紅松松仁蛋白肽的分離純化及體外抗氧化和體內(nèi)抗疲勞作用

鄭元元，井 晶，王振宇*，彭方帥

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

隨著現(xiàn)代社會的快速發(fā)展和生活節(jié)奏的加快，人們的工作、學(xué)習(xí)壓力越來越大，疲勞造成的身體不適和工作效率減退困擾著人們。最早由日本學(xué)者提出的“猝老死”是由于長期工作導(dǎo)致壓力太大而引起的癥狀。通常情況下疲勞是短暫的，但少部分人具有持續(xù)的、令人虛弱的疲勞癥狀，其被稱為“慢性疲勞綜合征”，嚴(yán)重影響人們的身體健康和心理健康[1]。此外，研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激也會引起疲勞，氧化損傷會產(chǎn)生大量的自由基，促進(jìn)疲勞的產(chǎn)生。根據(jù)Harman[2]的“自由基學(xué)說”，短暫的劇烈運(yùn)動、長時(shí)間的壓力以及長期勞累過度而得不到有效的緩解都會破壞機(jī)體的抗氧化活性和氧化系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致自由基大量堆積，從而限制運(yùn)動的持續(xù)進(jìn)行[3]。疲勞是一種復(fù)雜的癥狀[4]，而氧化應(yīng)激在疲勞的產(chǎn)生過程中扮演著重要角色，因此保護(hù)機(jī)體不受氧化傷害是預(yù)防疲勞的有效方法[5-6]。隨著對抗疲勞研究的逐步深入，許多有效的抗疲勞產(chǎn)品被發(fā)現(xiàn)，包括動植物蛋白[7]、動植物蛋白肽[8-10]和乳源性蛋白肽[11-12]等。現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究表明，蛋白質(zhì)通過消化道酶作用后不是全部以游離氨基酸的形式被吸收，而是部分以短肽的形式直接被身體吸收。因此，將大分子蛋白分解成小分子肽是近年來研究的重點(diǎn)。目前，制備肽的主要方法是酶解法，肽的分離純化方法主要有超濾法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、制備型高效液相色譜法等。

紅松（Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.）主要產(chǎn)于我國東北長白山到小興安嶺一帶，松仁是紅松屬植物種子成熟去皮后得到的果仁，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)、維生素等，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[13]。目前，松仁的開發(fā)只局限于壓榨松仁油，對其副產(chǎn)物松仁蛋白的開發(fā)較少，因此有必要對松仁蛋白進(jìn)行深入探究。近年來，關(guān)于松仁蛋白活性肽的研究主要集中在其抗氧化活性、抗腫瘤活性、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性等方面，但對松仁蛋白肽的抗疲勞功能還鮮有研究；因此對松仁蛋白進(jìn)行深度開發(fā)具有重要的意義。

本研究是以紅松松仁蛋白粉為原料，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶兩步酶解，再經(jīng)超濾、離子交換樹脂及凝膠過濾制備出松仁蛋白肽，并對其體外抗氧化活性和體內(nèi)抗疲勞功能進(jìn)行鑒定，為紅松松仁資源的深度開發(fā)和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

昆明種清潔級雄性小鼠（18～22 g）購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK（黑）2002-0002。

西洋參（規(guī)格XYSDP）購自吉林省康象參茸有限公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教研室鑒定為西洋參；紅松松仁購于黑龍江小興安嶺地區(qū)農(nóng)戶家中。

SP Sephadex C-25陽離子交換柱、Sephadex G-25陽離子交換柱、胃蛋白酶 美國Sigma公司；胰蛋白酶 無錫雪梅酶制劑有限公司；活性炭 天津市天大化學(xué)試劑廠；肝糖原試劑盒、血清尿素氮試劑盒、全血乳酸試劑盒、丙二醛試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

血糖儀 南京建成生物工程研究所；PB-10 pH計(jì)德國塞多利斯公司；LD5-2A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；FD-1真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-2100紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯有限公司；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 溫州市醫(yī)療電器廠；1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 松仁蛋白的提取

松仁蛋白采用超聲輔助水提法制備[14]。將紅松松仁去殼及紅衣，粉碎，過40 目篩后與石油醚以料液比1∶10混合脫脂，重復(fù)3 次，即得脫脂松仁粉。將脫脂松仁粉與蒸餾水以料液比1∶25混合，在500 W的超聲功率下50 ℃超聲100 min，4 000 r/min離心15 min取上清液，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.6以沉淀蛋白，4 000 r/min離心20 min取沉淀，用蒸餾水充分沖洗，加1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，樣品于－20 ℃預(yù)凍24 h后冷凍干燥，研磨后即得松仁蛋白。

