β-氨基丁酸處理對采后桃果實還原勢的影響及抗病性的誘導(dǎo)作用

陳 偲，汪 立，夏明星，伍冬志，廖云霞，汪開拓，鄭永華*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404100；3.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶 404100）

真菌性病害嚴重縮短采后果實貨架期和貯藏期。合成化學(xué)殺菌劑如特克多、波爾多液和咪唑霉處理可有效抑制果實采后病害的發(fā)展，但長期施用會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境及食品安全造成嚴重的不利影響[1]。通過物理、化學(xué)及生物等綠色激發(fā)子處理來誘導(dǎo)果實自身抗病性可有效抑制病原菌侵染，顯著降低化學(xué)藥劑使用量[2]。對相關(guān)抗病性機理的進一步研究結(jié)果顯示，植物誘導(dǎo)抗病性的形成與細胞或組織內(nèi)氧化還原勢的消長密切相關(guān)：在植物經(jīng)激發(fā)子處理或病原菌侵染后，其細胞核內(nèi)還原性信號分子以及還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）大量積累，并通過電子傳遞鏈逐級傳遞以使細胞核內(nèi)還原勢急劇上升，從而修飾轉(zhuǎn)錄因子以實現(xiàn)對病程相關(guān)蛋白（pathogensis-related proteins，PRs）基因的調(diào)控并誘導(dǎo)其迅速表達，最終促進PRs、植保素及酚類物質(zhì)的合成[3-4]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)茉莉酸甲酯處理的葡萄果實中NO積累量顯著增加，同時病程相關(guān)基因非表達子基因（nonexpressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1）表達量也急劇上升，這暗示還原勢的變化與抗病性的誘導(dǎo)可能存有密切相關(guān)性[5-6]。

β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）是一種小分子的非蛋白類氨基酸，其可通過獨特的BABA誘導(dǎo)途徑和交聯(lián)應(yīng)答機制刺激植物的超敏反應(yīng)，從而導(dǎo)致活性氧迸發(fā)、PRs基因表達、植保素合成等一系列抗病反應(yīng)，抑制病原菌的侵染[7-8]。在果蔬采后保鮮領(lǐng)域，BABA處理可有效誘導(dǎo)芒果[9]、櫻桃[10]、葡萄[11]、草莓[12]等多種果實PRs基因的表達和抗病相關(guān)物質(zhì)的合成，從而顯著抑制果實貯藏期間腐爛率的上升。近年來的研究進一步發(fā)現(xiàn)，BABA處理可誘導(dǎo)多種植物或果實的Priming反應(yīng)，從而在病原菌侵染時賦予果實強烈的抗病性，但其具體機理仍不明確[13]。考慮到內(nèi)部還原勢可直接調(diào)控植物的防衛(wèi)反應(yīng)，本實驗從內(nèi)部還原勢變化角度研究BABA誘導(dǎo)果實抗病性形成的機理以彌補研究空白。此外，桃果（Prunus persica L.）為我國夏季最主要的大宗水果之一，產(chǎn)銷需求旺盛；但桃果實為呼吸躍變型水果，采后呼吸強度大、品質(zhì)劣變迅速，且果實嬌嫩，極易遭受霉菌侵染而發(fā)生大范圍腐爛，損耗極為嚴重，開發(fā)綠色高效的保鮮方法極為迫切。本研究在前期成果的基礎(chǔ)上，以‘白鳳’水蜜桃為試材，分析BABA處理對桃果實磷酸戊糖途徑和還原性物質(zhì)積累的影響，以期明確還原勢消長對果實誘導(dǎo)抗性形成之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業(yè)成熟度（八分熟）的‘白鳳’水蜜桃（Prunus persica）采摘于重慶市武隆區(qū)火爐鎮(zhèn)有機桃種植基地，采后即刻運回實驗室。挑選大小一致、轉(zhuǎn)色均勻并剔除存有機械傷和病蟲害果實，平鋪于操作臺上用20 ℃強制冷風(fēng)吹去田間熱。

