超高效液相色譜質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測量不確定度評定

◎ 肖聰偉

（江西省食品檢驗檢測研究院，江西 南昌 330001）

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters Xevo?TQ-S超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、Buchi R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、Organomation N-EVAP氮吹儀、Sartorius QUINTIX124-1CN電子天平。

1.2 樣液制備

本試驗選取市場購買草魚作為試驗樣品。稱取5.00 g已搗碎樣品于50 mL離心管中，加入200 μL內(nèi)標溶液，加入11 mL乙腈提取，超聲振蕩提取2 min，8 000 r·min-1勻漿提取 30 s，4 000 r·min-1離心 5 min，吸取上清液，殘渣再加入11 mL乙腈重復提取1次，合并上清液，并用乙腈定容至25 mL。取出其中5 mL過中性氧化鋁柱，收集流出液，用4 mL乙腈洗脫，收集合并洗脫液和流出液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用1.0 mL 5 mmol·L-1乙酸銨溶液定容2 mL，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后供UPLC-MS/MS進樣分析。

儀器測定條件參照GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》中內(nèi)容設置，試驗設計采用陰性樣品加標試驗來評定方法的測量不確定度。

1.3 計算公式

試樣中孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫的含量均按公式（1）進行計算。

式（1）中，X表示試樣中目標物的含量，單位為μg·kg-1；C表示樣液中目標物的濃度，單位為ng·mL-1；V表示被測液定容體積，單位為mL；M表示樣品質(zhì)量，單位為g；f表示稀釋因子。

2 測量不確定度的來源分析及測量數(shù)學模型的建立[1]

被測組分含量的測定測量不確定度來源如圖1所示，包括以下5個方面：①樣品稱量質(zhì)量引入的測量不確定度。②樣品定容體積引入的測量不確定度。③樣品提取液測定濃度引入的測量不確定度。包括采用最小二乘法擬合標準工作曲線求得樣品濃度過程中所引入的測量不確定度、標準儲備液制備引入的測量不確定度。標準儲備液制備過程中的測量不確定度由標準品的測量不確定度、天平的允差、容量瓶體積的測量不確定度組成。④平均回收率引入的測量不確定度。⑤測試過程中因?qū)嶋H操作引入的測量不確定度，由重復進行的加標樣品的精密度和準確度來體現(xiàn)。測量不確定度來源因果圖見圖1。

圖1 測量不確定度來源因果圖

3 測量不確定度評定[2-4]

3.1 樣品稱量質(zhì)量引入的測量不確定度

稱取樣品質(zhì)量的測量不確定度主要來源于天平校準和稱量中的重復性。天平校準所引入的測量不確定度為±0.2 mg，采用矩形分布處理，其標準測量不確定度為：

每個樣品測試稱取2平行樣，由于涉及樣品的兩次獨立稱量，因此天平稱量產(chǎn)生的標準測量不確定度為：

3.2 定容體積引入的測量不確定度

樣品定容體積的測量不確定度主要由移液管的校準和溫度變化引起。

3.2.1 移液管的校準引入的測量不確定度

在操作步驟中定容使用到1 mL的移液器。根據(jù)計量校準證書給出的校準技術(shù)指標，1 mL移液器在20 ℃時容量相對誤差u1(V)2=0.1%（0.001 mL），重復性偏差u2(V)2=0.6%（0.006 mL）。

3.2.2 溫度變化引入的測量不確定度

實驗室的溫度控制在（20±4）℃范圍內(nèi)，溫度變化引入的測量不確定度按矩形分布處理，其標準測量不確定度為：

1 mL移液器引入的體積測量不確定度：

由于定容過程使用3次移液器，則體積測量不確定度：

合成上述測量不確定度分量，則樣品定容體積引入的相對標準測量不確定度為：

3.3 樣品提取液濃度計算引入的測量不確定度

3.3.1 校準曲線擬合

利用校準曲線計算樣品中目標物的含量。使用配制的100 μg·mL-1標準溶液稀釋兩個梯度級別后，配制5個混合標準工作曲線溶液，其濃度分別為 1、2、5、10、20 ng·mL-1，每個濃度分別測定 1次，使用線性最小二乘法以色譜峰面積對待測物濃度進行線性擬合，得到線性方程分別為：孔雀石綠Y=0.853683C-0.224836，結(jié)晶紫Y=3.01321C-0.235291，隱性孔雀石綠Y=1.16301C-0.472361，隱性結(jié)晶紫Y=0.31629C-0.242142，5個校準標準溶液測量結(jié)果見表1。

表1 不同濃度下的響應值表

3.3.2 樣品提取液濃度測定引入的測量不確定度

3.3.2.1 標準曲線擬合測量不確定度

對陰性樣品按加標量10.0 ng·g-1分別進行3次加標試驗，測定結(jié)果平均值為：孔雀石綠4.988 ng·mL-1；結(jié)晶紫 4.741 ng·mL-1；隱色孔雀石綠 5.093 ng·mL-1；隱色結(jié)晶紫5.074 ng·mL-1，由校準曲線所帶來的測量不確定度可由式（2）計算。

式（2）中，u1(C)表示待測溶液濃度C的測定測量不確定度；S表示殘差標準偏差；C表示樣品加標后檢測平均值；表示不同標準溶液濃度的平均值（共測量n次）；B1表示擬合曲線中的斜率；P表示樣品平行的測定次數(shù)；n表示標準溶液測定的次數(shù)；Scc示離均差平方和。

