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    基于頂空氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)的冷凍豬肉貯藏時(shí)間快速判別方法

    2019-01-28 08:06:44田寒友李文采李家鵬陳文華喬曉玲
    食品科學(xué) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:豬肉樣品分析

    王 輝,田寒友,李文采,鄒 昊,劉 飛,白 京,李家鵬,陳文華,喬曉玲

    (中國(guó)肉類食品綜合研究中心,肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京食品科學(xué)研究院,北京 100068)

    冷凍貯藏是一種在一定貯藏時(shí)間內(nèi)維持豬肉良好品質(zhì)狀態(tài)的常規(guī)貯藏方法,可以最大程度地抑制和減緩與豬肉腐敗變質(zhì)相關(guān)的生理生化反應(yīng)。在長(zhǎng)時(shí)間冷凍貯藏過程中,蛋白質(zhì)氧化、脂肪氧化、微生物及冰晶的傳熱傳質(zhì)等因素導(dǎo)致的劣變效果疊加會(huì)大大降低冷凍豬肉的感官品質(zhì)、食用品質(zhì)及加工性能。加之近年來發(fā)生了多起“僵尸肉”和“過期肉”事件,導(dǎo)致企業(yè)和民眾對(duì)于冷凍豬肉貯藏時(shí)間的質(zhì)疑及其食用安全性的擔(dān)憂,如何判別冷凍豬肉的貯藏時(shí)間已成為亟待解決的課題。

    貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)不僅會(huì)導(dǎo)致冷凍豬肉品質(zhì)劣變及食用安全性下降,還會(huì)對(duì)交易價(jià)格造成較大的影響,因此國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)部委文件[1-5]對(duì)加工原料肉和應(yīng)急儲(chǔ)備肉都有明確的冷凍貯藏時(shí)間要求。通常情況下,個(gè)人食用的冷凍豬肉一般貯藏1 個(gè)月,而儲(chǔ)備冷凍豬肉的強(qiáng)制輪換期為6 個(gè)月[6],加工冷凍豬肉的保質(zhì)期為12 個(gè)月。在大宗冷凍豬肉原料交易過程中,貯藏時(shí)間的長(zhǎng)短主要是對(duì)肉色褐變、干耗、蛋白質(zhì)腐敗和脂肪酸敗產(chǎn)生的氣味等品質(zhì)劣變的程度進(jìn)行感官評(píng)定,或采用針對(duì)性較強(qiáng)的理化指標(biāo)檢測(cè)進(jìn)行判斷。對(duì)于劣變現(xiàn)象和指標(biāo)的評(píng)估是基于改變整塊冷凍豬肉凍結(jié)狀態(tài)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的,評(píng)判結(jié)果由于受到解凍和檢測(cè)過程中多重因素的影響,極易受到認(rèn)知水平和主觀差異性的影響而造成誤判,因此常規(guī)的感官評(píng)定和檢測(cè)方法無法滿足大宗交易和批量檢驗(yàn)對(duì)評(píng)估效果及效率的要求。通過對(duì)貯藏過程中導(dǎo)致冷凍豬肉品質(zhì)劣變的主因、劣變發(fā)生位置、劣變產(chǎn)生的特征性表征物質(zhì)及檢測(cè)方法繁簡(jiǎn)程度的分析,選擇冷凍豬肉表層或淺表層脂肪氧化所產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds,VOCs)作為氣味劣變的氣體分析項(xiàng)。與常規(guī)檢測(cè)方法相比,氣體分析具有無需改變樣品狀態(tài)、樣品耗損少、操作簡(jiǎn)單、分析快捷及數(shù)據(jù)解釋能力強(qiáng)等特點(diǎn)。通過VOCs種類和濃度的變化,可獲得不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉的脂肪氧化程度和VOCs組成特征等信息,并結(jié)合化學(xué)計(jì)量法進(jìn)行聚類分析以判別該分析結(jié)果是否符合對(duì)應(yīng)貯藏時(shí)間的數(shù)據(jù)特征?,F(xiàn)階段主流的氣體分析方法是氣相色譜-質(zhì)譜法,而該方法對(duì)于極性相近的物質(zhì)及同分異構(gòu)體分辨率較差,且對(duì)痕量物質(zhì)的靈敏度較低。在低溫條件下緩慢進(jìn)行的脂肪氧化所產(chǎn)生的VOCs會(huì)因此不足而導(dǎo)致分析數(shù)據(jù)的缺失或漏檢,由此導(dǎo)致對(duì)貯藏時(shí)間的誤判。