BABA、幾丁質(zhì)、二硫代硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，DTNB） 美國Sigma公司；3,5-二硝基水楊酸、三氯乙酸、L-苯丙氨酸、鄰苯二甲基氨基甲醛 上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙醇、鹽酸、冰醋酸 重慶戊業(yè)化學(xué)試劑有限公司；谷胱甘肽還原酶、昆布多糖上海源葉生物科技有限公司；NO檢測試劑盒、NADP＋/NADPH檢測試劑盒、GSH/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；Tripure Isolation Reagent試劑盒、SuperScript II試劑盒 美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2600i紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DK-98-II型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；BSC-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DW-86L338J型超低溫冰箱 青島海爾特種電器有限公司；PTC-200型反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）儀、Gel Doc XR型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；DYCP-31D型核酸電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 病原菌孢子懸浮液的制備、原料處理與分組

匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）分離于發(fā)生軟腐病的桃果實，純化鑒定后接種于PDA斜面上，冷藏（4 ℃）備用。接種處理前，將斜面上的菌種轉(zhuǎn)接至PDA平板中，傳代培養(yǎng)7 d后用含體積分數(shù)0.02% Tween-80的無菌生理鹽水將病原菌孢子洗出，隨后用血球計數(shù)板計數(shù)并將孢子濃度稀釋至5×104個/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

本實驗室前期研究證實10 mmol/L的BABA處理可有效抑制多種果實貯藏期間病害的發(fā)生，故選用此濃度為基礎(chǔ)開展后續(xù)研究[11-12]。桃果實隨機分為4組：1）對照組：桃果實不經(jīng)任何處理；2）病原菌接種組：先用體積分數(shù)70%乙醇溶液仔細擦拭果實表面，然后用解剖針在果實赤道對稱部位刺孔2 個（深3 mm、直徑3 mm），各穿刺孔均用移液槍打入15 μL R. stolonifer孢子懸浮液；3）BABA處理組：桃果實經(jīng)體積分數(shù)70%乙醇溶液表面消毒，并在赤道位置對稱穿刺2 個，各穿刺孔均打入15 μL10 mmol/L BABA溶液；4）BABA＋病原菌接種組：桃果實經(jīng)表面70%乙醇溶液消毒和對稱穿刺后，先打入15 μL10 mmol/L的BABA溶液，隨后置于20 ℃下貯藏6 h后，在穿刺處再接種15 μL R. stolonifer孢子懸浮液。處理結(jié)束后，將桃果實用60 μm厚的聚乙烯袋分裝，細繩輕繞袋口2 圈，隨后置于（20±1）℃、相對濕度80%～90%的培養(yǎng)箱中貯藏5 d。在貯藏期間觀察桃果實發(fā)病情況，并每天切取健康桃果肉在液氮中速凍，最后于－80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)錂z。每個處理不少于40 個果實，各處理均重復(fù)3 次，整個實驗重復(fù)2 次。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 發(fā)病率和病斑直徑的測定

果實病斑直徑大于3 mm即為發(fā)病果，發(fā)病率按下式進行計算。

用游標卡尺直接測量果實病斑直徑。

1.3.2.2 水楊酸、NO含量的測定

水楊酸（salicylic acid，SA）含量測定參考龔波林[14]的方法，利用水楊酸的溴代反應(yīng)生成2,7-二氯熒光素-Br2-SA反應(yīng)物，通過熒光法測定果實痕量SA含量；NO含量的測定參考Murphy等[15]的方法，以高鐵血紅蛋白法進行測定。SA、NO含量的結(jié)果均以鮮果質(zhì)量計。

1.3.2.3 NADPH、NADP＋、GSH和GSSG含量的測定

NADPH和NADP＋含量參考Nagano等[16]的硫酸甲酯吩嗪反應(yīng)法進行測定；GSH和GSSG含量參考Rahman等[17]的酶循環(huán)法，利用5,5’-二硫硝基苯甲酸反應(yīng)進行測定。

1.3.2.4 G6PDH、6PGDH活力的測定

稱取2 g果實凍樣，加入10 mL內(nèi)含30 mmol/L甘露醇、5 mmol/L MgSO4、5 mmol/L KCl和1 mmol/L EDTA的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2），勻漿，再以5 000×g離心10 min（4 ℃）后，取上清液測定酶活力。