其中：

孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色孔雀石綠和隱色結(jié)晶紫的殘差標準偏差和離均差平方和計算見表2～5。

因此，校準曲線擬合計算中各參數(shù)匯總見表6。

表2 孔雀石綠的殘差標準偏差和離均差平方和表

表3 結(jié)晶紫的殘差標準偏差和離均差平方和表

表4 隱色孔雀石綠的殘差標準偏差和離均差平方和表

表5 隱色結(jié)晶紫的殘差標準偏差和離均差平方和表

表6 校準曲線擬合計算中各參數(shù)匯總表

3.3.2.2 標準儲備溶液和中間使用液濃度測量不確定度

實際測量過程中，標準使用液配制如下：利用校準曲線計算樣品中孔雀石綠等的含量。使用標準儲備溶液（濃度偏差為0.05%）分稀釋兩次配制5個標準工作溶液。

配制過程中，由于稀釋產(chǎn)生的測量不確定度遠小于標準曲線擬合所帶入的測量不確定度，因此將此類測量不確定度忽略不計。

因此，樣品提取液測量濃度引入的測量不確定度為：

3.4 儀器精密度的相對標準測量不確定度u′（精密度）

用5 ng·mL-1的標品，重復進樣6次，峰面積數(shù)據(jù)及RSD見表7。

表7 重復性測試體現(xiàn)儀器的精密度表

3.5 測定過程準確度的相對標準測量不確定度u′（準確度）

對3個樣品分別進行加標回收率試驗，體現(xiàn)測定方法過程準確度的相對標準測量不確定度，加標結(jié)果回收率見表8。

表8 加標回收測試體現(xiàn)的相對標準測量不確定度表

孔雀石綠：

準確度的相對標準測量不確定度：

結(jié)晶紫：

準確度的相對標準測量不確定度：

隱色孔雀石綠：

準確度的相對標準測量不確定度：

隱色結(jié)晶紫：

準確度的相對標準測量不確定度：

4 合成標準測量不確定度及擴展測量不確定度

4.1 孔雀石綠的合成標準測量不確定度及擴展測量不確定度計算

孔雀石綠的相對標準測量不確定度分量見表9。

表9 孔雀石綠的相對標準測量不確定度分量匯總表

根據(jù)：

則合成測量不確定度為：

一般情況下，按照慣例，測量結(jié)果的擴展測量不確定度取包含擴展因子k，則擴展測量不確定度：Urel=k×u'(x)。

在95%置信概率下，k=2，因此，擴展測量不確定度U=0.925×2=1.85 μg·kg-1，則樣品中孔雀石綠含量的測量結(jié)果應表示為χ=(9.976±1.85)μg·kg-1。

4.2 隱色孔雀石綠的合成標準測量不確定度及擴展測量不確定度計算

隱色孔雀石綠的相對標準測量不確定度分量見表10。

表10 隱色孔雀石綠的相對標準測量不確定度分量匯總表

根據(jù)：

則合成測量不確定度為：

在95%置信概率下，k=2，因此，擴展測量不確定度U=0.776×2=1.550 μg·kg-1，則樣品中隱色孔雀石綠的含量測量結(jié)果應表示為χ=(10.186±1.550)μg·kg-1。

4.3 結(jié)晶紫的合成標準測量不確定度及擴展測量不確定度計算

結(jié)晶紫的相對標準測量不確定度分量見表11。

表11 結(jié)晶紫的相對標準測量不確定度分量匯總表

根據(jù)：

則合成測量不確定度：

在95%置信概率下，k=2，因此，擴展測量不確定度U=0.451×2=0.902 μg·kg-1，則樣品中結(jié)晶紫含量測量結(jié)果應表示為χ=(9.482±0.902)μg·kg-1。

4.4 隱色結(jié)晶紫的合成標準測量不確定度及擴展測量不確定度計算

隱色結(jié)晶紫的相對標準測量不確定度分量見表12。

表12 隱色結(jié)晶紫的相對標準測量不確定度分量匯總表

根據(jù)：

則合成測量不確定度為：

在95%置信概率下，k=2，因此，擴展測量不確定度U=0.398×2=0.796 μg·kg-1，則樣品中隱色結(jié)晶紫含量測量結(jié)果應表示為χ=(10.148±0.796)μg·kg-1。

5 結(jié)果與討論

本實驗基于國家標準方法GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》的原理，利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量進行檢測。通過對測定方法中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行分析，分析測量不確定度的主要來源，建立測量不確定度評估模型，通過計算，最終得出各待測組分的擴展測量不確定度。

結(jié)果表明：在本試驗條件下，選擇95%置信概率，孔雀石綠含量測量結(jié)果應表示為χ=(9.976±1.85)μg·kg-1，隱色孔雀石綠的含量測量結(jié)果應表示為：χ=(10.186±1.550)μg·kg-1，結(jié)晶紫含量測量結(jié)果應表示為：χ=(9.482±0.902)μg·kg-1，隱色結(jié)晶紫含量測量結(jié)果應表示為：χ=(10.148±0.796)μg·kg-1。其中，各待測組分的測量不確定度主要來源于樣品提取液濃度測定，而加標回收、樣品定容體積、重現(xiàn)性、稱取樣品質(zhì)量對測量不確定貢獻相對較小。