延胡索中叔胺堿和季銨堿類組分的高效分離及鎮(zhèn)痛活性鑒定

高振華，王超然，郭秀潔，王紀(jì)霞，郭志謀，王聯(lián)芝

1湖北民族大學(xué)，恩施 44500；2中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，大連 116023；3中科院大化所中國醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，泰州 225300

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖，別名元胡、延胡、玄胡索、元胡索等，是傳統(tǒng)的“浙八味”之一[1,2]。作為一味應(yīng)用歷史悠久的活血、行氣、止痛中藥，其療效一直為歷代醫(yī)家推崇，目前也仍廣泛應(yīng)用于治療心律失常、氣虛瘀滯、胸痹心痛、脘腹疼痛、產(chǎn)后瘀滯腹痛、跌打損傷等，是中藥復(fù)方制劑中的常用藥[3,4]。

現(xiàn)代研究表明，延胡索中主要活性成分為生物堿，其中以叔胺型的原小檗堿類和季銨型的小檗堿類含量最高，占比可分別達(dá)到0.65%和0.3%左右[5-7]。這兩類成分骨架結(jié)構(gòu)非常類似，但生物學(xué)效應(yīng)大不相同。藥理學(xué)研究表明，延胡索的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠和安定等作用主要與水溶性極差的叔胺型生物堿相關(guān)[8,9]，其中以乙素、丑素最強(qiáng)，甲素次之，雖然都比嗎啡弱，但其作用受體為多巴胺受體，沒有成癮性缺陷，耐藥性也優(yōu)于嗎啡。相比之下，延胡索中的季銨堿成分，在鎮(zhèn)痛方面發(fā)現(xiàn)較少，但在抗心肌缺血、較少心肌耗氧等方面具有更顯著的作用[10-12]。

延胡索中叔胺堿和季銨堿的不同作用靶點(diǎn)和功效，提示了分別以叔胺堿和季銨堿類組分開發(fā)活性部位制劑將使藥效作用機(jī)制更加清晰，在治療具體疾病時(shí)更有針對(duì)性，具有中藥5類新藥的開發(fā)前景，而目前對(duì)延胡索作用機(jī)制和制劑產(chǎn)品的研究仍主要以總堿為主[13,14]，成分較復(fù)雜，往往難以有效闡明療效物質(zhì)基礎(chǔ)。也有部分研究工作采用樹脂層析或酸堿萃取的方式，得到了延胡索叔胺堿或季銨堿的組分，但總體工藝穩(wěn)定性較差，酸堿廢液量大，難以符合現(xiàn)代的環(huán)保生產(chǎn)要求，得到的組分純度也不高[15,16]。在前期分離純化延胡索生物堿單體的過程中，我們也發(fā)現(xiàn)這兩類成分在色譜填料上的色譜峰形和保留行為具有很大差異，將其采用C18WCX實(shí)現(xiàn)類組分分離后，分別采用C18和C18SCX來制備叔胺堿和季銨堿單體，可以使兩類成分在不同的分離方法中獲得良好的色譜峰形和載樣量，從而降低純化制備的難度[17]。因此，發(fā)展高效的延胡索生物堿類組分制備方法，不僅對(duì)延胡索類組分制劑的開發(fā)具有重要作用，對(duì)生物堿單體的制備，深入研究延胡索的組成成分也能帶來很大的便利。

為克服使用C18WCX填料進(jìn)行類組分制備過程中載樣量不易控制，填料比較小眾不易產(chǎn)業(yè)化等缺點(diǎn)，本文采用普通C18填料，利用延胡索叔胺堿和季銨堿在不同pH值條件下電荷性質(zhì)不同的特點(diǎn)，發(fā)展了一種更為簡便易行的延胡索類組分高效制備方法，并對(duì)得到的兩類組分進(jìn)行了生物堿含量測定和多巴胺D2受體拮抗活性的驗(yàn)證，結(jié)果顯示，兩類成分在新方法中得到了有效分離，且類組分的生物堿含量以已知對(duì)照品計(jì)分別達(dá)到了84.0%和60.7%，符合有效部位中藥制劑的開發(fā)要求，延胡索提取物的多巴胺D2受體拮抗活性也集中在了叔胺堿組分中，可為相應(yīng)的類組分新藥制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