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（g l u c o s e-6-phosphatedehydrogenase，G6PDH）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphoglu conatedehydrogenase，6PGDH）活力參照?indelá?等[18]的方法進行測定，略有改進。G6PDH反應(yīng)體系（共3 mL）包含0.5 mL粗酶液、1 mL10 mmol/L NADP＋溶液、1 mL10 mmol/L 6-磷酸葡萄糖溶液和0.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.2）；測定6PGDH活力時，則將上述體系中6-磷酸葡萄糖溶液替換為6-磷酸葡萄糖酸溶液。反應(yīng)液中每分鐘生成1 nmol NADPH為1個酶活力單位（U），用考馬斯亮藍比色法測定提取液中蛋白質(zhì)含量[19]，以每毫克蛋白中的酶活力表示果實樣品中酶活力，單位為U/mg。

1.3.2.5 PRs基因表達豐度的測定

取1 g果實凍樣使用Tripure Isolation Reagent試劑盒提取RNA。取1 mg RNA采取SuperScript II試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈，Oligo（dT）為引物。用Primer Premier 7.0軟件設(shè)計相關(guān)基因特異性引物（表1），以桃18S rRNA基因為內(nèi)參。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，用溴化乙錠染色后用凝膠成像儀掃描并定量分析[20]。

表1 桃果實PRs基因特異性引物序列Table1 Primer sequences used for PCR amplif i cation of PR genes in peach fruits

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

果實發(fā)病率和病斑直徑重復(fù)測定5 次，其余指標均重復(fù)測定3 次。采取鄧肯氏多重比較法（SAS 8.2軟件）進行差異顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對桃果實發(fā)病率與病斑直徑的影響

圖1 不同處理對桃果實貯藏期間發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.1 Effects of different treatments on disease incidence （A） and lesion diameter （B） in peach fruits during storage

如圖1A所示，桃果實在20 ℃下貯藏5 d后，對照組果實發(fā)病率達到37.2%，同時病原菌接種組果實有58.4%的果實發(fā)生病害，而BABA處理組果實發(fā)病率比對照組低52.7%；BABA＋病原菌接種組果實發(fā)病率則較病原菌接種組低72.3%。BABA＋病原菌接種組果實病斑直徑顯著低于病原菌接種組（圖1B）。這些結(jié)果說明BABA處理可有效控制桃果實貯藏期間軟腐病的發(fā)展。

2.2 不同處理對桃果實貯藏期間NO、SA含量的影響

由圖2A、B可知，對照組桃果實中NO含量在整個貯藏期間無明顯變化，SA含量則隨貯藏時間的延長逐漸上升。BABA處理在貯藏3 d后顯著促進了桃果實中NO生成（P＜0.05），但BABA處理組SA含量與對照組無顯著差異。病原菌接種組果實的NO和SA含量在貯藏第1天出現(xiàn)明顯峰值，其數(shù)值分別為相同貯藏時間對照組的1.68 倍和2.46 倍，隨后快速下降，至貯藏結(jié)束時，兩者含量與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。桃果實經(jīng)BABA處理并接種病原菌后，其組織內(nèi)NO和SA含量在貯藏第1天出現(xiàn)較病原菌接種組更高的峰值，在貯藏的前4 d也顯著高于病原菌接種組。同時，在貯藏期間，BABA＋接種病原菌組果實的NO和SA生成量均顯著高于BABA處理組（P＜0.05）。

圖2 不同處理對桃果實貯藏期間NO（A）和SA（B）含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on NO （A） and SA （B） content in peach fruits during storage

2.3 不同處理對桃果實貯藏期間NADPH和NADP＋含量的影響

圖3 不同處理對桃果實貯藏期間NADPH含量（A）、NADP＋含量（B）和NADPH/NADP＋比值（C）的影響Fig.3 Effects of different treatments on NADPH （A） and NADP+ （B）contents as well as NADPH/NADP+ ratio （C） in peach fruits during storage

