不同品種豇豆發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變化及產(chǎn)植物細(xì)胞壁降解酶微生物種類分析

厙 曉,錢 楊,李婭琳,何鵬暉,蔣珍菊,常 偉,龔 麗,饒 瑜

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039;2.西華大學(xué)理學(xué)院,四川成都 610039;3.成都產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院有限責(zé)任公司,四川成都 610100;4.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司四川分公司,四川成都 610100)

豇豆(VignaunguiculataL.),別名長(zhǎng)豆角、飯豆、裙帶豆等,屬豆科一年生植物。莖有矮性、半蔓性和蔓性三種。豇豆喜溫,主要在夏秋兩季上市,其食用方法很多,泡制是一種最常見的貯藏和食用方式[1]。發(fā)酵豇豆(fermented-cowpea)是我國(guó)傳統(tǒng)特色發(fā)酵食品[2],也是我國(guó)產(chǎn)銷量較高的四川泡菜之一,不僅美味爽口,而且具有解膩開胃、促消化等功效[3-4]。無論是在家庭制作還是工廠生產(chǎn)中,發(fā)酵豇豆都是最易發(fā)生腐敗的泡菜之一,這是由于四川泡菜原料自身攜帶了多種微生物,其中包括易造成泡菜腐敗的微生物[5]。

發(fā)酵豇豆的主要腐敗特征表現(xiàn)有軟腐、產(chǎn)生酸敗腐爛味、“生花”即形成膜醭等[5]。蔬菜軟腐是由于部分微生物具有產(chǎn)植物細(xì)胞壁降解酶(plant cell wall degradation enzymes,PCWDEs)的特性,PCWDEs主要包括淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶等,這些酶能分解泡菜中的纖維素、果膠、木質(zhì)素等[6-7],從而導(dǎo)致蔬菜質(zhì)地變軟,引起蔬菜軟腐。目前對(duì)新鮮蔬菜中產(chǎn)PCWDEs的微生物報(bào)道較多,且多為真菌,但對(duì)發(fā)酵蔬菜尤其是發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs的微生物報(bào)道甚少,而這些微生物代謝所產(chǎn)生的PCWDEs是造成蔬菜軟腐的重要因素,也是發(fā)酵蔬菜行業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。

本文選用不同品種的豇豆,用配制的老鹽水發(fā)酵制作發(fā)酵豇豆,研究發(fā)酵過程中發(fā)酵豇豆的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變化并對(duì)產(chǎn)PCWDEs微生物種類進(jìn)行分析，以期為發(fā)酵蔬菜的生產(chǎn)和貯藏提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豇豆 具體品種見表1,購(gòu)于蔬菜基地;老鹽水活化用的蘿卜、豇豆、大蒜、生姜、花椒等 購(gòu)買于當(dāng)?shù)氐牟耸袌?chǎng);老鹽水 采集于當(dāng)?shù)匾患彝?DNA Marker、Taq DNA連接酶(2.5 U/μL)、dNTPs、DNA提取試劑盒、DNA純化試劑盒 北京天根生化科技有限公司;RNase A 美國(guó)Sigma公司;胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soy agar,TSA)培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soy broth,TSB)培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、虎紅瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;蛋白酶(protease)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%脫脂牛奶)、淀粉酶(amylase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%可溶性淀粉)、纖維素酶(cellulase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加0.1%羧甲基纖維素,25 mmol/L磷酸鈉,pH7.0)、木聚糖酶(xylanase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%木聚糖,25 mmol/L磷酸鈉,pH7.0)、果膠酶(pectate lyase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%多聚半乳糖醛酸(PGA),1%酵母提取物,0.38 μmol/L CaCl2,100 mmol/L Tri-HCl,pH8.5)、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)鑒別培養(yǎng)基(以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加1%多聚半乳糖醛酸(PGA),1%酵母提取物,2.2 mmol/L EDTA,110 mmol/L乙酸鈉,pH5.5) 實(shí)驗(yàn)室自制；其他化學(xué)試劑 均為分析純。

