不同酶水解對(duì)乳脂揮發(fā)性化合物的影響

李 揚(yáng)，李 妍，王筠鈉，張列兵,

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048）

牛乳脂肪是乳制品的重要組成部分，除給予機(jī)體熱量外，還對(duì)食物感官特性有不可忽視的作用。乳脂含量高的乳制品具有更濃郁的香氣和醇厚的口感[1]。另一方面，脂肪的過(guò)度攝入會(huì)增加肥胖、冠心病、高血壓等疾病的發(fā)病率。因此，脫脂或低脂食品受到了這些特定人群的關(guān)注。但因?yàn)榈椭蛎撝称凤L(fēng)味較全脂食品差，口感單薄，在一定程度上制約其推廣。

脂肪酶（EC3.1.1.3）是水解酶類(lèi)的一種，主要水解乳脂甘油三酯的酯鍵[2]，水解作用發(fā)生在水油界面上。當(dāng)體系中無(wú)水油界面時(shí)，角質(zhì)酶（EC3.1.1.74）可以發(fā)揮水解乳脂的作用[3]。水解乳脂產(chǎn)生的游離脂肪酸，尤其是短鏈脂肪酸是稀奶油[4]、黃油[5]、酸黃油[6]、奶酪[7]等乳制品的一類(lèi)重要風(fēng)味化合物。通過(guò)水解作用使乳脂中的風(fēng)味化合物釋放，可在一定程度上改善乳脂風(fēng)味。水解產(chǎn)物可直接添加或經(jīng)過(guò)加工制備成天然奶味香精后添加于許多食品中，改善食品風(fēng)味。國(guó)內(nèi)外已有較多相關(guān)研究，Hiroshi[8]利用脂肪酶與脂肪氧合酶共同作用于無(wú)水黃油，制備黃油風(fēng)味香精。

不同酶的底物特異性不同，作用于乳脂后產(chǎn)生的游離脂肪酸種類(lèi)及數(shù)量也不同，因此水解后乳脂的感官特性也會(huì)有一定差異[9-11]。水解率較低時(shí)乳脂產(chǎn)品風(fēng)味更為飽滿(mǎn)；當(dāng)水解率較高時(shí)可給予乳脂黃油味、奶油味或奶酪味[12]。本研究采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)乳脂水解前后揮發(fā)性化合物組成，分析2 種脂肪酶、2 種角質(zhì)酶對(duì)3 種乳脂水解的影響，旨在為乳脂酶解增香技術(shù)提供更多的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)鹽黃油A（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)82.1%）、稀奶油（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%）產(chǎn)地歐洲；無(wú)鹽黃油B（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)82.9%）產(chǎn)地澳洲；所有乳脂樣品為市售產(chǎn)品。

脂肪酶D活力4 921 U/g，最適溫度40 ℃，最適pH 6.0，內(nèi)生根毛霉來(lái)源；脂肪酶E活力4 513 U/g，最適溫度25 ℃，最適pH 7.5，內(nèi)生根毛霉來(lái)源；角質(zhì)酶F活力6 125 U/g，最適溫度45 ℃，最適pH 8.0，樟榮枝霉來(lái)源；角質(zhì)酶G活力45 368 U/g，最適溫度50 ℃，最適pH 8.0，太瑞斯梭孢殼霉來(lái)源。脂肪酶與角質(zhì)酶由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有NIST數(shù)據(jù)庫(kù)）、AOC-5000自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳脂的水解

1.3.1.1 反應(yīng)底物的配制

于50 mL具塞三角瓶中加入14 g底物，分別加入pH 6.0、7.5、8.0的0.02 mol/L的磷酸鈉緩沖液1 g，配制3 種不同pH值底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.3%的溶液。于50 mL具塞三角瓶中加入7.5 g乳脂，分別加入pH 6.0、7.5、8.0的0.02 mol/L的磷酸鈉緩沖液7.5 g，配制3 種不同pH值的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%溶液。

1.3.1.2 乳脂的水解反應(yīng)

于pH 6.0的底物體系中加入100 U/g脂肪酶D，40 ℃進(jìn)行水解反應(yīng)；于pH 7.5的底物體系中加入100 U/g脂肪酶F，25 ℃進(jìn)行水解反應(yīng)；于pH 8.0的底物體系中加入100 U/g角質(zhì)酶F，45 ℃進(jìn)行水解反應(yīng)；于pH 8.0的底物體系中加入250 U/g角質(zhì)酶G，50 ℃進(jìn)行水解反應(yīng)。水解過(guò)程中，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，水解反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴保溫25 min使酶滅活。