NADPH是植物體內(nèi)重要的還原性物質(zhì)，NADPH/NADP＋比值一定程度上可以反映果實細胞還原勢的高低。由圖3A～C可知，在貯藏前4 d，對照組桃果實組織內(nèi)NADPH含量逐漸上升，而NADP＋含量基本保持穩(wěn)定。BABA處理與對照相比可促進NADPH的積累，并同時降低NADP＋含量，且BABA處理組果實NADPH/NADP＋比值在整個貯藏期間均顯著高于對照組（P＜0.05）；病原菌接種組果實在貯藏1 d后，其NADPH含量開始下降，而NADP＋含量在貯藏前期快速上升，之后含量均高于其他處理組，NADPH/NADP＋比值顯著低于對照組（P＜0.05）；BABA＋病原菌接種處理組果實中NADPH含量在整個貯藏期間均顯著高于BABA處理組果實（P＜0.05）。

2.4 不同處理對桃果實貯藏期間GSH和GSSG含量的影響

圖1 不同處理對桃果實貯藏期間GSH含量（A）、GSSG含量（B）和GSH/GSSG比值（C）的影響Fig.1 Effects of different treatments on GSH （A） and GSSG （B） contents as well as GSH/GSSG ratio （C） in peach fruits during storage

由圖4可見，對照組桃果實中GSH含量在貯藏期間緩慢下降，而GSSG含量則呈現(xiàn)先緩慢下降后急劇上升趨勢。桃果實接種病原菌后，GSSG含量開始迅速上升，至貯藏第2天出現(xiàn)峰值，隨后逐漸下降；GSH含量先下降，貯藏1 d后又逐漸上升。在貯藏2 d后，與對照和病原菌接種相比，BABA處理和BABA＋病原菌接種均可誘導(dǎo)提高果實中GSH含量、降低GSSG含量，并可降低GSH/GSSG比值。

2.5 不同處理對桃果實貯藏期間G6PDH和6PGDH活力的影響

圖5 不同處理對桃果實貯藏期間G6PDH（A）和6PGDH（B）活力的影響Fig.5 Effects of different treatments on G6PDH （A） and 6PGDH （B）activities in peach fruits during storage

由圖5可見，對照組桃果實中G6PDH活力在貯藏前2 d緩慢上升，隨后逐漸下降；6PGDH活力在整個貯藏期間無顯著變化。與對照組相比，BABA處理顯著誘導(dǎo)了G6PDH和6PGDH活力的上升，并使兩者酶活力在整個貯藏周期均維持在較高水平。果實經(jīng)病原菌接種后，G6PDH活力在貯藏第1天出現(xiàn)明顯峰值，隨后迅速下降至對照組果實水平；而6PGDH活力在整個貯藏期間均顯著低于對照組（P＜0.05）。果實先經(jīng)BABA處理再接種病原菌后，其G6PDH活力在貯藏期前3 d較BABA處理組出現(xiàn)更為明顯的上升，在貯藏3 d后也顯著高于BABA處理組（P＜0.05）。

2.6 不同處理對桃果實貯藏期間PRs基因表達豐度的影響

如圖6A～C所示，對照組與BABA處理組桃果實的PRs基因表達豐度在貯藏前2 d并無顯著差異（P＞0.05），但2 d后BABA處理組的PpNPR1-like、PpCHI和PpGNS基因表達豐度則明顯高于對照組。接種病原菌后，PpNPR1-like和PpCHI表達豐度在貯藏第1天最高，同時PpGNS表達豐度則在貯藏第2天最高，隨后逐漸下降，貯藏后期3 種基因表達豐度均顯著低于BABA處理組水平（P＜0.05）。BABA＋病原菌處理組PpNPR1-like、PpCHI和PpGNS表達豐度在貯藏前3 d整體上顯著高于BABA處理組和病原菌接種組（P＜0.05），在整個貯藏期間3 種基因的表達豐度均處于較高水平，說明BABA＋病原菌處理有效誘導(dǎo)了桃果實PRs基因的表達。

圖6 不同處理對桃果實貯藏期間PpNPR1-like（A）、PpCHI（B）和PpGNS（C）基因表達豐度的影響Fig.6 Effects of different treatments on expression levels of PpNPR1-like （A）, PpCHI （B） and PpGNS （C） genes in peach fruits during storage