表1 供試豇豆品種來源及特性Table 1 Sources and characteristics of tested cowpea varieties

TA-XT Plus型質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司;Master cycler EP gradient聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 德國(guó)Eppendorf公司;Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;DYY-8C電泳儀 北京六一儀器廠;pH S-3C酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司;MULTIFUGE X1R高速冷凍離心機(jī)、900 SERIES超低溫冰箱 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 老鹽水的活化 用無菌肖特瓶從當(dāng)?shù)匾患彝ゲ杉消}水1000 mL,置于冰盒中,2 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室,備用。將洗凈晾干的蘿卜、豇豆、大蒜、生姜、花椒等裝入30 L的土陶壇至2/3處,加入1000 mL老鹽水,并用含NaCl質(zhì)量濃度60 g/L的冷開水補(bǔ)至土陶壇總體積的4/5處,液封,在25 ℃下發(fā)酵7 d,備用。

1.2.2 發(fā)酵豇豆的制作 將不同品種豇豆樣品洗凈、晾干,分別裝入10 L玻璃壇子至2/3處,接入活化后的老鹽水30 mL,再用NaCl質(zhì)量濃度為60 g/L的冷開水補(bǔ)至玻璃壇總體積的4/5處,料液比約2∶1。液封,每個(gè)品種三個(gè)平行,在25 ℃下發(fā)酵24 d,每隔4 d取適量豇豆及鹽鹵檢測(cè)。

1.2.3 pH的測(cè)定 在豇豆發(fā)酵過程中每隔4 d用無菌移液管在無菌操作臺(tái)中移取10 mL鹽鹵,用pH計(jì)測(cè)定鹽鹵pH。

1.2.4 微生物計(jì)數(shù) 在不同品種豇豆的發(fā)酵過程中,每隔4 d取鹽鹵樣品并進(jìn)行總菌、乳酸菌、真菌計(jì)數(shù)。參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》的方法制備樣品稀釋液,選取適當(dāng)?shù)南♂尪韧坎加谂囵B(yǎng)基。TSA培養(yǎng)基用于總菌落計(jì)數(shù),MRS瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌計(jì)數(shù),虎紅瓊脂培養(yǎng)基用于真菌計(jì)數(shù)。

1.2.5 感官評(píng)價(jià) 在豇豆發(fā)酵過程中采用綜合評(píng)分法,以泡菜的色澤、香氣、鹽鹵渾濁度、膜醭生長(zhǎng)情況為評(píng)價(jià)指標(biāo),以每個(gè)項(xiàng)目25分制評(píng)定,綜合評(píng)分滿分為100分,通過30名不同年齡階段的食品專業(yè)人員測(cè)評(píng),測(cè)評(píng)人員的年齡在20～40歲之間,男∶女=2∶3,評(píng)價(jià)方式采用風(fēng)味食品常用的盲評(píng)打分法,統(tǒng)計(jì)平均評(píng)價(jià)分值作為有效數(shù)據(jù),評(píng)分按表2進(jìn)行。

表2 發(fā)酵豇豆感官指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of fermented cowpea

1.2.6 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 采用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測(cè)定,探頭P/5。測(cè)試程序:測(cè)試前速度2 mm/s,測(cè)試速度3 mm/s,測(cè)試后速度2 mm/s,測(cè)定間隔時(shí)間5 s,壓縮量30%,壓縮力5.0 g,測(cè)定發(fā)酵豇豆的硬度、彈性、咀嚼性。每組試驗(yàn)重復(fù)5次,以平均值表示試驗(yàn)結(jié)果[8]。

1.2.7 產(chǎn)PCWDEs微生物的分離及特性分析 在四種豇豆發(fā)酵的第24 d，從鹽鹵固體培養(yǎng)基中各隨機(jī)挑取30株菌進(jìn)行產(chǎn)PCWDEs檢測(cè),編號(hào)分別為A-1～A-30、B-1～B-30、C-1～C-30、D-1～D-30,分別用6種產(chǎn)酶特性鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行產(chǎn)PCWDEs檢測(cè)[9],于28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察各菌株產(chǎn)PCWDEs情況。判定方法:蛋白酶,可直接觀察透明區(qū)域;聚半乳糖醛酸酶和果膠酶,用4 N鹽酸加在菌落周圍并觀察透明區(qū)域;淀粉酶,用碘液染色并觀察透明區(qū)域;纖維素酶和木聚糖酶,用0.1%剛果紅溶液染色15～30 min,再用1 mol/L NaCl沖洗數(shù)次,觀察菌落周圍透明區(qū)域;若有透明區(qū)域,則表示此菌株產(chǎn)PCWDEs。