水解反應(yīng)體系中加入酶后，立即于沸水浴中保溫25 min使酶滅活作為水解0 h樣品。

1.3.2 酸值的測(cè)定方法

依據(jù)GB/T 5530—2005《動(dòng)植物油脂 酸值和酸度測(cè)定》測(cè)定水解產(chǎn)物的酸值[13]。

1.3.3 固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法

于20 mL萃取瓶中加入7 g樣品，55 ℃水浴平衡20 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭吸附30 min后直接插入氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行檢測(cè)。

色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，以10 ℃/min升溫至200 ℃，保溫13 min；載氣（He）流速1.6 mL/min，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度200 ℃；離子源溫度200 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500；溶劑延遲時(shí)間2 min。

根據(jù)NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)結(jié)合文獻(xiàn)描述對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢索，匹配相似度大于80的醛類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)化合物作為檢出物。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Qualitative Analysis B.07.00積分測(cè)定揮發(fā)性化合物，用峰面積表示揮發(fā)性化合物含量，利用Excel計(jì)算揮發(fā)性化合物總峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解對(duì)乳脂酸值的影響

從表1可以看出，不同酶水解引起乳脂酸值的變化不同。2 種脂肪酶及角質(zhì)酶F水解3 種乳脂底物后，酸值有不同程度的增加。2 種黃油為底物時(shí)，角質(zhì)酶G幾乎未發(fā)揮水解作用，稀奶油為底物時(shí)，僅有極弱的水解作用，因此不再對(duì)角質(zhì)酶G進(jìn)行后續(xù)研究。3 種乳脂經(jīng)脂肪酶D水解后酸值增加量大于15 mg/g，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的黃油A水解后酸值變化最小，酸值約為16.25 mg/g。質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的2 種黃油經(jīng)脂肪酶E水解后酸值變化最大；2 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的稀奶油經(jīng)脂肪酶E水解后酸值變化最小，酸值增加量約為14 mg/g。2 種黃油經(jīng)角質(zhì)酶F水解后酸值變化小于稀奶油，黃油水解后酸值在7～10 mg/g范圍內(nèi)，稀奶油酸值增加量大于30 mg/g。Regado等[12]比較了1 種角質(zhì)酶與10 種脂肪酶水解3 種不同動(dòng)物乳脂的效果，發(fā)現(xiàn)乳脂經(jīng)過(guò)不同酶的水解后水解率不同，其中角質(zhì)酶水解率最低，約為0.1%。這與本研究的結(jié)果不完全一致，本研究中角質(zhì)酶G水解3 種不同乳脂引起酸值的變化較脂肪酶小，而角質(zhì)酶F水解引起稀奶油酸值的變化較脂肪酶大。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與不同酶最優(yōu)水解條件的差異有關(guān)，底物種類(lèi)和濃度對(duì)酶的水解作用有一定的影響[14]。黎海彬等[15]利用脂肪酶Palatase 20000L水解無(wú)水奶油時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)孜锾砑恿刻幱?5%～85%之間時(shí)脂解率迅速增大，而底物添加量超過(guò)85%后脂解開(kāi)始變緩。

表1 2 種脂肪酶及2 種角質(zhì)酶引起的乳脂酸值的變化Table1 Acid value of milk fat before and after hydrolysis by lipase D,lipase E, cutinase F or cutinase G

2.2 酶水解對(duì)乳脂揮發(fā)性化合物的影響

2.2.1 脂肪酶D水解對(duì)乳脂揮發(fā)性化合物的影響

如表2所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%及50%的黃油A水解后，揮發(fā)性化合物種類(lèi)分別由6、4 種增加至12 種。水解后游離脂肪酸種類(lèi)增至11 種，其中辛酸含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%時(shí)，水解后辛酸峰面積為7.32×107；質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)，辛酸峰面積為8.94×107。質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%的黃油B水解后揮發(fā)性化合物個(gè)數(shù)由10 種增至12 種，質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的黃油B水解后揮發(fā)性化合物由5 種增加至11 種，其中辛酸含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%時(shí)，辛酸峰面積為9.46×107；質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)，辛酸峰面積為9.09×107。2 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的稀奶油經(jīng)脂肪酶D水解后揮發(fā)性化合物中游離脂肪酸含量增加，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%時(shí)，丁酸含量最高，峰面積為2.10×107，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)，水解后揮發(fā)性化合物中含量最高的為辛酸，峰面積為5.01×107?？梢钥闯?，不同乳脂經(jīng)過(guò)脂肪酶D水解后，游離脂肪酸種類(lèi)和含量增加，而δ-癸內(nèi)酯含量卻未明顯增加。