    近年,一種基于氣相色譜(gas chromatography,GC)和離子遷移譜(ion mobility spectrometry,IMS)的聯(lián)用技術(shù)逐漸應(yīng)用于食品研究,該項(xiàng)技術(shù)通過整合二者在分離和檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì),形成具有高分辨率、高靈敏度、分析高效、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)的氣體快檢技術(shù)。此前GC-IMS技術(shù)主要應(yīng)用于對(duì)爆炸物[7]、毒品[8]、化學(xué)戰(zhàn)劑[9]、石化產(chǎn)品[10]、環(huán)境質(zhì)量[11]及人體健康[12]等方面的檢測(cè)、分析和預(yù)警,近些年才逐漸開展在食品上的應(yīng)用研究,國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)較少且主要集中于酒[13]、茶葉[14]、植物油[15-17]及摻假[18-19]等方面,且鮮見在鮮凍肉品上應(yīng)用的報(bào)道。

    本研究以冷凍豬IV號(hào)肉為實(shí)驗(yàn)原料,以冷凍豬肉的個(gè)人消費(fèi)周期、儲(chǔ)備輪換周期及加工保質(zhì)期為檢測(cè)時(shí)間節(jié)點(diǎn),采用頂空GC-IMS(headspace-GC-IMS,HS-GCIMS)對(duì)冷凍豬肉在不同貯藏時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的VOCs進(jìn)行采集和分析,利用化學(xué)計(jì)量法處理數(shù)據(jù)后進(jìn)行聚類分析,使用已知貯藏時(shí)間的樣品進(jìn)行性能驗(yàn)證,并以數(shù)據(jù)可視化形式顯示該方法的判別效果,為該項(xiàng)快檢技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    實(shí)驗(yàn)原料為新鮮宰殺并速凍后的冷凍豬IV號(hào)肉(由塑料包裝膜緊密包裹),購(gòu)自北京中瑞食品有限公司,存儲(chǔ)于同一間-18℃冷庫(kù)。所有分離用有機(jī)溶劑、滴定標(biāo)準(zhǔn)液及指示劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    FlavourSpec?食品風(fēng)味分析與質(zhì)量控制系統(tǒng)(配有CTC自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件及Library Search定性軟件的GC-IMS系統(tǒng)) 德國(guó)G.A.S公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品采集及處理

    檢測(cè)時(shí)間設(shè)置為0、1、6、12 個(gè)月,HS-GC-IMS的取樣方法為實(shí)驗(yàn)時(shí)從與包裝膜緊密貼合的冷凍豬肉表層不同位置處刮取肉樣共計(jì)5 g,裝入進(jìn)樣瓶中備檢。每次取3 份樣品用于3 項(xiàng)指標(biāo)和HS-GC-IMS分析。

    1.3.2 揮發(fā)性鹽基氮的檢測(cè)

    根據(jù)GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[20]進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3.3 酸價(jià)的檢測(cè)

    根據(jù)GB 5009.229—2016《食品中酸價(jià)的測(cè)定》[21]進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3.4 過氧化值的檢測(cè)

    根據(jù)GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測(cè)定》[22]進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3.5 HS-GC-IMS分析

    1.3.5.1 自動(dòng)進(jìn)樣器條件

    孵化溫度55 ℃;孵化時(shí)間5 min;進(jìn)樣方式為頂空進(jìn)樣;加熱方式為振蕩加熱;振蕩速率500 r/min;進(jìn)樣針溫度85 ℃;進(jìn)樣量500 μL,不分流;清洗時(shí)間0.5 min。

    1.3.5.2 GC條件

    FS-SE-54-CB-0.5石英毛細(xì)管柱(15 m×0.53 mm,0.5 μm);色譜柱溫度40 ℃;載氣為N2(純度≥99.999%);載氣流速程序:初始流速2.0 mL/min,3 min內(nèi)線性升至17.0 mL/min,5 min內(nèi)線性升至100.0 mL/min,保持7 min;運(yùn)行時(shí)間15 min。

    1.3.5.3 IMS條件

    漂移管長(zhǎng)度98 mm;管內(nèi)線性電壓500 V/cm;漂移管溫度45 ℃;漂移氣為N2(純度≥99.999%);漂移氣流速150 mL/min;放射源:β射線(氚,3H);離子化模式:正離子。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用設(shè)備自帶Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件及Library Search定性軟件對(duì)冷凍豬肉中的VOCs進(jìn)行采集和分析,并采用Matlab R2014a進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)及K均值聚類分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 貯藏過程中冷凍豬肉的品質(zhì)變化

    圖1 貯藏過程中冷凍豬肉揮發(fā)性鹽基氮、酸價(jià)及過氧化值變化情況Fig.1 Changes in TVB-N content, AV and POV of pork during frozen storage