實(shí)驗(yàn)儀器：Alliance e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)包括自動(dòng)進(jìn)樣器，2695型分離單元，柱溫箱系統(tǒng)，2996型光電二極管陣列檢測器和 Empower 色譜工作站。YJD20D-GL十功能自動(dòng)煎藥機(jī)(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司)、LX-0400型20 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)、CeraMem0100-015型500 nm陶瓷膜(廈門福美科技有限公司)、DAC-50動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱(江蘇漢邦科技有限公司)、PUERLAB Chorus實(shí)驗(yàn)室純水機(jī)(英國ELGA公司)、FLIPR Tetra 高通量實(shí)時(shí)熒光檢測分析系統(tǒng)(美國Molecular Devices公司)、SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

使用的色譜柱：Kromasil 100-5-C18柱(4.6×150 mm，5 μm，Kromasil，瑞典)；C18柱(4.6×250 mm，10 μm，大連思譜，大連)。

延胡索藥材樣品(產(chǎn)自浙江金華)。乙腈、乙醇、醋酸、醋酸銨均為分析純(購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、多巴胺、氟哌啶醇(購自梯希愛上海仁成工業(yè)發(fā)展有限公司)、制備乙醇(購自上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?。所使用的對(duì)照品(1∶1，3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿；2：去氫紫堇球堿；3：巴馬汀；4：去氫紫堇堿；5：海罌粟堿；6：延胡索乙素；7：延胡索甲素.)均為實(shí)驗(yàn)室自制，HPLC檢測純度為95%以上。制備實(shí)驗(yàn)所使用的C18填料購自大連思譜精工有限公司，粒徑10 μm，孔徑10 nm。固相萃取實(shí)驗(yàn)所使用的C18CEX填料購自大連思譜精工有限公司，粒徑40 μm，孔徑10 nm。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 延胡索生物堿提取物制備

取延胡索干燥樣品500 g，放入十功能自動(dòng)煎藥機(jī)，第一次提取加入70%乙醇水溶液5 L，提取溫度80 ℃，沸騰后煎煮60 min，第二次提取加入70%乙醇水溶液5 L，溫度80 ℃，沸騰后煎煮40 min，合并兩次提取液。用20 L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮去除乙醇至1.6 L后，使用500 nm陶瓷膜進(jìn)行澄清過濾，收集透過液，至循環(huán)端液體體積降低至200～300 mL后，加0.8 L純化水進(jìn)行洗濾，合并膜透過液，得到延胡索澄清透過液1.80 L，旋蒸濃縮至180 mL，取2.0 mL樣品凍干得固體0.245 g，測得其固含量為122.5 g/L，總提物為22.05 g。

1.2.2 延胡索生物堿提取物樣品分析和類組分制備方法開發(fā)

樣品分析：Kromasil 100-5-C18(5 μm，4.6×150 mm)色譜柱，流動(dòng)相A相為乙腈，B相為0.1%磷酸(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.0)或0.1 mol/L醋酸銨(加醋酸調(diào)節(jié)pH值為6.0、6.5、6.8)，C相為純水，梯度洗脫條件：0～20 min，23% A；20～30 min，23%→55% A；30～50 min，55% A；B相固定20%。檢測波長280 nm，流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

類組分制備方法開發(fā)：C18(10 μm，4.6×250 mm)色譜柱，流動(dòng)相A為乙醇，B為20 mmol醋酸銨(pH值為6.8)，梯度洗脫條件：0～20 min，23% A；20～30 min，23%←55% A；30～50 min，55% A。臺(tái)階等度洗脫條件：0～30 min，23%A；30～30.1 min，23%～55%A；30.1～50 min，55%A。檢測波長280 nm，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。

1.2.3 延胡索類組分制備

制備柱為DAC-50 mm動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱，填裝C18(10 μm，大連思譜，大連)填料300 g，流動(dòng)相A為乙醇，B為20 mmol醋酸銨(pH值為6.8)，梯度洗脫條件：0～30 min，23%A；30～30.1 min，23%→55%A；30.1～50 min，55%A。檢測波長280 nm，流速70 mL/min。

1.2.4 延胡索類組分含量測定

對(duì)照品溶液的配制：使用十萬分之一天平，準(zhǔn)確稱取延胡索乙素、延胡索甲素和海罌粟堿各10 mg，使用含0.1%甲酸的50%甲醇進(jìn)行溶解，配制成一系列梯度的叔胺堿混合對(duì)照品溶液，另稱取去氫紫堇堿、巴馬汀、去氫紫堇球堿、1，3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿各10 mg，使用含0.1%甲酸的50%甲醇進(jìn)行溶解，配制成一系列梯度的季銨堿混合對(duì)照品溶液。以混合對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，叔胺堿混合標(biāo)準(zhǔn)品在3.2～2 000 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999 7，季銨堿混合標(biāo)準(zhǔn)品在40～1 000 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999 9。

