屠宰豬中大腸桿菌毒力基因檢測及耐藥性分析

周陸紅，張鵬飛，張 杰，吳聰明，唐曉雙，郝 丹，王 新,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

大腸桿菌（Escherichia coli）是存在于人和動物腸道的一種常見桿狀細菌，屬于條件致病菌，少數(shù)獲得特殊毒力因子的大腸桿菌可引起人畜共患病，因此其也是食品中重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌[1]。大腸桿菌依其致病機制可分為3 類：共生型、腸內(nèi)致病型和腸外致病型，其中致病型大腸桿菌不僅對人體健康造成極大威脅，同時會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[2]。豬大腸桿菌病中最常見的是仔豬黃痢、仔豬白痢及水腫病，但近幾年國外的研究中相繼報道了腸外致病性大腸桿菌（extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC），其可嚴(yán)重致病，致使不同宿主發(fā)生腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染[3-5]。同時，由于在生產(chǎn)過程中抗生素的大量、不合理的使用，使得豬源大腸桿菌的耐藥種類逐漸增多，多重耐藥現(xiàn)象也愈加嚴(yán)重?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實，耐藥菌株可以通過食品在人與動物中轉(zhuǎn)移，質(zhì)粒等可移動元件還可以介導(dǎo)耐藥基因轉(zhuǎn)移[6-8]。

因此，本研究從3 個省市采集的樣品中分離鑒定出大腸桿菌，對其進行毒力因子檢測、種群分型及藥敏實驗，同時得出腸外致病型大腸桿菌比例，從而為揭示大腸桿菌的致病機理提供依據(jù)，并通過其耐藥性的檢測來評估屠宰豬中大腸桿菌的耐藥流行情況，并為其合理用藥提供依據(jù)，從而保障公共健康安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

緩沖蛋白胨水、伊紅美蘭瓊脂、麥康凱瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂、IMViC實驗試劑 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；抗生素 美國Sigma公司；Taq酶、Mg2+Buffer、dNTP大連寶生物（TaKaRa）公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；藥敏實驗所用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922和ATCC 25923由中國食品藥品檢定研究院崔生輝博士惠贈。

1.2 儀器與設(shè)備

NU-425-400E超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Mycircle聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀、GEL DOC XR凝膠成像系統(tǒng) 美國伯樂公司；Milli-Q Synthesis超純水機德國Merck Millipore公司；微量移液槍 德國艾本德股份公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；MDF-U5411高壓滅菌鍋 上海申安高壓儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的分離鑒定

樣品來源于陜西、重慶以及河南的豬屠宰場，采用無菌棉簽擦拭豬的腸外組織（肺、心血、脾等），每只豬選取1～3 個器官部位采樣。采集好的棉拭子裝入無菌采樣袋中，將樣本放入裝有冰袋的采樣箱中，隨后直接運往西北農(nóng)林科技大學(xué)進行大腸桿菌的分離鑒定。樣品的分離鑒定參照Wang Xin等[9]方法，棉拭子在裝有5 mL緩沖蛋白胨水肉湯的無菌試管中于37 ℃培養(yǎng)18～24 h。從增菌液中劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，在37 ℃培養(yǎng)18～24 h，隨后挑取1 個或2 個疑似菌株劃線于伊紅美蘭瓊脂平板進一步純化鑒定，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，選取紫黑色帶金屬光澤的單菌落繼續(xù)在LB平板上進行純化。隨后進行IMViC實驗，結(jié)果“++――”者認定為大腸桿菌。分離出的菌株進行PCR擴增uidA基因鑒定，并將鑒定出的菌株在凍存管中于－80 ℃保存。

1.3.2 毒力基因測定

本實驗采用Johnson等[10]研究中使用的5 種毒力基因：sfa/foc（S和F1C菌毛），papA和papC（P菌毛），iutA（螯鐵蛋白受體），afa/dra（Dr抗原結(jié)合位點）和kpsMT II（II型莢膜多糖），進行毒力因子的檢測。以上5 種毒力基因中可鑒定出2 種及以上，則可定義為ExPEC。本研究中所用的引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table1 Primer sequences used for PCR