    通常情況下,對(duì)于冷凍豬肉的品質(zhì)變化主要采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的揮發(fā)性鹽基氮法來檢驗(yàn),并以酸價(jià)及過氧化值輔助評(píng)估[23],由此判斷冷凍豬肉的蛋白質(zhì)腐敗[20]和脂肪酸敗[24]程度。如圖1所示,揮發(fā)性鹽基氮、酸價(jià)、過氧化值的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.981 6、0.842 2、0.785 5,均與貯藏時(shí)間有相對(duì)較好的相關(guān)性。揮發(fā)性鹽基氮、酸價(jià)和過氧化值均可在一定程度上作為表征品質(zhì)劣變[23,25]的指標(biāo)來判斷冷凍豬肉的貯藏時(shí)間,但在實(shí)際操作過程中,環(huán)境因素和人為因素對(duì)冷凍豬肉的解凍、粉碎、檢測(cè)目標(biāo)物提取及滴定分析等環(huán)節(jié)的影響會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)值發(fā)生不同程度的偏差,因此樣品狀態(tài)變化、操作步驟繁瑣、前處理和檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)人員技術(shù)要求高等缺陷限制了以上3 個(gè)指標(biāo)在批量冷凍豬肉交易和檢測(cè)中的應(yīng)用。

    2.2 不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉的HS-GC-IMS分析

    隨著速凍技術(shù)、低溫恒濕貯藏技術(shù)和復(fù)合包裝技術(shù)在冷凍貯藏中的應(yīng)用,溫度和濕度波動(dòng)導(dǎo)致冰晶以水蒸氣的形式在冷凍豬肉表面與環(huán)境之間發(fā)生的傳熱傳質(zhì)過程,受到具有阻水阻氣特性的外包裝膜和外包裝箱構(gòu)成的內(nèi)環(huán)境的緩沖保護(hù),冰晶升華現(xiàn)象減弱,使干耗現(xiàn)象導(dǎo)致的多孔脫水活化層向肉品內(nèi)部移動(dòng)的趨勢(shì)受到抑制,因此作為品質(zhì)劣變主因的脂肪氧化主要作用于冷凍豬肉的表層或淺表層[26-27]。HS-GC-IMS分析時(shí),以凍結(jié)狀態(tài)提取樣品表層或淺表層組織進(jìn)行頂空進(jìn)樣,最大程度地保護(hù)脂肪氧化產(chǎn)生的VOCs組分特征,避免樣品中易揮發(fā)物質(zhì)由于外界溫度波動(dòng)而導(dǎo)致的損失,確保分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

    圖2 不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉的HS-GC-IMS譜圖(a)和三維譜圖(b)比較Fig.2 Comparison of 3D HS-GC-IMS spectra of frozen pork at different storage times

    圖2a中縱坐標(biāo)為GC分離時(shí)VOCs的保留時(shí)間,橫坐標(biāo)為IMS分離時(shí)VOCs相對(duì)于反應(yīng)離子峰的漂移時(shí)間。圖2b中第三維坐標(biāo)為VOCs在IMS中的離子峰強(qiáng)度。HS-GCIMS根據(jù)樣品中復(fù)雜VOCs組分與色譜柱固定相之間作用力強(qiáng)弱進(jìn)行初步GC分離,不同保留時(shí)間流出的組分以氣態(tài)分子的形式被離子源軟電離后形成分子離子群,由于組分離子在質(zhì)量、碰撞截面和電荷數(shù)等因素上的差異,在環(huán)境氣壓下由周期性離子脈沖驅(qū)動(dòng)先后進(jìn)入線性漂移電場(chǎng)并獲得不同的遷移速率并進(jìn)行二次分離,通過獲取離子漂移時(shí)間和離子峰強(qiáng)度可分別對(duì)各組分進(jìn)行定性和定量分析。從圖2可看出,由于沒有豬肉熱加工時(shí)所呈現(xiàn)的復(fù)雜風(fēng)味物質(zhì)體系,冷凍豬肉中VOCs在600 s內(nèi)完成GC分離,30 ms內(nèi)完成IMS分離且分離度較高,圖2a中A框和B框內(nèi)GC分離時(shí)保留時(shí)間較近的物質(zhì)在IMS中較好地分離。