延胡索類組分供試品制備：稱取類組分制備得到的叔胺堿和季銨堿類組分凍干粉末各10 mg，使用50%甲醇水溶液超聲溶解后于10 mL容量瓶中定容，配置成1 mg/mL的叔胺堿及季銨堿類組分供試品溶液。

1.2.5 鎮(zhèn)痛活性測試實(shí)驗(yàn)條件

將延胡索提取物及類組分樣品取樣，在表達(dá)多巴胺D2受體的細(xì)胞人胚腎293T細(xì)胞(HEK293T)上，采用FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader，Molecular Device Corp)進(jìn)行活性篩選，樣品終濃度為50 μg/mL。以每孔80 000個(gè)細(xì)胞接種于用poly-D-lysine涂層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后除去培養(yǎng)基并于每孔中加入100 μL熒光染料溶液(calcium-6)在37 °C下恒溫1 h時(shí)，除去染料溶液并于每孔加入100 μL 0.5% amaranth，將待測樣品用二甲基亞砜(DMSO)溶解后置于96孔板中，采用FLIPR進(jìn)行自動(dòng)加樣與細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育10 min后在520和488 nm波長下進(jìn)行熒光檢測從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度進(jìn)行監(jiān)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 延胡索提取物樣品分析

參考文獻(xiàn)方法[18,19]，我們首先以乙腈和磷酸三乙胺緩沖鹽(pH 6.0)為流動(dòng)相對(duì)延胡索提取物進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖2a所示，延胡索主要生物堿成分都得到了較好的分離，20 min以后峰色譜峰峰形良好，但5～20 min區(qū)域的色譜峰均較拖尾。通過DAD檢測器的色譜峰紫外光譜圖分析可知(如圖3所示)，峰1～6均具有季銨型小檗堿類生物堿的特征吸收，而峰8～12均為叔胺型原小檗堿類生物堿的特征吸收，峰7為海罌粟堿為阿樸啡類生物堿的特征吸收。通過與實(shí)驗(yàn)室前期自制的標(biāo)品對(duì)比，2、3、4、6號(hào)峰分別為1，3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿、去氫紫堇球堿、巴馬汀、去氫紫堇堿(均為季銨堿)，峰9、12分別為延胡索乙素、延胡索甲素，峰7為海罌粟堿(均為叔胺堿)，也證實(shí)兩類成分在接近中性的流動(dòng)相體系下，色譜保留時(shí)間存在較大差異，能夠?qū)崿F(xiàn)兩類組分的良好分離。在該pH條件下，堿性較弱的叔胺堿電離已經(jīng)得到大部分抑制，主要呈分子態(tài)，保留較強(qiáng)，色譜峰形也較好，而季銨堿永久帶電荷，呈離子狀態(tài)，因而保留總體弱于叔胺堿。

磷酸三乙胺不易揮發(fā)，且在后續(xù)工業(yè)生產(chǎn)中無法用膜分離回收套用，為便于后續(xù)的液質(zhì)聯(lián)用分析和工業(yè)化制備應(yīng)用，我們嘗試用中性的醋酸銨代替磷酸三乙胺。如圖2b所示，0.1 mol/L 醋酸銨(pH 6.8)條件下，叔胺堿與季銨堿同樣可以實(shí)現(xiàn)良好的分離，且具有鎮(zhèn)痛活性的海罌粟堿與叔胺堿更為接近，可將其歸入叔胺堿類組分。但海罌粟堿與8號(hào)峰的保留過于接近，不利于含量分析，經(jīng)pH微調(diào)，發(fā)現(xiàn)pH為6.5時(shí)，7號(hào)峰海罌粟堿能與周邊峰得到更好的分離，故選擇pH6.5為分析條件，而在類組分制備時(shí)可選擇pH6.8。

