桂林市售（用）腌菜亞硝酸鹽含量及其細(xì)菌豐富度檢測(cè)

◎ 陳玉怡，廖英琛，廖 睿，嚴(yán)金琳，陸祖軍

（廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006）

腌菜歷來(lái)是我國(guó)居民喜愛(ài)的配菜和開(kāi)胃品。隨著對(duì)腌菜抗菌、抗癌、抗衰老以及減肥等保健功能的認(rèn)識(shí)[1]，腌菜產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，形成了“小產(chǎn)品、大市場(chǎng)”的格局[2]。腌菜一般采用自然厭氧發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)品的亞硝酸鹽含量、微生物種類組成和豐度成為腌菜質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是消費(fèi)者、學(xué)者的關(guān)注點(diǎn)。生書(shū)晶報(bào)道韓國(guó)泡菜中的乳酸菌達(dá)30多種[3]。張宗舟等對(duì)泡菜生產(chǎn)過(guò)程中的微生物進(jìn)行區(qū)系分析，證實(shí)泡菜發(fā)酵是一種特殊的混菌共酵，乳酸菌、醋酸菌起主要作用，丁酸菌、酵母菌起輔助作用[4]。

桂林市地處東經(jīng) 109°36′50″～ 111°29′30″，北緯24°15′23″～ 26°23′30″，屬亞熱帶季風(fēng)氣候。當(dāng)?shù)鼐用裼绕淦珢?ài)作為腌菜，市售產(chǎn)品主要由當(dāng)?shù)貜S家、作坊生產(chǎn)，但至今尚無(wú)桂林市售腌菜產(chǎn)品的安全質(zhì)量狀態(tài)研究和報(bào)道。本項(xiàng)目用鹽酸萘乙二胺分光光度法測(cè)定桂林市售腌菜產(chǎn)品的亞硝酸鹽含量，以高通量測(cè)序法對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析，旨在為桂林在售（用）腌菜的安全性評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

以包裝方式（袋裝、罐裝、散裝）為樣品選取主依據(jù)，各目標(biāo)包裝方式下隨機(jī)選取6種產(chǎn)品共18個(gè)樣品（見(jiàn)表1）。對(duì)全部樣品進(jìn)行亞硝酸鹽測(cè)定，用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)9個(gè)樣品的細(xì)菌及豐度。

表1 醬腌菜樣品基礎(chǔ)信息表

1.2 亞硝酸鹽含量測(cè)定

1.2.1 試劑

飽和硼砂溶液；106 g·L-1亞鐵氰化鉀水溶液；磺胺溶液（磺胺1 g+25 mL濃鹽酸，加蒸餾水稀釋至100 mL）；萘胺溶液（0.1 g萘胺+0.5 mL濃鹽酸，加蒸餾水稀釋至50 mL）；220 g·L-1乙酸鋅水溶液

1.2.2 儀器和設(shè)備

TU-1810SPC 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；YP5002 電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2.3 步驟

檢測(cè)步驟參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.33-2016）[5]。

取50 g樣品，加蒸餾水至200 mL，勻漿；取50 mL勻漿，用80 ℃的溫水洗入250 mL錐形瓶，加入6.5 mL飽和硼砂溶液，搖勻；沸水浴30 min，取出錐形瓶置于冷水中冷卻至室溫；加1 g碳粉，2 mL亞鐵氰化鉀溶液，2 mL乙酸鋅于錐形瓶中，振搖3～5 min，調(diào)節(jié)pH1～2，用二次蒸餾水定容至250 mL，搖勻；分裝到3支膠管中離心（2 500 r·min-1，10min）；取3支試管分別加入2 mL樣液上清，4 mL磺胺，搖勻后放置5 min，加入4 mL萘胺；反應(yīng)30 min，于520 nm處進(jìn)行紫外分光光度測(cè)定；每個(gè)樣品同時(shí)測(cè)定3份，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

1.3 細(xì)菌種類多樣性及其豐度測(cè)定

選取18個(gè)樣品中的9個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。提取樣品總DNA后，將細(xì)菌16 S rDNA （V3+V4）區(qū)域 引 物（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'、806R：5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3） 末 端 加上測(cè)序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化，形成測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)合格后用Illumina HiSeq 2500進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌菜亞硝酸鹽含量測(cè)定結(jié)果