    由圖2可以看出,不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉VOCs的差異主要表現(xiàn)在離子峰的位置、數(shù)量、強(qiáng)度及時(shí)間上。從圖2a中C、D、E、F、G方框中明顯地看出具有相同保留時(shí)間和漂移時(shí)間的VOCs,其斑點(diǎn)的有無和顏色的深淺,表示物質(zhì)的積累和分解程度,由此可看出不同貯藏時(shí)間的冷凍豬肉由于氧化程度的不同,VOCs的種類和濃度也隨之變化。在冷凍貯藏過程中,脂肪的自動(dòng)氧化和光氧化并不因?yàn)榈蜏囟V?,而是緩慢并持續(xù)地進(jìn)行鏈?zhǔn)椒磻?yīng)直到自由基相互碰撞產(chǎn)生惰性聚合體,在此過程中產(chǎn)生的氫過氧化物不斷裂解成醛、酮、酸、酯及醇類等小分子揮發(fā)性有機(jī)物,隨著濃度的不斷增大最終導(dǎo)致酸敗味的產(chǎn)生,因此可通過VOCs的種類增減和相對(duì)應(yīng)物質(zhì)的濃度變化來判斷冷凍豬肉的貯藏時(shí)間。

    2.3 冷凍豬肉中VOCs的變化分析

    圖3 不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉HS-GC-IMS譜圖中VOCs的圖庫(kù)Fig.3 Gallery pattern of VOCs in HS-GC-IMS spectra of frozen pork at different storage times

    圖3 為FlavourSpec?系統(tǒng)自帶LAV軟件內(nèi)置的Gallery Plot插件篩選出的具有明顯變化規(guī)律的29 種VOCs的離子峰圖庫(kù)。從圖3中VOCs的離子峰排列可明顯看出,相同貯藏時(shí)間的冷凍豬肉含有共有VOCs,僅區(qū)別于濃度,樣品組內(nèi)具有明顯的相似性,不同貯藏時(shí)間的冷凍豬肉含有對(duì)應(yīng)時(shí)間內(nèi)所特有的VOCs,樣品組間則呈現(xiàn)出明顯的差異性。根據(jù)各樣品的VOCs種類和濃度進(jìn)行相似度分析,見表1,組內(nèi)相似度均高于90%,組間相似度則較低,說明冷凍貯藏時(shí)間越長(zhǎng),脂肪氧化程度越嚴(yán)重,組間相似度差異越大,對(duì)照組與凍貯12 個(gè)月的豬肉相似度只有60%。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),冷凍豬肉在A框中的VOCs含量主要呈現(xiàn)遞減趨勢(shì),而B框中的則主要呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),其中B框中的14、15號(hào)及16號(hào)物質(zhì)從凍貯6 個(gè)月時(shí)才開始出現(xiàn),體現(xiàn)在圖2a中C、D方框中斑點(diǎn)的出現(xiàn),這可能是由于脂肪氧化程度不斷加劇,冷凍豬肉原有VOCs通過氧化過程中不斷與氫過氧化物、氫過氧化物的次級(jí)產(chǎn)物、脂肪氧化系統(tǒng)中的活性氧自由基、非血紅素鐵氧化系統(tǒng)中的高活性羥自由基或肌紅蛋白氧化系統(tǒng)中的超鐵肌紅蛋白自由基發(fā)生反應(yīng)而生成其他種類的VOCs[28-31],由此也造成圖3 A框中VOCs含量降低和B框中VOCs含量增加。

    表1 不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉的相似度分析Table1 Similarity analysis of frozen pork at different storage times

    2.4 PCA結(jié)果

    根據(jù)圖3中不同種類VOCs的種類排序及離子峰強(qiáng)度可大致判斷冷凍豬肉所處的貯藏時(shí)間,但GC-IMS的二維和三維數(shù)據(jù)圖形化表達(dá)(圖2)對(duì)于貯藏時(shí)間的判斷仍受到觀測(cè)者主觀認(rèn)知的影響。通過對(duì)以VOCs種類為變量的高維數(shù)組進(jìn)行維度壓縮,去除冗余信息和空間噪聲,用少量線性無關(guān)的綜合變量替代原有變量,并投影至較低維度的平面上,可便于對(duì)不同貯藏時(shí)間的冷凍豬肉進(jìn)行特征差異的可視化分析。由圖4可知,主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率之和大于85%,數(shù)據(jù)降維后所得綜合變量在二維空間即可表達(dá)原有變量的絕大部分信息。通過二維空間的數(shù)據(jù)分布差異可以直觀地觀察到組間和組內(nèi)樣品間的差異性,組內(nèi)各樣品相對(duì)集中于一定范圍內(nèi),并與其他各組數(shù)據(jù)的成簇區(qū)域有明顯的間距,這說明貯藏時(shí)間相同的樣品重復(fù)性較好,不同貯藏時(shí)間的樣品特異性較明顯。