表2 脂肪酶D水解對(duì)乳脂揮發(fā)性化合物的影響Table2 Volatile compound prof i les of milkfat before and after hydrolysis by lipase D

2.2.2 脂肪酶E水解對(duì)乳脂揮發(fā)性化合物的影響

表3 脂肪酶E水解對(duì)乳脂揮發(fā)性化合物的影響Table3 Volatile compound prof i les of milkfat before and after hydrolysis by lipase E

如表3所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%的黃油A水解后揮發(fā)性化合物由6 種增至12 種，水解后揮發(fā)性化合物中丁酸、己酸、辛酸含量相差不多，是3 種含量最高的揮發(fā)性化合物。質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的黃油A水解后揮發(fā)性化合物由4 種增至12 種，其中辛酸、己酸、丁酸及癸酸含量最高。93.3%黃油B水解后揮發(fā)性化合物由10 種增加至13 種，其中辛酸含量最高，峰面積為2.45×107。50%黃油B水解后揮發(fā)性化合物由4 種增加至12 種，其中含量最高的脂肪酸為辛酸，峰面積為4.68×107。2 種質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀奶油經(jīng)脂肪酶E水解后揮發(fā)性化合物增至11 種，其中己酸含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%時(shí)，己酸峰面積為6.66×107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)，己酸峰面積為1.06×108。乳脂經(jīng)脂肪酶E水解后，揮發(fā)性化合物中的游離脂肪酸含量增加，而δ-癸內(nèi)酯及酮類(lèi)化合物含量未出現(xiàn)增加趨勢(shì)。

2.2.3 角質(zhì)酶F水解對(duì)乳脂揮發(fā)性化合物的影響

如表4所示，黃油A水解前揮發(fā)性化合物包括游離脂肪酸類(lèi)、δ-癸內(nèi)酯及甲基酮類(lèi)化合物，經(jīng)角質(zhì)酶F水解后，游離脂肪酸的種類(lèi)和含量增加，其中己酸含量最高，當(dāng)黃油A質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%時(shí)，己酸峰面積為9.75×107，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)，己酸峰面積為5.83×107。黃油B水解后揮發(fā)性化合物中己酸含量最高，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%時(shí)，己酸峰面積為9.09×107，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)，己酸峰面積為9.34×107。稀奶油經(jīng)角質(zhì)酶F水解后，當(dāng)稀奶油質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.3%時(shí)，水解后揮發(fā)性化合物中己酸與辛酸的峰面積相差不多，峰面積分別為1.43×108和1.44×108；當(dāng)稀奶油質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%時(shí)，水解后癸酸含量最高，峰面積為1.92×108，其次為辛酸，峰面積為1.66×108。

表4 角質(zhì)酶F水解對(duì)乳脂揮發(fā)性化合物的影響Table4 Volatile compound prof i les of milkfat before and after hydrolysis by cutinase F

從表2～4可以看出，當(dāng)?shù)孜锓N類(lèi)和質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，乳脂水解前（0 h）揮發(fā)性化合物的組成有一定差異，這可能與反應(yīng)體系不同有關(guān)。水解0 h的乳脂中分別按比例加入不同的酶，且3 種反應(yīng)體系起始pH值不同，這可能是導(dǎo)致乳脂水解前揮發(fā)性化合物組成不同的原因。研究認(rèn)為，風(fēng)味化合物在頂空氣體與液體及有機(jī)與水相間的分配會(huì)受到多種因素的影響，如pH值[16]、脂肪[17]等。另一方面，可能與乳脂水解前揮發(fā)性化合物含量較低有關(guān)，葉國(guó)注等[18]采用頂空固相微萃取分析綠茶香氣成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，低含量的香氣成分在頂空固相微萃取及檢測(cè)分析中不穩(wěn)定，可能會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)不出的情況。