18個(gè)腌菜樣品中亞硝酸鹽含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 18個(gè)樣品亞硝酸鹽含量及其含水量表

由表2可知，散裝樣品的亞硝酸鹽含量平均值最低，其次是袋裝，最高者為罐裝。罐裝的醬香木瓜（G06）亞硝酸鹽含量為（25.67±0.56）mg·kg-1，超過(guò)了國(guó)家醬腌菜食品安全標(biāo)準(zhǔn)20 mg·kg-1。

2.2 細(xì)菌多樣性

2.2.1 UPGMA分析

Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean是一種常用非加權(quán)組平均聚類分析方法，可為樣品層次聚類，結(jié)果如圖1、圖2。

圖1 非加權(quán)組平均聚類圖

圖2 加權(quán)組平均聚類圖

圖1的分析結(jié)果顯示，在不同時(shí)考察物種有無(wú)及豐度時(shí)，同種包裝的細(xì)菌物種的類型相似。在同時(shí)考察物種有無(wú)和豐度時(shí)（圖2），散裝腌菜的細(xì)菌物種的類型相似性沒(méi)有變化，罐裝與袋裝者的細(xì)菌物種類型發(fā)生了變化。

2.2.2 樣品各分類等級(jí)物種統(tǒng)計(jì)分析

表3為樣品各分類等級(jí)物種統(tǒng)計(jì)表，顯示了9個(gè)腌菜樣品細(xì)菌各分類等級(jí)物種類型數(shù)目。

表3 樣品各等級(jí)物種統(tǒng)計(jì)表

除界、門之外的其他5個(gè)層級(jí)，袋裝樣品所含細(xì)菌種類數(shù)量最多，罐裝次之，散裝樣品最少。

2.2.3 物種分布

圖3、4分別為樣品細(xì)菌群落屬、門水平物種分布比例。一種顏色代表一個(gè)物種，色塊長(zhǎng)度表示物種所占相對(duì)豐度比例；為使視圖效果最佳，只顯示豐度水平前十的物種，并將其他物種合并為 Others 在圖中顯示，Unclassified代表未得到分類學(xué)注釋的物種。

圖3 屬水平物種分布圖

圖 4 門水平物種分布圖

在屬水平上（圖3），檢測(cè)的9個(gè)腌菜樣品的優(yōu)勢(shì)微生物為乳桿菌屬（Lactobacillus）、不動(dòng)桿菌屬（Acinctobacter）、弓（形）桿菌屬（Arcobacter）、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、酸桿菌屬（Acctobacter）、大腸桿菌志賀菌（Escherichia-Shigella）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。以蔬菜食材、食鹽、飲用水為主要材料的腌菜（罐裝品味鮮老壇豇豆（G03）、袋裝鄧仕魚(yú)酸菜（D03）、散裝的酸筍（S01）和酸菜（S03））其乳酸菌屬占69.24%～97.89%。散裝藠頭（S02）細(xì)菌種類最多，達(dá)9類。從門水平（圖4）看，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）是檢測(cè)的9個(gè)樣品中優(yōu)勢(shì)菌群，它們?yōu)楹醚趸蚣嫘约?xì)菌。

2.2.4 樣品亞硝酸鹽含量與其細(xì)菌物種豐富度相關(guān)性

Alpha多樣性反映的是單個(gè)樣品物種豐富度及物種多樣性；Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐富度即物種數(shù)量的多少；Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。OTU的覆蓋率反映本次測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況，覆蓋率越高，則樣本中物種被測(cè)出的概率越高。本項(xiàng)目使用Mothur（version v.1.30）軟件進(jìn)行樣品的Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)和評(píng)估，結(jié)果如表4。

表4 AIpha多樣性指數(shù)與樣品亞硝酸鹽含量的比較表

將表中的樣品亞硝酸鹽含量（干重）與Simpson指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)為0.554 7，呈正相關(guān)關(guān)系，隨著樣品亞硝酸鹽含量增加，其細(xì)菌多樣性的降低（如表5）。