    圖4 不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉的PCAFig.4 PCA of frozen pork at different storage times

    2.5 K均值聚類分析

    圖5 不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉的K均值聚類分析Fig.5 K-means clustering analysis of frozen pork at different storage times

    將經(jīng)PCA處理后的數(shù)據(jù)應(yīng)用于聚類分析,并用已知貯藏時(shí)間的冷凍豬肉作為檢驗(yàn)樣品,檢驗(yàn)其歸類效果。由于在各貯藏時(shí)間段采樣數(shù)量較少,因此采用K均值聚類算法進(jìn)行分析,該方法簡(jiǎn)單高效,時(shí)間復(fù)雜度近于線性,收斂速度較快。參與聚類分析的冷凍豬肉樣品的貯藏時(shí)間分別為0、1、6 個(gè)月及12 個(gè)月,因此設(shè)置簇?cái)?shù)量K為4,采用樣品與質(zhì)心的平方歐氏距離最小作為樣品歸類的度量標(biāo)準(zhǔn),并使用K均值++算法為每個(gè)簇設(shè)置初始質(zhì)心,如圖5所示。本聚類算法的運(yùn)算原理為,檢驗(yàn)樣品集與第1個(gè)時(shí)間簇進(jìn)行距離度量后剔除歸類樣品,剩余的樣品再與第2個(gè)時(shí)間簇進(jìn)行距離度量,剔除歸類樣品,以此類推,如果所剩樣品與各簇質(zhì)心的平方歐式距離均不滿足默認(rèn)最小距離時(shí),則將該樣品作為異常樣品單獨(dú)歸為一簇,避免誤判。使用4 份未參加聚類建模的冷凍豬肉作為檢驗(yàn)樣品,貯藏時(shí)間分別0、1、6 個(gè)月及12 個(gè)月。圖5中無填充色表示的檢驗(yàn)樣品(T1~T4),相同形狀表示檢驗(yàn)樣品與建模樣品屬于相同時(shí)間簇,可見根據(jù)已知貯藏時(shí)間樣品所構(gòu)建的聚類判別模型可有效對(duì)相同貯藏時(shí)間的樣品進(jìn)行歸類。因此,使用此方法可對(duì)冷凍豬肉的貯藏時(shí)間是否符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)部門文件規(guī)定進(jìn)行判別。

    3 結(jié) 論

    本研究分析在大宗交易和批量檢測(cè)過程中不宜采用常規(guī)理化指標(biāo)判別貯藏時(shí)間的原因,并根據(jù)對(duì)冷凍豬肉在貯藏過程中發(fā)生品質(zhì)劣變的主因、冷凍豬肉受影響的位置、表征劣變的物質(zhì)及檢測(cè)方法便捷程度的分析,提出一種基于HS-GC-IMS技術(shù)的快速判別方法。該方法通過獲取不同貯藏時(shí)間內(nèi)冷凍豬肉表層脂肪氧化產(chǎn)生的VOCs組成特征,并利用PCA降維處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行K均值聚類分析,以判別樣品是否符合已知貯藏時(shí)間冷凍豬肉所特有的數(shù)據(jù)特征,結(jié)果表明不同貯藏時(shí)間的樣品歸類效果良好。

    冷凍豬肉在企業(yè)冷庫(kù)中貯藏時(shí),由于人為因素和不可預(yù)見因素,如移庫(kù)、出貨、停電等,冷庫(kù)中的溫度和濕度波動(dòng)較大且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),冷凍豬肉的VOCs特征會(huì)偏離正常貯藏時(shí)所具備特征。因此,后期的主要工作是,分析正常冷凍貯藏條件下與溫濕度波動(dòng)條件下,不同貯藏時(shí)間冷凍豬肉的脂肪氧化所導(dǎo)致的VOCs種類差異和變化規(guī)律,并建立二者的關(guān)系校正模型以避免對(duì)貯藏時(shí)間判別分析時(shí)造成誤判。

    此外,通過設(shè)置多個(gè)檢測(cè)時(shí)間節(jié)點(diǎn),獲取線性貯藏時(shí)間內(nèi)冷凍豬肉VOCs的組分信息并增加采樣數(shù)量,不僅可以增強(qiáng)判別模型的容變性和穩(wěn)健性,還可由此建立判別冷凍豬肉品質(zhì)等級(jí)的數(shù)據(jù)庫(kù),為大宗冷凍豬肉交易的價(jià)格制定及貯藏時(shí)間的真?zhèn)闻卸ㄌ峁├碚撘罁?jù)和數(shù)據(jù)支持。

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