1.3.3 種群分型

Clermont等[11]研究建立了一種新型種群分型方法，便捷快速。即采用PCR方法擴增可以區(qū)分不同種群大腸桿菌的3 個基因：chuA、yjaA和TspE4.C2。菌株chuA和TspE4.C2基因擴增結(jié)果均為陰性稱為A群系，chuA擴增結(jié)果陰性而TspE4.C2陽性稱為B1群系，chuA和yjaA均是陽性稱為B2群系，chuA陽性而yjaA陰性稱為D群系。而據(jù)其基因擴增結(jié)果，可將大腸桿菌分為A、B1、B2和D群系。

1.3.4 藥敏性實驗

參照臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所推薦的瓊脂稀釋法執(zhí)行抗生素的藥敏性實驗，本研究選取常用的12 種抗生素，如表2所示。每次實驗用標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌ATCC 25922進行質(zhì)控。

表2 藥敏測定用抗生素及耐藥折點Table2 Antibiotics and breakpoints of resistance

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)導(dǎo)入與圖像處理，SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒力基因鑒定結(jié)果

從屠宰豬中共分離鑒定出77 株大腸桿菌，53 株來自陜西，16 株來自重慶，8 株來自河南。其中基因iutA的檢出率最高為40.26%（31/77），而sfa/foc檢出率僅為1.30%（1/77），papA和afa/dra檢出率均為3.90%（3/77），kpsMT II檢出率為11.69%（9/77），另外有49.36%（38/77）未能檢出。本研究選取的5 種毒力基因如圖1所示。77 株大腸桿菌中檢測到含以上毒力因子超過2 種的菌株共有9 株，因此本研究中ExPEC分離率為11.69%（9/77）。

圖1 毒力基因測定結(jié)果Fig.1 Detection rates of virulence genes

2.2 種群分型

77 株大腸桿菌可根據(jù)PCR擴增結(jié)果，將其分為4 種群系。其中A群系所占比例為77.92%（60/77），B1群系所占比例為5.19%（4/77），B2群系所占比例為12.99%（10/77），D群系所占比例為3.90%（3/77）。ExPEC中有66.67%（6/9）屬于A群系，22.22%（2/9）屬于B2群系，11.11%（1/9）屬于D群系，B1群系中無ExPEC。本實驗分離所得的77 株大腸桿菌的優(yōu)勢群系為A群系，同時A群系也是9 株ExPEC中的優(yōu)勢群系，見表3。表4結(jié)果表明，kspMT II與B2群系有相關(guān)性（P＜0.05），50%的B2群系菌株中含有kspMT II基因。

表3 大腸桿菌中的種群分型Table3 Phylogenetic groups from 77 E. coli isolates

表4 大腸桿菌種群分型與毒力基因的關(guān)系Table4 Distribution of virulence factors in phylogenetic groups from 77 E. coli isolates

2.3 藥敏實驗結(jié)果

2.3.1 菌株的耐藥率

圖2 大腸桿菌耐藥情況Fig.2 Antibiotic resistance rate of 77 E. coli isolates

如圖2所示，不同地區(qū)大腸桿菌耐藥性不同，其中，陜西省來源的菌株對四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲二唑的耐藥率較高，都為92.5%，對頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢哌酮的耐藥率較低，分別為1.9%、3.8%、17.0%；重慶市來源的菌株對四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲二唑、氨芐西林的耐藥率較高，分別為87.5%、93.8%和93.8%，對阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松、頭孢西丁、頭孢哌酮的敏感率均為100%，河南省來源的菌株對甲氧芐啶/磺胺甲二唑、氨芐西林、氯霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率較高，分別為100%、87.5%、87.5%、87.5%，對阿莫西林/克拉維酸、頭孢曲松的敏感率均為100%。