雖然脂肪酶D、脂肪酶E與角質(zhì)酶F水解引起乳脂酸值的變化程度不同，且3 種酶的最優(yōu)水解條件不一致，但可以看出，酶水解引起乳脂揮發(fā)性化合物的變化有相似性。乳脂水解前后揮發(fā)性化合物組成發(fā)生明顯變化，游離脂肪酸總量增加，丁酸、己酸、辛酸、癸酸4 種脂肪酸含量最高，這與王蓓等[19]的研究結(jié)論一致。乳脂水解后δ-癸內(nèi)酯及酮類(lèi)2 種風(fēng)味化合物的占比下降，這與乳脂的組成特性有關(guān)。乳脂甘油三酯中的脂肪酸以偶數(shù)碳的直鏈脂肪酸為主，而內(nèi)酯類(lèi)化合物的前體物質(zhì)4/5-羥基脂肪酸在乳脂中含量較少[20]，因此無(wú)法僅通過(guò)酶的水解作用產(chǎn)生大量的內(nèi)酯類(lèi)化合物。甲基酮類(lèi)化合物常需通過(guò)微生物的不完全β-氧化途徑代謝脂肪酸[21]或者高溫加熱黃油[22]產(chǎn)生。乳脂水解產(chǎn)生的游離脂肪酸閾值低，尤其是丁酸在乳脂中的閾值為0.66 mg/kg[23]，其對(duì)乳脂風(fēng)味有重要的影響。丁酸呈奶酪味、乳臭味，己酸呈奶酪味、辛辣味[24]，辛酸呈奶油味、澀味，癸酸呈甜味、奶油味、陳腐味[23]，這些脂肪酸是奶酪風(fēng)味的重要來(lái)源[25-26]。乳脂經(jīng)過(guò)不同酶水解后揮發(fā)性化合物的組成不同，可用于制備不同風(fēng)味特征的香精。在研究中也發(fā)現(xiàn)，水解開(kāi)始階段，乳脂風(fēng)味有一定程度改善，隨著水解程度的增加，乳脂出現(xiàn)不同程度的酸敗味、異味。這與姚正曉[27]的研究結(jié)果類(lèi)似，水解產(chǎn)物中脂肪酸含量過(guò)高，導(dǎo)致水解產(chǎn)物的整體風(fēng)味強(qiáng)度過(guò)大，不夠柔和。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，一方面可能與不同種類(lèi)風(fēng)味化合物間的平衡被破壞有關(guān)，當(dāng)游離脂肪酸與其他風(fēng)味化合物含量處于某種平衡時(shí)乳脂風(fēng)味才比較理想[28]。另一方面可能與中短鏈脂肪酸在高濃度時(shí)的風(fēng)味特性有關(guān)。游離脂肪酸含量過(guò)高時(shí)，尤其是中鏈脂肪酸含量較高時(shí)，水解乳脂風(fēng)味較差[29]。Urbach等[23]通過(guò)在模擬“黃油”體系中添加風(fēng)味化合物的研究發(fā)現(xiàn)，C2～C10這些中短鏈游離脂肪酸在遠(yuǎn)高于閾值的濃度條件下，會(huì)給予“黃油”不良的風(fēng)味，以丁酸為例，其含量在閾值附近時(shí)，“黃油”呈令人愉快的風(fēng)味，隨著含量的增加，風(fēng)味呈腐敗味。所以乳脂水解產(chǎn)物需要經(jīng)過(guò)一些修飾才可以用于乳制品增香，Zhang Xiaomei等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在乳脂水解產(chǎn)物中添加乙醇，利用脂肪酶酯化作用制備的酶解產(chǎn)物可使脫脂乳的風(fēng)味改善。駱婕怡等[31]通過(guò)添加乳糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)改善水解產(chǎn)物風(fēng)味。

3 結(jié) 論

采用脂肪酶D、E及角質(zhì)酶F、G水解引起乳脂酸值的變化不同。3 種乳脂經(jīng)2 種脂肪酶及角質(zhì)酶F水解后酸值增加較多，2 種黃油經(jīng)角質(zhì)酶G水解酸值無(wú)明顯變化，稀奶油經(jīng)角質(zhì)酶G水解后酸值略有變化。3 種乳脂經(jīng)脂肪酶D、脂肪酶E及角質(zhì)酶F水解后揮發(fā)性化合物組成發(fā)生了明顯的變化，游離脂肪酸總量增加；而δ-癸內(nèi)酯及酮類(lèi)化合物含量未明顯增加，占比降低。丁酸、己酸、辛酸、癸酸是水解乳脂揮發(fā)性化合物中的主要物質(zhì)。