表5 AIpha多樣性指數(shù)值與樣品亞硝酸鹽含量相關(guān)性分析表

3 討論

3.1 亞硝酸含量分析

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 5009.33-2016）規(guī)定，醬腌菜的亞硝酸鹽含量不得超過(guò)20 mg·kg-1（濕重）。所檢測(cè)的桂林市在售（用）18個(gè)腌菜產(chǎn)品中只有罐裝木瓜（G06）的亞硝酸鹽含量為（25.67±0.56）mg·kg-1（濕重），超標(biāo)28.4%，超標(biāo)樣品是樣品總數(shù)的5.56%。新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所檢測(cè)的蘿卜和白菜兩類泡菜14個(gè)樣品中有9個(gè)樣品的亞硝酸鹽含量超標(biāo)，超標(biāo)率為64.3%[6]；蘭州市、白銀市、通渭市的198份醬腌菜超標(biāo)率為5.56%[7]。江蘇省沭陽(yáng)縣市場(chǎng)銷售散裝、袋裝的4個(gè)鹽腌菜產(chǎn)品共423份發(fā)現(xiàn)超標(biāo)率為4.26%[8]。從亞硝酸含量角度，桂林市在售（用）腌菜還是相對(duì)比較安全的。

亞硝酸鹽的積累是泡菜生產(chǎn)及儲(chǔ)備過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題。本研究中不同包裝類型的腌菜亞硝酸鹽含量不同，散裝者平均值最低，其次是袋裝，最高者為罐裝。此可能與其制備、出售時(shí)的密封程度及產(chǎn)品內(nèi)硝化菌等好氧菌豐度有關(guān)，因?yàn)槿芙庋鯘舛扰c硝化酶（由硝化菌等好氧菌產(chǎn)生）活性對(duì)亞硝酸降解起決定作用[9]；但本研究中硝化菌并不是是任何一個(gè)樣品的優(yōu)勢(shì)菌群，證明研究對(duì)象在制備過(guò)程及貨架期內(nèi)滿足厭氧條件（密閉性），或有氧條件（對(duì)于散裝腌菜）是短暫的。厚壁菌門的乳酸菌類群代謝過(guò)程中產(chǎn)生乳酸引起低pH值，在亞硝酸鹽酸降解過(guò)程中起關(guān)鍵作用[10]。因此本研究中不同包裝腌菜的亞硝酸鹽含量（濕重）差異，可與乳酸菌群及其厭氧產(chǎn)酸量（或者濃度）有關(guān)。

3.2 細(xì)菌多樣性分析

隨機(jī)抽取18個(gè)樣品中的9個(gè)，進(jìn)行高通量測(cè)序，檢測(cè)其中細(xì)菌多樣性，結(jié)果顯示，除界、門之外的其他5個(gè)層級(jí)，袋裝樣品所含細(xì)菌種類數(shù)量最多，罐裝次之，散裝樣品最少，是否與產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程及包裝方式的無(wú)氧程度及無(wú)氧時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。散裝腌菜為當(dāng)?shù)毓S或作坊生產(chǎn)，一直處于完全浸泡狀態(tài)，售出時(shí)點(diǎn)離出廠時(shí)點(diǎn)不超過(guò)6 h，有的甚至是出售時(shí)仍處于厭氧發(fā)酵條件，因此受雜菌污染的概率較低。

3.3 食材對(duì)細(xì)菌豐富度的影響分析

本研究對(duì)象中厚壁菌門、變形菌門為優(yōu)勢(shì)門。除了藠頭（S02，石蒜科植物），以其他食材制備的腌菜乳酸菌屬占69.24%～97.89%，以禾本科和十字花科植物（如竹筍、芥菜）為發(fā)酵底物者，乳酸菌屬占比最高。乳酸菌厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)酸抑制非耐酸菌群如許多致病菌和腐敗菌的生長(zhǎng)，是腌菜保質(zhì)、提高風(fēng)味的重要因素[11]。禾本科和十字花科植物腌制時(shí)乳酸菌屬占比最高，證明此食材最合適乳酸菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)，其泌酸抑雜菌的能力最強(qiáng)，對(duì)條件致病性細(xì)菌，如本研究中優(yōu)勢(shì)菌群不動(dòng)桿菌屬、弓（形）桿菌屬、克雷伯菌屬以及大腸桿菌志賀菌（圖3）有較強(qiáng)的抑制作用；所以，從此角度分析，禾本科和十字花科植物食材（如竹筍、芥菜）腌制的菜品，直接食用時(shí)比其他菜品相對(duì)安全；石蒜科植物食材如藠頭（S02）腌菜存在較高比例的條件致病性細(xì)菌，如不經(jīng)高溫滅菌即食用，有較高被感染致病病原菌的風(fēng)險(xiǎn)。