3 討 論

BABA作為一種典型的激發(fā)子，可有效激發(fā)多種果實的抗病性反應(yīng)[13]。在本研究中，10 mmol/L BABA處理在貯藏前期未能誘導(dǎo)果實產(chǎn)生明顯的抗病性反應(yīng)，但貯藏后期當(dāng)果實發(fā)病率明顯上升時，經(jīng)BABA處理的果實中PRs基因表達豐度明顯上升；BABA＋病原菌處理則較BABA處理或病原菌接種更明顯地誘導(dǎo)了果實防衛(wèi)反應(yīng)，果實中NO和SA的積累量以及PRs基因表達豐度在整個貯藏期間均維持在最高水平。這說明10 mmol/L BABA處理無法直接激活桃果實防衛(wèi)反應(yīng)，但可通過誘導(dǎo)Priming反應(yīng)的方式使果實在受R. stolonifer侵染時有效激活抗病性，從而抑制果實軟腐病的發(fā)生。這些結(jié)果與本實驗室前期研究相類似，即較高濃度的BABA處理（100、500 mmol/L）可直接誘導(dǎo)芒果[9]和櫻桃[10]果實的活性氧迸發(fā)、PRs基因表達和植保素合成等一系列抗病性反應(yīng)，但經(jīng)有效低濃度BABA（10 mmol/L）處理的果實則不直接表現(xiàn)抗病性，需再進行病原菌接種后果實才能表現(xiàn)出更強烈的抗病性反應(yīng)，這符合典型Priming反應(yīng)的特征[21]。

活性氧自由基的瞬時大量迸發(fā)被認為是植物聯(lián)級防衛(wèi)反應(yīng)的首要程序，其與后續(xù)的PRs基因表達以及PRs、植保素合成等一系列抗病性反應(yīng)密切相關(guān)[22]。但近年來的研究證實，短時間的活性氧迸發(fā)是促進植物組織中細胞還原勢提高的重要前提，而還原勢的提高正是啟動植物防衛(wèi)反應(yīng)的重要條件[23]。在模式作物擬南芥中，SA處理或病原菌接種均可有效誘導(dǎo)植株內(nèi)GSH含量和NADPH含量的上升，提高組織還原勢，進而將以共聚體形式存在的無活性WRKYs和TGAs等轉(zhuǎn)錄因子中二硫鍵逐步還原為巰基，釋放出活性單體，最終啟動PRs基因的表達[24-26]。因此，提高細胞還原勢可有效活化大量與PRs基因表達密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)植物抗病性。NO和SA作為典型的還原性信號分子，不僅能直接提高細胞還原勢，而且可通過復(fù)雜信號交聯(lián)機制調(diào)控下游PRs基因的表達[27-28]。此外，磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）是在動、植物和微生物中普遍存在的糖代謝支路，其可使葡萄糖直接氧化脫氫和脫羧并同時將NADP＋還原為游離NADPH，從而直接提高細胞還原勢并為細胞各項生命活動提供氫元素[29]。G6PDH和6PGDH是PPP途徑中兩種關(guān)鍵的限速酶，其活性的高低與NADPH合成量密切相關(guān)[30]。在本研究中，10 mmol/L BABA處理或BABA＋病原菌接種均可有效誘導(dǎo)桃果實中NO的積累，BABA＋病原菌處理可有效誘導(dǎo)桃果實中SA的積累。與對照組相比，BABA處理也可誘導(dǎo)G6PDH和6PGDH活力的提高，逐漸將NADP＋還原為NADPH，因此提高了NADPH/NADP＋比值；BABA處理也同樣促進了桃果實中GSH含量的上升。此外，NPR1是植物抗病信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的中間位點，對下游PRs基因的表達可起到正向調(diào)控作用[31]；CHI和GNS基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯后可生成幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶，可直接水解真菌細胞壁[32]。伴隨著果實還原勢的提高，經(jīng)BABA處理的桃果實中NPR1-like、PpCHI和PpGNS基因表達豐度較對照組也明顯增加，從而賦予果實較強的抗病性。

這些結(jié)果說明，10 mmol/L BABA處理可促進還原性信號分子積累并提高PPP途徑關(guān)鍵酶活力，從而提升桃果實還原勢，最終誘導(dǎo)PRs基因的表達以增加果實抗病性。這些結(jié)果解釋了BABA誘導(dǎo)桃果實Priming抗性的形成機理，但相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在這其中發(fā)揮的作用仍有待后續(xù)研究。