1.3.2 松仁蛋白粗酶解物的制備

采用胃蛋白酶進(jìn)行第1步水解，水解條件為：pH 2.5，水解溫度37 ℃，加酶量5 000 U/g，水解時(shí)間2 h；采用胰蛋白酶進(jìn)行第2步水解，水解條件為：pH 8.00，水解溫度45 ℃，加酶量10 000 U/g，水解時(shí)間90 min。在此條件下制備的松仁蛋白粗酶解產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 超濾

分別采用截留分子質(zhì)量為3 kDa和10 kDa的超濾離心管進(jìn)行分離，得到小于3 kDa、3～10 kDa、大于10 kDa的3 種分子質(zhì)量的水解產(chǎn)物，分別收集、凍干保存并測定其抗氧化活性。

1.3.4 SP Sephadex C-25陽離子交換層析

將超濾得到的抗氧化活性最強(qiáng)的組分配制成20 mg/mL溶液，過0.22 μm水系濾膜，采用SP Sephadex C-25陽離子交換柱（1.6 cm×60 cm）進(jìn)行分離，上樣量1.5 mL，首先用pH 4.0的醋酸鈉緩沖液平衡柱子，之后用不同濃度NaCl-醋酸鈉緩沖液進(jìn)行線性洗脫，流速為0.5 mL/min，于220 nm波長處測定吸光度并收集組分，將分離出的組分分別冷凍干燥，測定各個(gè)組分的抗氧化活性。

1.3.5 Sephadex G-25凝膠層析

將1.3.4節(jié)中抗氧化活性最強(qiáng)的組分配制成20 mg/mL溶液，過0.22 μm水系濾膜，采用Sephadex G-25凝膠層析柱（1.6 cm×60 cm）進(jìn)行分離，上樣量1.5 mL，以去離子水為洗脫液，流速為0.5 mL/min，于220 nm波長處測定吸光度并收集組分，將分離出的組分分別凍干，測定各個(gè)組分的抗氧化活性。

1.3.6 松仁蛋白多肽分子質(zhì)量分布的測定

采用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）測定松仁蛋白多肽的分子質(zhì)量范圍，選用不同分子質(zhì)量（98 400、65 000、23 700、10 250、6 100、1 100 Da）的聚乙二醇為標(biāo)準(zhǔn)品。色譜條件：流動相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液和0.05 mol/L NaCl溶液（pH 7.0），流速為0.5 mL/min，色譜柱為SRT SEC-300，進(jìn)樣量為100 μL，檢測溫度25 ℃，柱溫25 ℃。

1.3.7 體外抗氧化活性的測定

羥自由基清除能力的測定參考Amarowicz等[15]的方法。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定參考Wang Bin等[16]的方法。

1.3.8 體內(nèi)抗疲勞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

參考Zhao Yuqin[4]和Guo Hang[17]等的方法，將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，空白組小鼠給予生理鹽水灌胃。西洋參是公認(rèn)的抗疲勞物質(zhì)，具有良好的抗疲勞作用[18-19]，因此陽性組小鼠灌胃0.1 mg/g西洋參。其他3 組小鼠分別灌胃0.05、0.10 mg/g和0.20 mg/g松仁蛋白多肽（PDII組分），相應(yīng)記為低、中、高劑量組。連續(xù)灌胃受試小鼠4 周，測定各指標(biāo)水平。

1.3.9 測定指標(biāo)

1.3.9.1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

小鼠在最后一次灌胃后休息30 min，每組5 只小鼠尾部負(fù)5%體質(zhì)量的鉛塊，放入游泳池（水溫（25±1）℃，水深不低于30 cm）。不斷攪拌水以確保小鼠的持續(xù)運(yùn)動，直到小鼠沉沒超過10 s，不再浮出，認(rèn)為其體力消耗盡而死亡。從游泳開始到小鼠死亡的時(shí)間記錄為游泳力竭時(shí)間/min。

