(wǎng)格蛋白非依賴性途徑，這兩條途徑得以實(shí)現(xiàn)[14-15]。

3.3 外泌體與靶細(xì)胞膜融合

在體內(nèi)微環(huán)境作用下，在Alix 和LBPA 的參與下，外泌體膜與細(xì)胞膜融合，外泌體內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞從而進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。陳纖[16]研究中，外泌體用紅色FM4-64 熒光染色，H460 細(xì)胞用綠色DiO 熒光染色。在DM2000 倒置相差熒光顯微鏡下，觀察到外泌體進(jìn)入H460 內(nèi)，并且H460 細(xì)胞膜部分顯示橙色（橙色為紅色與綠色的共定位）可判斷，膜融合也是外泌體信息傳遞的一種方式。

4 外泌體的臨床診斷價(jià)值

在各種疾病中，外泌體可以輔助臨床用于疾病診斷。Bhagirath[17]等人在研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA-1246 可以將正常人群，前列腺增生患者，以及侵襲性前列腺癌患者鑒別來(lái)。另有研究人員在研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體PSA，PSMA 蛋白，可以用于前列腺癌的診斷[18]。JIA[19]等人表明，外泌體miRNA-21可以輔助臨床用于乳腺癌的診斷。因此，將外泌體用于臨床指日可待。

5 展望

目前，外泌體的研究逐漸深入，人們對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)，幾種細(xì)胞外囊泡的鑒別，以及外泌體如何與靶細(xì)胞如何進(jìn)行通訊等有了較深入研究，但是更深層次的機(jī)制仍有待繼續(xù)研究研討。此外，外泌體內(nèi)容物的發(fā)現(xiàn)包括脂質(zhì)，核酸，蛋白，均有望應(yīng)用于臨床，為臨床疾病診斷提供新的方向。