廣州市腹瀉患者Aichi病毒的檢測(cè)及基因型

文羽祺 陳雪姣 肖剛 何文巧 葉育華 李泳枝 陳清

1南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)系（廣州 510515）；2南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（廣州 510630）

腹瀉（Diarrhea）是指每日排便次數(shù)超過(guò)3次（或平日習(xí)慣的頻率），糞便稀薄，水分增加，排便量超過(guò)200 g（WHO）。在發(fā)展中國(guó)家，腹瀉是五歲以下兒童的主要死因之一［1］，也是增加國(guó)家負(fù)擔(dān)的重要疾病之一［2?4］。感染是腹瀉的主要病因，尤其以病毒感染最為常見(jiàn)，引起腹瀉的病毒有輪狀病毒，諾如病毒，腺病毒，星狀病毒等。

Aichi病毒屬于小RNA病毒科、Kobu病毒屬，是單正鏈RNA病毒。根據(jù)Aichi病毒3C/D區(qū)序列的差異性可把其分為A、B和C三個(gè)基因型，其中A基因型與B基因型的同源性約為90%。Aichi病毒于1989年在一例食用牡蠣而腹瀉的患者糞便標(biāo)本中首次發(fā)現(xiàn)［5］。隨后在印度，芬蘭，德國(guó)，澳洲，泰國(guó)等多個(gè)國(guó)家也有檢出該病毒［6?11］。在我國(guó)的蘭州，福建，上海，北京以及新疆地區(qū)的腹瀉患者糞便中也有 Aichi病毒的檢出［12?15］。相比于其他致腹瀉病毒，Aichi病毒的檢出率較低（0.5%～4.1%）［8］，然而，多國(guó)均有報(bào)道成年人血清中Aichi病毒抗體陽(yáng)性率高達(dá)80% ～ 99%［16?17］，表明該病毒的感染比較普遍。因此，有關(guān)Aichi病毒與腹瀉的關(guān)系有必要進(jìn)行更多的研究。目前廣東省人群的病毒腹瀉發(fā)病率較高［18?19］，但目前尚未見(jiàn) Aichi病毒檢出的報(bào)道。為了解廣州市腹瀉患者中Aichi病毒的攜帶情況，我們開(kāi)展了為期4年的基于醫(yī)院腹瀉病人的Aichi病毒監(jiān)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本從2015年1月到2018年1月，采集南方醫(yī)科大學(xué)某附屬醫(yī)院腹瀉病人的糞便標(biāo)本共1 002份。在收集樣本的同時(shí)，讓病人或患兒監(jiān)護(hù)人知情同意并填寫調(diào)查問(wèn)卷。

1.2 試劑、儀器病毒RNA提取試劑Trizol（Invit?rogen）、氯仿、異丙醇、DEPC（SIGAM）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche）；PCR試劑GoTaq Green Master Mix（Pro?mega）；PCR 儀（SureCycler8800）；Gel Doc 1000 凝膠成像儀（Bio?Rad）。

1.3 病毒RNA提取利用Trizol法提取糞便標(biāo)本中的病毒RNA，將所獲得的RNA標(biāo)記好并保存于?80℃冰箱。

1.4 RT?PCR分子鑒定將提取的病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。通過(guò)利用引物對(duì)（6261，6779：F5’?ACACTCCCACCTCCCGCCACTA?3’；R5’?GGAAGAGCTGGCTGTCAAGA?3’）擴(kuò)增 Aichi病毒的3C/D區(qū)［5］，得到519 bp產(chǎn)物片段。經(jīng)凝膠電泳成像，所得到的可疑陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序以確認(rèn)其陽(yáng)性情況。

1.5 基因序列分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建將測(cè)序結(jié)果通過(guò) Blast，BioEdit，MEGA X 等軟件進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。參考序列均來(lái)源于GenBank中Aichi病毒全序或部分片段。