1.3.9.2 生理生化指標(biāo)的測定

在最后一次灌胃后，小鼠休息30 min，各組其余5 只動物放入游泳池（水溫（25±1）℃，水深不低于30 cm）。不斷攪動水以確保小鼠的持續(xù)運(yùn)動。游泳30 min后，將小鼠從池中取出并用紙巾擦干。從眼球取血樣后，立即取出小鼠肝臟、脾臟和胸腺，用生理鹽水反復(fù)漂洗，去除血液，剔除脂肪及結(jié)締組織，濾紙吸去多余水分，稱質(zhì)量，其與體質(zhì)量的比值即為臟器指數(shù)。將全血以3 500×g離心15 min以獲得血清，并將收集的樣品貯存在－80 ℃，保存期不超過1 個(gè)月。根據(jù)試劑盒說明書測定血乳酸、血清尿素氮、丙二醛濃度和肝糖原含量，使用血糖測定儀測定血糖濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 超濾各組分抗氧化活性分析

圖1 超濾各組分的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of ultraf i ltration fractions

松仁蛋白粗酶解物經(jīng)超濾分離得到3 個(gè)組分，分別記為P1（分子質(zhì)量小于3 kDa）、P2（分子質(zhì)量3～10 kDa）、P3（分子質(zhì)量大于10 kDa）。由圖1可知，P1組分的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）低于其他組分，且極顯著低于粗酶解物（P＜0.01），抗氧化活性最強(qiáng)，因此，選擇P1組分進(jìn)行下一步純化。

2.2 SP Sephadex C-25分離結(jié)果

圖2 P1組分的SP Sephadex C-25分離洗脫曲線Fig.2 Elution curve of fraction P1 on SP Sephadex C-25 column

由圖2可知，P1組分經(jīng)SP Sephadex C-25陽離子樹脂分離后得到4 個(gè)組分，分別記為PA、PB、PC、PD。

圖3 各洗脫組分的羥自由基和DPPH自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl and DPPH radical scavenging capacity of the eluted fractions

由圖3可知，PD組分羥自由基和DPPH自由基的IC50低于其他組分，即清除能力均高于其他組分，即當(dāng)NaCl濃度為0.10 mol/L時(shí)，洗脫組分的抗氧化活性最強(qiáng)。因此，選擇PD組分進(jìn)行下一步純化。

2.3 Sephadex G-25分離結(jié)果

圖1 PD組分的Sephadex G-25分離洗脫曲線Fig.1 Elution curve of PD on Sephadex G-25 column

由圖4可知，PD組分經(jīng)Sephadex G-25分離后得到3 個(gè)組分，分別記為PDI、PDII、PDIII。

圖5 各洗脫組分的羥自由基和DPPH自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl and DPPH radical scavenging capacity of the eluted fractions

如圖5所示，PDII組分的羥自由基和DPPH自由基IC50低于其他組分，即清除能力最強(qiáng)，與粗酶解物相比具有極顯著差異（P＜0.01），因此，選擇PDII組分進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 松仁蛋白多肽分子質(zhì)量分布分析

圖6 松仁蛋白肽PDII的凝膠色譜Fig.6 Gel fi ltration chromatogram of PDII

利用GPC進(jìn)行分子質(zhì)量分布曲線的繪制，標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量（mp/Da）對數(shù)與保留體積（Vp/mL）的線性關(guān)系為：lg mp＝12.980 0－2.673 5Vp＋0.294 4Vp2－0.012 0Vp3，r2＝0.999 548。如圖6所示，數(shù)均分子質(zhì)量（mn）為693 Da，重均分子質(zhì)量（mw）為878 Da，分子質(zhì)量分布范圍主要為500～1 100 Da。

2.5 體內(nèi)抗疲勞能力測定結(jié)果

表1 各實(shí)驗(yàn)組小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間Table1 Weight-loaded swimming time of mice from all groups

運(yùn)動耐力是反映身體疲勞程度最直接和客觀的指標(biāo)。游泳疲勞模型是評估抗疲勞能力的運(yùn)動實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以評估小鼠的耐力，具有很高的重現(xiàn)性[20-21]。運(yùn)動耐力的提高是抗疲勞作用最有力的體現(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)中，通過負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)研究了PDII的抗疲勞作用，游泳時(shí)間的長短反映疲勞程度。由表1可知，與空白組相比，松仁蛋白肽低、中、高劑量組和陽性組游泳時(shí)間均有所延長，低劑量組與空白組相比具有顯著差異（P＜0.05），中、高劑量組以及陽性組與空白組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。高劑量組比陽性組小鼠游泳時(shí)間延長率增加了17.02%，表明PDII能起到延長小鼠的運(yùn)動時(shí)間、提高其運(yùn)動耐力的作用。

表2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠的臟器指數(shù)Table2 Organ indices of mice from all groups