2.2 延胡索類組分制備方法開發(fā)與組分制備

在傳統(tǒng)方法中，常使用大孔吸附樹脂對(duì)延胡索生物堿成分純化分離，但是大孔吸附樹脂對(duì)溶劑需求量大，樣品分離過程緩慢，且大孔吸附樹脂再生復(fù)雜，不適合大量樣品的分離制備[20]。制備色譜通常使用10 μm以上的填料，且優(yōu)先使用甲醇、乙醇等易于納濾回收且價(jià)格相對(duì)低廉的有機(jī)溶劑，以節(jié)約溶劑的使用成本。本實(shí)驗(yàn)采用了10 μm的C18填料，先使用4.6×250 mm的預(yù)裝柱上進(jìn)行溶劑和梯度方法考察。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在乙醇/醋酸銨(pH 6.8)體系下，采用相同的梯度條件，延胡索提取物中的季銨堿雖然峰形更為拖尾，但與叔胺堿的類分離由于叔胺堿的保留增強(qiáng)，類分離效果更優(yōu)(如圖4a所示)，這也可能是制備填料與分析柱填料選擇性略有差異導(dǎo)致。為便于生產(chǎn)制備，將梯度條件簡化為23%乙醇和55%乙醇兩個(gè)臺(tái)階梯度，分別用于洗脫季銨堿和叔胺堿?？紤]到圖4a中20 min 23%的乙醇還不能把季銨洗脫完全，因此把季銨堿的洗脫時(shí)間延長到30 min，結(jié)果如圖4b所示，叔胺堿和季銨堿的分離度進(jìn)一步擴(kuò)大。

圖1 延胡索中主要的叔胺堿和季銨堿Fig.1 Structures of main tertiary and quaternary alkaloids in Rhizoma Corydalis

圖2 延胡索提取物在不同緩沖鹽條件下的分離譜圖Fig.2 Separation chromatogram of Rhizoma Corydalis extracts with different buffer salt 注：流動(dòng)相添加劑:(a)0.1%磷酸三乙胺；(b～d)0.1 mol/L醋酸銨，pH值分別為6.8、6.5、6.0。洗脫梯度(a)：0～20 min，23% A；20～30 min，23%→55% A；30～50 min，55% A；洗脫梯度(b～d)：0～20 min，23% A；20～30 min，23%→55% A；30～50 min，55% A，緩沖鹽相固定20%。色譜峰：叔胺堿：7.海罌粟堿；9.延胡索乙素；12.延胡索甲素；季銨堿：2.1，3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿；3.去氫紫堇球堿；4.巴馬?。?.去氫紫堇堿。Note:Additives:(a) 0.1% triethylammonium phosphate;(b-d) 0.1 mol/L ammonium acetate with pH at 6.8,6.5,6.0 respectively.gradient(a):0-20 min,23%A;20-30 min,23%→55%A;30-50 min,55%A.gradient(b-d):0-20 min,23%A;20-30 min,23%→55%A;30-50 min,55%A,buffer salt phase fixed at 20%.Peaks:Tertiary alkaloids:7.Glaucine;9.Tetrahydropalmatine;12.Corydaline;Quaternary alkaloids:2.1,3-Methyldehdrocorydalmine;3.Dehydrocorybulbine;4.Palmatine;6.Dehydrocorydaline.

圖3 延胡索提取物主要色譜峰的紫外吸收譜圖Fig.3 Ultraviolet spectra of main chromatographic peaks of Corydalis extracts

圖4 乙醇/醋酸銨體系梯度及臺(tái)階等度色譜圖Fig.4 Gradient and step equivalent chromatography of ethanol/ammonium acetate system

在選定的流動(dòng)相條件下，將方法轉(zhuǎn)移至裝填有300 g相同C18填料的DAC-50 mm制備柱上進(jìn)行放大。經(jīng)簡單摸索，樣品上樣量為80 mL(含固體9.8 g，相當(dāng)于填料量3.3%)時(shí)的制備譜圖如圖5所示：

圖5 延胡索類組分制備液相色譜圖Fig.5 Preparative chromatogram of Rhizoma Corydalis class separation

分別收集10～20 min和34～50 min的餾分，進(jìn)行HPLC分析，分析結(jié)果如圖6所示，可以看到兩類組分實(shí)現(xiàn)了良好的分離，兩類生物堿之間無成分交叉。從制備譜圖和分析結(jié)果看，樣品載樣量還有比較大的提升空間，但本次實(shí)驗(yàn)因?yàn)樘崛∥飿悠妨坑邢?，上樣量先增加到了填料量?.3%，在工業(yè)化生產(chǎn)過程中樣品載樣量可以繼續(xù)增大，適用于大規(guī)模樣品的生產(chǎn)制備。