2 結(jié)果

2.1 凝膠電泳經(jīng)3C/D區(qū)RT?PCR的擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物，通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)陽(yáng)性樣本。陽(yáng)性樣本的凝膠電泳圖如圖1。

圖1 GZ1998和GZ2206凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of GZ1998 and GZ2206

2.2 Aichi病毒的檢測(cè)情況

2.2.1 Aichi病毒的季節(jié)分布2015年至2018年每月腹瀉患者糞便樣本的采集情況以及Aichi病毒的檢出情況如下表1。

表1 2015年1月至2018年1月各月份Aichi病毒在腹瀉患者糞便中的檢測(cè)情況Tab.1 Detection of Aichi Virus in stool samples of diarrhea patients from Jan.2015 to Jan.2018

2.2.2 Aichi病毒陽(yáng)性樣本檢出情況在1 002份腹瀉病人的糞便標(biāo)本中，檢出2例Aichi病毒陽(yáng)性，檢出率為0.2%。其中1例Aichi病毒陽(yáng)性標(biāo)本（GZ1998）來(lái)自一位36周歲的成年男子，采集時(shí)間為2017年3月8日，臨床癥狀有腹瀉、腹痛、腹脹、38°C低熱、乏力、食欲不振，有在外就餐史并且有食用海產(chǎn)品，該病例同時(shí)合并諾如病毒感染；而另1例（GZ2206）來(lái)源于一位3歲腹瀉兒童，采集時(shí)間為2017年7月28日，其臨床診斷為“腹瀉病”，除了腹瀉腹痛無(wú)任何其他臨床癥狀，無(wú)合并其他病毒感染，見(jiàn)表2。

表2 Aichi病毒陽(yáng)性病例的基本特征Tab.2 Characteristics of positive Aichi virus cases

2.3 核酸序列測(cè)定、比對(duì)與基因分析結(jié)果本研究中的兩例陽(yáng)性樣本，GZ1998與GZ2206，的核苷酸序列以及其推導(dǎo)的氨基酸序列已登錄到Gen?Bank，其登錄號(hào)分別是 MK071700?MK071701。陽(yáng)性樣本擴(kuò)增的3C/D區(qū)核酸序列通過(guò)Blast軟件與其他Aichi病毒的序列進(jìn)行比對(duì)，其中GZ2206樣本毒株與來(lái)自意大利的Aichi病毒株（KC488326.1）非常相近，其同源性達(dá)到97.1%；而GZ1998樣本毒株與日本的病毒株（EF079154.1）的同源性高達(dá)99.6%。用MEGA X軟件根據(jù)Aichi病毒3C/D區(qū)的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。如圖3所示。結(jié)果顯示，進(jìn)化樹(shù)中的Aichi病毒株主要分為A、B兩個(gè)亞型，其中GZ1998屬于A基因型，而GZ2206屬于B基因型。

圖3 廣州市2株Aichi病毒的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of 2 positive samples of Aichi Virus

3 討論

本研究通過(guò)PCR方法檢測(cè)了某醫(yī)院腹瀉門診4年來(lái)1 002份腹瀉患者糞便標(biāo)本中的Aichi病毒，但僅檢測(cè)出2例Aichi病毒陽(yáng)性樣本，其檢出率為0.2%，國(guó)內(nèi)多數(shù)報(bào)道的檢出率在0.6%～1.8%［13］，國(guó)外報(bào)道Aichi病毒的流行率在0.5%～4.1%，說(shuō)明在腹瀉病例中該病毒的檢出較低。但也有例外，例如我國(guó)新疆地區(qū)2013年報(bào)告檢出率高達(dá)18.4%，這可能與該研究所用的引物不同，導(dǎo)致其擴(kuò)增產(chǎn)物僅有158 bp［15］，而其他研究，包括本研究所擴(kuò)增的產(chǎn)物為519 bp。本研究的結(jié)果與這些結(jié)果相比，檢出率最低，可能是因?yàn)闃颖镜膩?lái)源比較局限，僅來(lái)源于一家醫(yī)院。雖然病毒核酸檢出率低，但多國(guó)均有報(bào)道成年人血清中Aichi病毒抗體的陽(yáng)性率高達(dá) 80% ～ 99%［16?17］，表明普通人群普遍存在該病毒的既往感染。現(xiàn)有的研究結(jié)果提示Aichi病毒感染力較高但對(duì)一般人的致病力較低，多數(shù)感染由于沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)而沒(méi)有就診，而且容易和其他病毒合并感染從而掩蓋了Aichi病毒感染。