1.2.8 產(chǎn)PCWDEs微生物的分子生物學(xué)鑒定 對(duì)產(chǎn)植物細(xì)胞降解酶的單克隆菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。使用蔣云露等[10]研究的快速提取法提取總DNA,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取結(jié)果[11]。以提取的DNA為模板,細(xì)菌以引物Eu27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1490R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為正向和反向引物;PCR體外擴(kuò)增條件為:95 ℃、5 min;95 ℃、1 min、50 ℃、1 min、72 ℃、2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃、10 min,進(jìn)行16S rDNA片段擴(kuò)增。真菌以引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)為正向和反向引物,其PCR體外擴(kuò)增條件為:94 ℃、1 min;94 ℃、1 min,52 ℃、1 min,72 ℃、1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃、5 min,進(jìn)行18S rDNA片段擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序,測(cè)得的序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast比對(duì),其同源性≥97%時(shí)可認(rèn)為是同一個(gè)屬,同源性≥98%時(shí)可認(rèn)為是同一個(gè)種[7],并通過Clustal X軟件多重比對(duì)后用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[5],并對(duì)四種發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物的種類進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用OriginLab 8.0軟件、MEGA 6.0軟件、Clustal X軟件、SPSS軟件、Excel 2007對(duì)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種豇豆發(fā)酵過程中的pH變化

以不同品種豇豆為原料進(jìn)行發(fā)酵,在豇豆發(fā)酵過程中鹽鹵的pH變化有明顯的品種特異性(如圖1所示)。豇豆品種A在發(fā)酵過程中pH下降最快,第4 d時(shí)pH已達(dá)到4.0;豇豆品種C在發(fā)酵的第8 d時(shí)pH可降至4.7。pH是表征泡菜乳酸發(fā)酵成熟和泡菜腐敗的重要指標(biāo)之一[12]。泡菜中的乳酸發(fā)酵是乳酸菌利用蔬菜中的糖進(jìn)行厭氧發(fā)酵生成乳酸的過程,因此泡菜的發(fā)酵過程常伴隨著鹽鹵pH的下降。通常認(rèn)為鹽鹵pH降至4.0左右時(shí),泡菜發(fā)酵成熟[13]。以鹽鹵pH為參照,豇豆品種A發(fā)酵成熟速度最快。

圖1 發(fā)酵過程中豇豆的pH變化Fig.1 The pH change of cowpea during fermentation

豇豆品種A和C在12～24 d保持pH相對(duì)恒定。豇豆品種B和D在發(fā)酵前8 d pH呈下降趨勢(shì),隨即pH開始上升,第24 d時(shí)已回升至pH6.5以上。在泡菜發(fā)酵和儲(chǔ)藏過程中,鹽鹵pH的回升則是判斷泡菜腐敗的重要標(biāo)志之一[12],這是由于某些微生物可以耐受低pH而生長(zhǎng),消耗以乳酸為主的有機(jī)酸或產(chǎn)PCWDEs造成泡菜腐敗[14]。由此可以看出,豇豆品種B和D在發(fā)酵后期和儲(chǔ)藏過程中更易發(fā)生腐敗。

2.2 不同品種豇豆發(fā)酵過程中的微生物變化

鹽鹵pH的變化主要由微生物生長(zhǎng)代謝引起[12]。泡菜發(fā)酵過程中的微生物主要來源于蔬菜自身攜帶和所接種老鹽水中的微生物。本研究中所用老鹽水均為同一壇同一批次的老鹽水,因此在發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化的差異主要源于豇豆品種的不同。