圖6 制備餾分分析色譜圖Fig.6 Analytical chromatograms of preparative fractions

2.3 延胡索類組分的后處理與含量測定

上述制備方法制得的延胡索類組分含有醋酸銨緩沖鹽，在工業(yè)生產(chǎn)中，可使用納濾膜濃縮，實(shí)現(xiàn)溶劑回收套用，但本次小試的樣品量較少，采用固相萃取(SPE)的方式進(jìn)行同步脫鹽和濃縮。實(shí)驗(yàn)使用一種耐純水的親水性反相填料C18CEX作為SPE固定相，將類組分制備所得餾分經(jīng)旋蒸濃縮除去乙醇后，分別上樣至兩個(gè)活化平衡好的20 g裝SPE柱，水洗3倍柱體積脫鹽后，甲醇洗脫，旋蒸，凍干得到固體粉末，其中季銨堿固體粉末0.68 g ，叔胺堿固體粉末1.00 g。

按前述分析方法，以實(shí)驗(yàn)室自制的7個(gè)已知成分為對(duì)照品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)所制得的類組分進(jìn)行含量測定。計(jì)算結(jié)果顯示，在叔胺堿類組分中延胡索乙素含量21.0%，延胡索甲素含量21.0%，海罌粟堿含量42.0%，以該3個(gè)主要已知叔胺堿計(jì)，叔胺型類組分的生物堿含量達(dá)84.0%，而在季銨堿類組分中去氫紫堇堿含量37.0%，巴馬汀含量7.7%，去氫紫堇球堿含量5.5%，1，3-甲基去氫紫堇達(dá)明堿含量10.5%，以這4種已知對(duì)照品計(jì)，該類組分種含已知成分的含量達(dá)60.7%，兩個(gè)類組分的已知成分含量總和均超過50%，符合中藥有效部位制劑的已知成分含量大于50%的要求。

圖7 延胡索類組分含量測定Fig.7 Determination of class components in Rhizoma Corydalis

2.4 延胡索類組分化合物在D2受體上的拮抗作用測試

圖8 延胡索組分D2受體拮抗活性測試Fig.8 Antagonist activity of Rhizoma Corydalis fractions on D2 receptor注：與陰性對(duì)照組(buffer+dopamine)比較，**P < 0.01。Note:Compared with negative control group (buffer+dopamine),**P < 0.01.

圖9 不同濃度叔胺堿拮抗活性Fig.9 Antagonistic activity of different concentrations of tertiary alkaloid注：濃度1～3分別為50.00、1.85、0.07 μg/mL。Note:Concentration 1-3 were 50.00,1.85,0.07 μg/mL,respectively.

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，延胡索的鎮(zhèn)痛、安定作用是通過多巴胺受體系統(tǒng)發(fā)揮作用的，尤其是對(duì)多巴胺D2受體的拮抗作用[21]。將制備的季銨堿和叔胺堿類組分與延胡索提取物在Fliper實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上進(jìn)行了多巴胺D2拮抗作用的活性對(duì)比，結(jié)果如圖8所示，延胡索提取物對(duì)多巴胺D2受體有顯著拮抗作用，其作用強(qiáng)度與陰性對(duì)照組(dopamine)相比具有顯著性差異，且大于陽性對(duì)照氟哌啶醇(haloperidol)，制備成類組分后，季銨堿類組分的拮抗活性較弱，而叔胺堿的活性強(qiáng)于提取物，這也證明了兩類組分在藥理活性上的差異。叔胺堿組分在不同濃度下都具有拮抗活性，如圖9所示，對(duì)叔胺堿樣品進(jìn)行稀釋并測定其拮抗活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度降低至1.85 μg/mL時(shí)，叔胺堿組分達(dá)到最低抑制濃度，拮抗活性明顯，繼續(xù)降低濃度直至0.07 μg/mL時(shí)，拮抗活性明顯降低，證明了叔胺堿組分的拮抗活性具有劑量依賴性，這些結(jié)果為更有治療針對(duì)性的有效部位制劑開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論

延胡索中叔胺堿和季銨堿兩類生物堿在電離狀態(tài)下保留接近難以區(qū)分，但隨著流動(dòng)相pH值升高，叔胺堿的電離更易受到抑制，保留時(shí)間顯著增強(qiáng)，能與季銨堿組分實(shí)現(xiàn)有效分離，從而開發(fā)了一種簡便的類組分分離方法。通過分離制備得到了兩類成分區(qū)分明晰、含量較高，且具有不同藥理活性的生物堿類組分，通過多巴胺D2受體的拮抗活性測試，也進(jìn)一步證實(shí)延胡索的鎮(zhèn)痛相關(guān)活性物質(zhì)主要集中在叔胺堿類組分。這些結(jié)果為延胡索生物堿化學(xué)成分研究和具有針對(duì)性治療作用的有效部位制劑開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。