本研究中1例陽(yáng)性樣本（GZ2206）來(lái)源于一位3歲的男性兒童，除腹瀉腹痛癥狀外，無(wú)惡心嘔吐，發(fā)燒等癥狀，無(wú)牡蠣食用史，無(wú)寄生蟲(chóng)感染，無(wú)合并其他病毒感染。國(guó)外有研究在環(huán)境中（如下水道和地表水）檢測(cè)到Aichi病毒核酸，并且通過(guò)3C/D區(qū)的PCR擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，檢出率高達(dá)93%［20］。與此同時(shí)，在多數(shù)環(huán)境中檢測(cè)的Aichi病毒樣本均為B基因型。這提示，該Aichi病例可能是從周圍環(huán)境中感染Aichi病毒。需要在環(huán)境中檢測(cè)Aichi病毒核酸的相關(guān)研究以證實(shí)。本研究的另1例陽(yáng)性樣本（GZ1998）來(lái)自一位36歲的成年腹瀉男子，該患者不僅伴有發(fā)熱、腹痛、乏力、食欲不振等癥狀，同時(shí)在近期食用過(guò)海產(chǎn)品。以往研究表明，Aichi病毒感染與食用海鮮（如：牡蠣）有關(guān)，且此類研究中所報(bào)道的Aichi病毒多屬A基因型。此外，該病例還合并諾如病毒感染。諾如病毒是引起人類非細(xì)菌性腹瀉的主要原因之一，其主要癥狀包括惡心、嘔吐、發(fā)熱、腹痛和腹瀉［21?22］。該病人的癥狀基本上符合諾如病毒感染的臨床表現(xiàn)，而其出現(xiàn)的乏力與食欲不振癥狀可能是兩種病毒合并感染所導(dǎo)致的。兩個(gè)病例的發(fā)病時(shí)間一個(gè)在3月另一個(gè)在7月，與廣州其他報(bào)道的常見(jiàn)致瀉性病毒的發(fā)病有明顯季節(jié)性不同［23］，目前的結(jié)果無(wú)法證明Aichi病毒的檢在時(shí)間上有季節(jié)規(guī)律。

通過(guò)Blast結(jié)果表示，本研究中Aichi病毒株GZ2206和來(lái)自意大利的病毒株同源性高達(dá)97.1%。它同時(shí)也與幾株來(lái)源于中國(guó)和澳大利亞的病毒株有很高的同源性。根據(jù)序列分析和基因進(jìn)化分析結(jié)果，本研究的病毒株GZ2206與來(lái)自福建、蘭州、上海、北京等中國(guó)地區(qū)以及澳大利亞、意大利的Aichi病毒株聚為一簇，表明其同源性高，可能來(lái)源于同一個(gè)祖先。而病毒株GZ1998和來(lái)自日本的多個(gè)病毒株具有很高的同源性，表明該病毒株和日本流行的病毒株有較親近的關(guān)系。該病例食用過(guò)海產(chǎn)品，懷疑該病毒株可能來(lái)源于受病毒污染的海產(chǎn)品。

本次研究證實(shí)，廣州市首次檢測(cè)出A、B兩種基因型的Aichi病毒，并且首次在中國(guó)內(nèi)地檢出A基因型的Aichi病毒。目前廣東省內(nèi)沒(méi)有該病毒的流行，但是由于本次的樣本采集地點(diǎn)和人群較為局限，還需要更廣泛的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)廣東省內(nèi)Aichi病毒流行情況進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。