不同品種豇豆發(fā)酵過程中的微生物群落變化表現(xiàn)出與鹽鹵pH變化一致的品種特異性。如圖2a,豇豆品種A發(fā)酵前期中乳酸菌生長(zhǎng)最快,第4 d時(shí)已高于6.0 lg cfu/mL,第8 d時(shí)乳酸菌和總菌均達(dá)到最高,分別高于7.0、8.0 lg cfu/mL,這與豇豆A發(fā)酵過程中pH下降最快的結(jié)果相符,豇豆品種A在發(fā)酵過程中pH與乳酸菌的數(shù)量之間存在極顯著相關(guān)(r=0.888,p<0.01),這說明蔬菜在乳酸發(fā)酵過程中乳酸菌的生長(zhǎng)與鹽鹵pH的下降相關(guān),這與熊濤等[15]的研究一致。豇豆品種B、C、D發(fā)酵前期乳酸菌生長(zhǎng)速度較品種A慢(圖2),這是這三種品種豇豆發(fā)酵前期鹽鹵pH下降相對(duì)緩慢的主要原因。不同品種的豇豆中還原糖、蛋白質(zhì)、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分存在顯著差異[16],這是影響發(fā)酵過程中微生物群落生長(zhǎng)差異的主要因素之一。

圖2 發(fā)酵過程中豇豆的微生物變化Fig.2 Microbial changes of cowpea during fermentation

發(fā)酵12 d后,品種A發(fā)酵豇豆中總菌和乳酸菌數(shù)量分別下降并隨即趨于平衡,真菌數(shù)量先增加后下降最后在4.5 lg cfu/mL左右波動(dòng)(圖2);豇豆品種B、品種C和品種D中乳酸菌于12 d后開始減少,但總菌數(shù)量仍高于7.0 lg cfu/mL;真菌數(shù)量也持續(xù)增長(zhǎng),特別是品種B于15 d時(shí)發(fā)酵豇豆中的真菌數(shù)量可達(dá)到(5.9±0.3) lg cfu/mL,隨后持續(xù)增加,在發(fā)酵20 d時(shí)達(dá)到(7.3±0.4) lg cfu/mL。在整個(gè)發(fā)酵過程,品種A的pH、微生物數(shù)量變化與一般蔬菜在發(fā)酵過程的相似,而品種B、C、D在發(fā)酵過程中pH均未下降至4.0左右,且發(fā)酵后期的真菌數(shù)量明顯高于品種A的,這可能與豇豆的品種有關(guān)。

2.3 不同品種豇豆發(fā)酵過程中的感官評(píng)價(jià)分析

在實(shí)驗(yàn)過程中,部分發(fā)酵豇豆在發(fā)酵第12 d開始出現(xiàn)腐敗膜醭,到第24 d時(shí),發(fā)酵結(jié)束,由此對(duì)第12、24 d的發(fā)酵豇豆進(jìn)行感官分析,其結(jié)果見表3。

由表3知,品種A在發(fā)酵第12、24 d時(shí)的感官評(píng)價(jià)得分均最高,發(fā)酵過程中,其色澤新鮮、鹽鹵清亮,有著較濃的泡菜香氣;品種B最低,在發(fā)酵第12 d時(shí)色澤偏暗沉,鹽鹵表面有連成一片的膜醭,第24 d時(shí)色澤發(fā)黑,鹽鹵渾濁;品種C與品種D在發(fā)酵第12 d時(shí)表現(xiàn)出正常的泡菜的品質(zhì),但在發(fā)酵第24 d時(shí),色澤偏暗沉、出現(xiàn)腐爛味、鹽鹵較渾濁,泡菜品質(zhì)下降,但好于品種B。

2.4 不同品種豇豆發(fā)酵過程中的質(zhì)構(gòu)分析

分別在發(fā)酵開始(第0 d)、部分發(fā)酵豇豆出現(xiàn)腐敗膜醭(第12 d)、發(fā)酵結(jié)束(第24 d)時(shí)取不同品種豇豆樣品,從硬度、咀嚼性和彈性三個(gè)特征參數(shù)來分析不同豇豆樣品的質(zhì)構(gòu)變化,結(jié)果如圖3。在發(fā)酵第0 d時(shí),不同品種豇豆的硬度、彈性、咀嚼力差異不顯著(p>0.05),品種B的彈性(0.8825)略低于其他三個(gè)品種(0.92左右)。發(fā)酵前12 d,豇豆的硬度、咀嚼力降低很快,其中品種C的硬度下降率為81.97%,品種A、B、C的下降率在60%左右;發(fā)酵第12 d時(shí),4個(gè)品種豇豆的硬度、彈性、咀嚼力差異均不顯著(p>0.05),但硬度和咀嚼力與發(fā)酵第0 d的差異顯著(p<0.05)。在發(fā)酵的12～24 d中,品種B的硬度、彈性、咀嚼力下降率分別為68.97%、48.50%、63.43%,而其余品種豇豆下降率都比品種B小;第24 d時(shí)品種B的彈性與其余三種豇豆有顯著性差異(p<0.05)。由表3知,發(fā)酵第24 d時(shí),品種B表現(xiàn)出的感官品質(zhì)最差,品種A最好;相比于品種C和品種D,品種A的質(zhì)構(gòu)特征更好,這也是品種A在發(fā)酵過程中鹽鹵清亮、色澤新鮮的重要原因之一。