2.3.2 菌株的多重耐藥性

實驗結(jié)果表明3 個地區(qū)屠宰場中分離出的77 株大腸桿菌分離株耐藥情況較為嚴(yán)重，大多數(shù)菌株耐3～9 種藥（70 株，90.91%），最高可對11 種抗生素耐藥（1 株，1.30%），此菌株分離自陜西省的屠宰場。另外還分離出了1 株不耐本實驗中選取的12 種抗生素的菌株，此菌株也分離自陜西省的屠宰場。其中，對6 種抗生素耐藥的菌株最多，有17 株（22.08%），其次為耐5 種抗生素的菌株（15 株，19.48%），耐7 種抗生素（10 株，13.00%），耐8 種抗生素（9 株，11.69%），耐4 種抗生素（8 株，10.39%），耐9 種抗生素（6 株，7.79%），耐3 種抗生素（5 株，6.50%），耐10 種抗生素（2 株，2.60%），耐1 種抗生素（2 株，2.60%），耐2 種抗生素（1 株，1.30%）。本實驗中共得出45 種耐藥譜，主要耐藥譜是四環(huán)素+卡那霉素+氨芐西林+慶大霉素+氯霉素+甲氧芐啶/磺胺甲二唑+阿米卡星（7 株，9.10%），圖3為菌株的多重耐藥結(jié)果。

圖3 77 株大腸桿菌的多重耐藥情況Fig.3 Multidrug resistance of 77 E. coli isolates

3 討論與結(jié)論

3.1 毒力因子及ExPEC分離率

本研究分離出的77 株菌株中，毒力基因的檢出率并不高，有49.36%未能檢出本研究選取的5 種毒力基因，其中基因iutA的檢出率最高。這與Jakobsen等[12]的研究一致，其毒力基因的檢測結(jié)果為kpsMT II 9%，iutA 41%，papA 6%，sfa/foc 2%，但未檢出afa/dra基因。同時本實驗中ExPEC分離率為11.69%，與Xia Xiaodong等[13]研究中豬肉ExPEC分離率8.3%相比略高，這可能是由于地區(qū)差異。但同時低于徐引弟等[14]研究中的分離率32.68%（149/456），這可能是由于采樣地點及選材不同，參考文獻中是對發(fā)生豬高熱綜合征豬場中的病料采樣。

3.2 種群分型

在4 種群系中，本實驗分離所得的77 株菌株的優(yōu)勢群系是A群系，其次是B2群系。ExPEC分離株中的優(yōu)勢群系也是A群系。之前的相關(guān)研究結(jié)果[13,15-18]顯示，對人具有致病性的ExPEC主要來自B2群系，其次是D群系；而豬源ExPEC的優(yōu)勢群系為A和B1，其次為B2和D；另外兩種大腸桿菌，共生型和腸內(nèi)致病型優(yōu)勢群系是A和B1。這與本實驗結(jié)果中ExPEC優(yōu)勢群系是A群系的結(jié)果相符，但在此次結(jié)果中B1群系未在ExPEC中分離出，這可能是由于地理區(qū)域不同或者由于樣本數(shù)目問題。同時，有研究報道[19]，A和B1群系毒力較弱，屬于宿主依賴性致病，當(dāng)宿主免疫力低下會引發(fā)散發(fā)感染，相較于B2和D群系，A和B1群系中呈現(xiàn)毒力基因較少的現(xiàn)象。另有研究發(fā)現(xiàn)，多重耐藥性的大腸桿菌中多數(shù)（68.5%）屬于A和B1群系[20]，B1群系的菌株在另一研究中發(fā)現(xiàn)其致病性最強[21]，因此需要重視其A和B1群系對于公共健康的影響。同時實驗結(jié)果表明，kspMT II與B2群系有相關(guān)性，這與Xia Xiaodong等[13]的研究一致。