小鼠體質(zhì)量和各個(gè)器官的臟器指數(shù)增加或減少過快，都不利于小鼠的生長。肝臟、脾臟和胸腺分別是人體最重要的代謝和解毒器官、最大的淋巴器官和重要的免疫器官。由表2可知，小鼠在劇烈運(yùn)動后，松仁蛋白肽高劑量組的肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)與空白組相比都有所增加，但無顯著性差異，說明松仁蛋白肽在一定程度上可以緩解小鼠的疲勞癥狀。

血糖是中樞神經(jīng)系統(tǒng)能量供應(yīng)的主要來源之一，也是紅細(xì)胞能量供應(yīng)的唯一來源。因此，維持血糖平衡對器官功能至關(guān)重要[22]。長時(shí)間的力竭運(yùn)動導(dǎo)致大量碳水化合物的消耗，血糖濃度的下降直接影響到腦細(xì)胞的能量供應(yīng)，導(dǎo)致大腦的活動減少和身體疲勞。肝糖原是由許多葡萄糖分子聚合而成的物質(zhì)，葡萄糖聚合物以糖原的形式貯存于肝臟，當(dāng)饑餓或運(yùn)動時(shí)，可以將其分解成葡萄糖以維持血糖水平[23]。肝糖原的貯存及分解可直接影響運(yùn)動能力和持續(xù)運(yùn)動時(shí)間[24]。因此，血糖濃度和肝糖原含量可以較好地反映疲勞程度[25]。由表3可以看出，與空白組相比，松仁蛋白肽各劑量組血糖濃度和肝糖原含量顯著提高，中、高劑量組小鼠血糖濃度分別為空白組的1.70 倍和2.04 倍，差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）；中、高劑量組小鼠肝糖原含量分別為空白組的2.11 倍和2.20 倍，差異極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，PDII可以提高小鼠體內(nèi)肝糖原的儲備能力，進(jìn)而維持小鼠運(yùn)動時(shí)的血糖濃度，延緩疲勞。

表3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠的生理生化指標(biāo)Table3 Physiological and biochemical indexes of mice from all groups

當(dāng)糖原儲存不足時(shí)，蛋白質(zhì)會被分解以提供能量。蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基酸，進(jìn)一步代謝產(chǎn)生NH3和CO2，導(dǎo)致肝臟中尿素的合成，并通過血液循環(huán)和腎臟將尿素排出體外[26-27]。在正常生理?xiàng)l件下，尿素的形成和排泄保持平衡。然而，在長時(shí)間運(yùn)動時(shí)，為了滿足能量需求，蛋白質(zhì)的代謝顯著增加，因此尿素水平顯著上升，過量的尿素會在體內(nèi)積累并對機(jī)體造成危害。血清尿素氮濃度能體現(xiàn)尿素水平的高低，并與運(yùn)動耐力呈負(fù)相關(guān)[28]。丙二醛是細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化產(chǎn)物，被認(rèn)為是脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)[29]，在疲勞狀態(tài)下，丙二醛濃度升高[30]。另外，高強(qiáng)度或長時(shí)間運(yùn)動會增加肌肉的氧氣消耗，導(dǎo)致缺氧，加速糖酵解，并產(chǎn)生大量的酸性物質(zhì)，如乳酸。這些變化降低了肌肉的pH值和收縮性，改變了體內(nèi)酸堿平衡，并降低其運(yùn)動能力[31-32]。因此，乳酸的積累也是身體疲勞的重要因素[33]。由表3可知，與空白組相比，中、高劑量松仁蛋白肽極顯著降低血清尿素氮、丙二醛和乳酸濃度（P＜0.01），具有較強(qiáng)的抗疲勞能力，表明PDII具有降低體內(nèi)血清尿素氮、丙二醛和乳酸濃度的效果，可以起到延緩疲勞的作用。

3 結(jié) 論

本研究利用兩步酶解法獲得具有抗氧化活性和抗疲勞活性的酶解產(chǎn)物。通過超濾、SP Sephadex C-25、Sephadex G-25分離得到組分PDII，對組分PDII分子質(zhì)量分布進(jìn)行測定，最終鑒定出PDII的分子質(zhì)量分布范圍為500～1 100 Da。該組分的羥自由基和DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，并且其低、中、高劑量都有維持血糖濃度、提高肝糖原的儲備能力和降低血清尿素氮、丙二醛和乳酸濃度的作用，中、高劑量的PDII具有顯著的抗疲勞作用。