表3 感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Results of sensory evaluation

圖3 發(fā)酵豇豆質(zhì)構(gòu)測(cè)試結(jié)果Fig.3 Results of texture test of cowpea during fermentation注:誤差線上的a～d表示不同豇豆不同時(shí)間之間的顯著性差異。

蔬菜原料的品種會(huì)影響其發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)。近年來已有報(bào)道不同品種芥菜、辣椒、蘿卜等在發(fā)酵后表現(xiàn)出不同的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、亞硝酸鹽等產(chǎn)品品質(zhì)特征[17-18]。陳玲等[19]發(fā)現(xiàn)3種豇豆品種發(fā)酵后的總酸、還原糖和感官品質(zhì)均有差異,周情操[20]以湖北地區(qū)9個(gè)豇豆品種為原料泡制后產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)也有較大不同。除不同品種蔬菜自身的差異之外,這些風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)的不同主要受發(fā)酵過程中微生物的生長(zhǎng)代謝情況影響[21-22]。本研究中品種A豇豆發(fā)酵前期乳酸菌生長(zhǎng)和鹽鹵pH下降速度快,后期微生物數(shù)量降低，pH穩(wěn)定維持在較低水平,并表現(xiàn)出正常的發(fā)酵豇豆風(fēng)味和質(zhì)構(gòu);其他品種豇豆尤其是品種B豇豆在發(fā)酵后期微生物數(shù)量的增加和pH的上升,這三種發(fā)酵豇豆出現(xiàn)不同程度的軟腐,這可能與豇豆的品種以及PCWDEs微生物種類有關(guān)。

2.5 腐敗微生物產(chǎn)PCWDEs微生物種類分析

微生物產(chǎn)PCWDEs是導(dǎo)致蔬菜軟腐的重要原因之一[9],菌株的具體產(chǎn)酶情況見表4。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有45株產(chǎn)PCWDEs,其中品種A中的最少,有6株;品種B中的最多,有19株;品種C、D中分別有11株和9株。品種B中產(chǎn)PCWDEs的微生物及產(chǎn)酶種類最多,而品種A最少;實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋白酶與淀粉酶的菌株最多,產(chǎn)纖維素酶的最少;部分菌株同時(shí)產(chǎn)多種酶,如菌株B-1同時(shí)產(chǎn)淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶。

將表4中的菌株進(jìn)行16S rDNA及18S rDNA鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些菌株分屬于13個(gè)種,10個(gè)屬,進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,結(jié)果見圖4。對(duì)四種發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物種類進(jìn)行分析,結(jié)果見表5。

表4 腐敗發(fā)酵豇豆中顯著產(chǎn)酶菌株的篩選結(jié)果Table 4 Screening results of significant enzyme-producing strains in spoiled fermented cowpea

結(jié)合表5和圖4可知,產(chǎn)蛋白酶的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和產(chǎn)淀粉酶的異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)在4種發(fā)酵豇豆鹽鹵中均可檢測(cè)到。植物乳桿菌是泡菜發(fā)酵中常見的主要乳酸菌[23-24],但近年來已有研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可能參與了泡菜腐敗過程中的乳酸代謝[25-26]。本研究中,植物乳桿菌還可能通過產(chǎn)蛋白酶破壞發(fā)酵豇豆的質(zhì)構(gòu)。異常威克漢姆酵母是常見的產(chǎn)淀粉酶酵母菌[27],張騰[28]研究發(fā)現(xiàn)食鹽含量4%的泡菜真菌微生物的主要優(yōu)勢(shì)微生物為異常威克漢姆酵母。