3.3 耐藥性

藥敏實驗結(jié)果顯示，雖然各地區(qū)具體的耐藥情況不同，但總體看來，菌株對四環(huán)素（89.61%）、甲氧芐啶/磺胺甲二唑（93.51%）及氯霉素（75.32%）的耐藥率較高。三省市的菌株耐藥現(xiàn)象并沒有明顯的地域差異，說明大腸桿菌的多重耐藥性現(xiàn)象是普遍存在的。菌株對頭孢類耐藥率較低，重慶和河南分離出的菌株對頭孢曲松的敏感率均為100%。這與之前的研究一致：岳秀英等[22]研究表明，豬源大腸桿菌對四環(huán)素（92.32%）、氨芐西林（91.25%）耐藥率較高；徐引弟等[14]的研究結(jié)果顯示，其實驗室分離出的菌株絕大多數(shù)對頭孢類藥物敏感，而對四環(huán)素、氯霉素及慶大霉素耐藥率較高。這可能是由于頭孢類抗生素價格較貴，臨床使用較少，因此抗菌效果較理想。本實驗結(jié)果與代鵬飛等[23]對于動物源性大腸桿菌耐藥性的檢測結(jié)果相一致，研究顯示，對青霉素類、四環(huán)素類、氯霉素類等耐藥率均高于70%。耐藥率高的幾類藥物由于價格等原因易獲得，加之抗菌譜廣的原因在畜產(chǎn)品的養(yǎng)殖生產(chǎn)過程廣泛被推廣，從而隨著時間延長耐藥率升高。本實驗與曾博等[24]的研究中，對環(huán)丙沙星耐藥率（62.00%）、對慶大霉素耐藥率（40.30%）及對阿米卡星耐藥率（32.90%）的結(jié)果略微偏高，可能是由于地區(qū)及環(huán)境不同，或者使用藥物頻率不同而引起。此外，本實驗中多重耐藥情況較為嚴(yán)重，大多數(shù)菌株耐3～9 種藥（70 株，90.91%），最高可對11 種抗生素耐藥（1 株，1.30%），對6 種抗生素耐藥的菌株最多，有17 株（22.08%）。鄒立扣等[25]對2010年四川省豬肉源大腸桿菌進行17 種抗生素耐藥性實驗分析，結(jié)果顯示耐3 種及3 種以上抗生素的菌株占44.05%，低于本實驗結(jié)果。這可能由于地域不同以及隨著時間延長大腸桿菌耐藥性增強。張璇[26]選取14 種抗生素對豬源ExPEC菌株進行實驗，結(jié)果有95.2%的菌株耐受5 種以上的藥物，60.6%耐受10 種以上藥物，還有1.9%甚至耐受所有測試抗生素。岳秀英等[22]對于15 種動物源大腸桿菌進行了15 種抗生素的耐受測試，豬源大腸桿菌多重耐藥率占96.52%，其中耐受12 種抗生素的菌株最多。這也表明了大腸桿菌耐藥性之廣。

目前，豬源致病性大腸桿菌的研究主要集中在腸道型致病菌方面，主要引起腸道性疾病，如常見的仔豬黃痢、仔豬白痢及水腫病。但近幾年，有數(shù)據(jù)顯示ExPEC對人類和動物造成的病理變化無差別、對宿主的選擇也無特異性[27-28]，這說明動物可能是人類感染ExPEC的儲存庫，且極有可能是通過食物鏈進入人體，這應(yīng)該引起重視。另外由于抗生素大量或不合理使用加劇了菌株的耐藥現(xiàn)象，加之由于質(zhì)粒等可移動元件（如攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒）的水平轉(zhuǎn)移[29]，其毒力基因和耐藥基因可以進行重組，使得目前菌株的致病力及耐藥狀況愈加嚴(yán)重[30]。因此更加應(yīng)該注意抗生素的合理利用，以此來指導(dǎo)養(yǎng)殖業(yè)的合理用藥，減少經(jīng)濟損失，并保障公共健康，以防獲得耐藥性的菌株通過食物鏈進入人體造成危害。