圖4 部分細(xì)菌(a)和真菌(b)系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig.4 Phylogenetic tree of part of bacteria(a)and fungi(b)

表5 四種發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物的種類Table 5 Types of PCWDEs-producing microorganisms in four fermented cowpeas

品種B發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物數(shù)量和種類最多且產(chǎn)酶種類多樣,包括腸桿菌屬(Enterobacter)、弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、黃褐假單胞菌(P.fulva)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、成團(tuán)泛生菌(P.agglomerans)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)和類香味菌(M.odoratimimus)等。腸桿菌是發(fā)酵蔬菜中常見的腐敗菌,Franco等[26]在黃瓜二次發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌,Krishnan等[29]也在番木瓜果實(shí)里發(fā)現(xiàn)產(chǎn)淀粉酶、木聚糖等的腸桿菌。在以白菜為原料的腐敗泡菜中也發(fā)現(xiàn)了陰溝腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、弗氏檸檬酸桿、肺炎克雷伯氏菌和成團(tuán)泛生菌等[30]。品種B發(fā)酵豇豆在24 d時(shí)的嚴(yán)重軟腐與其產(chǎn)PCWDEs微生物的種類、數(shù)量多和產(chǎn)酶類型多樣有關(guān)。

僅在品種D發(fā)酵豇豆中發(fā)現(xiàn)解鳥氨酸拉烏爾菌(R.ornithinolytica),Rao等[30]在研究四川泡菜的腐敗過程中分離得到解鳥氨酸拉烏爾菌,Zogaj等[31]在研究人體腸道細(xì)菌時(shí)發(fā)現(xiàn)解鳥氨酸拉烏爾菌產(chǎn)纖維素酶。由表3知,豇豆品種C、品種D和品種A中的產(chǎn)PCWDEs微生物種類和數(shù)量相差不大,但品種C和品種D中的微生物產(chǎn)PCWDEs的種類更豐富,從質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果中也得出品種C、品種D的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)(圖3)好于品種B但又差于品種A。由此可見,發(fā)酵后期豇豆的軟腐與產(chǎn)PCWDEs微生物的種類和數(shù)量有關(guān)。

3 結(jié)論

不同品種豇豆在發(fā)酵過程中的pH、微生物群落及質(zhì)構(gòu)品質(zhì)變化均有差異。在24 d的發(fā)酵過程中,豇豆品種A發(fā)酵前期乳酸菌生長(zhǎng)和pH下降最迅速,發(fā)酵后期微生物群落和鹽鹵pH穩(wěn)定,且色澤新鮮、鹽鹵清亮,逐漸形成較濃的泡菜香氣,表現(xiàn)出較好的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。豇豆品種B、品種C和品種D發(fā)酵前期乳酸菌生長(zhǎng)以及pH下降速度較品種A慢,發(fā)酵后期,pH開始回升,總菌和真菌數(shù)量持續(xù)升高;品種B相比于品種A、品種C、品種D的硬度、彈性、咀嚼力降低得最快且最低,且在發(fā)酵第12 d時(shí)表現(xiàn)出顏色暗沉、鹽鹵表面有較厚膜醭出現(xiàn)等感官特征,其所表現(xiàn)出的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)也較差。

將不同品種發(fā)酵豇豆中產(chǎn)PCWDEs微生物分離鑒定后發(fā)現(xiàn),品種B產(chǎn)PCWDEs微生物的種類最豐富且數(shù)量最多。發(fā)酵過程中,四種不同品種的豇豆中均發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋白酶的植物乳桿菌和產(chǎn)淀粉酶的異常威克漢姆酵母產(chǎn)PCWDEs;此外在品種A、品種B和品種C中均檢測(cè)到腸桿菌屬產(chǎn)PCWDEs,如E.cloacae、E.aerogenes、E.faecium等;僅在品種D發(fā)酵豇豆中發(fā)現(xiàn)R.ornithinolytica產(chǎn)PCWDEs。結(jié)果表明發(fā)酵后期豇豆的軟腐與產(chǎn)PCWDEs微生物的種類和數(shù)量有關(guān)。