Fibulin?3在膀胱癌組織中的表達及臨床意義

陶曉峰 劉暢 付明杰 白艷 孟津伊 宋波

大連市中心醫(yī)院1病理科，2風(fēng)濕免疫科（遼寧大連116033）；3大連醫(yī)科大學(xué)病理教研室（遼寧大連116044）

膀胱癌又稱為浸潤性尿路上皮癌（infiltrating urothelial carcinoma），其發(fā)病率位列我國男性惡性腫瘤的第7位。分為非肌層浸潤性膀胱癌（non?muscle?invasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤 性 膀 胱 癌（muscle?invasive bladder cancer，MIBC），75%～85%的患者在確診時處于Ta～T1期［1］。然而NMIBC復(fù)發(fā)率高，且10% ～20%的Ta～T1期膀胱癌最終會進展為 MIBC［2］。盡管NMIBC的5年生存率高達88%～98%，但是發(fā)生肌層浸潤后其生存率可下降至63%。目前的膀胱癌治療監(jiān)測主要包括膀胱鏡檢查和尿液細胞學(xué)，但是仍有可能漏診乳頭瘤和原位癌［3］。目前為止除了尿液細胞學(xué)以外，缺乏很好的無創(chuàng)檢查方法［4］。

Fibulin?3，也叫 EFEMP1（epidermal growth fac?tor?containing fibulin?like extracellular matrix protein 1），是一種細胞外基質(zhì)糖蛋白，在體內(nèi)廣泛表達，上皮細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等各種細胞都能夠表達和分泌Fibulin?3，F(xiàn)ibulin?3定位在密集間充質(zhì)和上皮及內(nèi)皮細胞基膜［5］。Fibulin?3在細胞外基質(zhì)中具有構(gòu)架作用，另外還能夠活化下游信號通路，比如表皮生長因子受體［6］。與研究廣泛的Fibulin?1和Fibulin?2相比，對Fibulin?3的功能仍知之甚少。Fibulin?3在多種實體腫瘤中異常表達，F(xiàn)ibulin?3既是腫瘤促進因子，也是腫瘤抑制因子，但是其在膀胱癌中的相關(guān)研究較少。本研究將探討Fibulin?3在膀胱癌組織中的表達情況及其與腫瘤分期及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本收集60例膀胱癌石蠟包埋標本選自2008年至2016年于大連市中心醫(yī)院手術(shù)治療的膀胱癌患者，患者均有完整的病歷記錄和病理資料，病理診斷均為浸潤性尿路上皮癌；年齡39～81歲，中位年齡62歲。正常對照選取距離腫瘤組織0.5 cm以上的膀胱組織。根據(jù)患者的相關(guān)臨床信息進行分組（性別、年齡、有無轉(zhuǎn)移、浸潤深度、分化程度、臨床分期、是否復(fù)發(fā)）。

1.2 抗體與實驗方法Fibulin?3單克隆抗體購自Santa Cruz公司。二抗購自邁新公司。采用免疫組織化學(xué)的方法，檢測膀胱癌及正常膀胱組織中Fibulin?3的表達。

1.3 結(jié)果判斷Fibulin?3定位細胞核，呈棕色顆粒。免疫組化結(jié)果的判讀標準參考陶曉峰等［7］和CHEN等［8］的標準。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用行×列χ2檢驗（SPSS 18.0軟件）；P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌中Fibulin?3的表達Fibulin?3定位在細胞核，呈棕色顆粒狀，從局部或灶性至彌漫性均有，癌旁正常膀胱組織很少見陽性表達，陽性表達以灶性為主（圖1～4）。Fibulin?3在膀胱癌中的陽性表達率高于癌旁正常膀胱組織（P＜0.01）。見表1。

圖1 膀胱癌中Fibulin?3陰性表達（SP法×200）Fig.1 Negative expression of Fibulin?3 in bladder cancer sample

圖2 膀胱癌中Fibulin?3局灶弱表達（SP法×200）Fig.2 Low expression of Fibulin?3 in bladder cancer sample

圖3 膀胱癌中Fibulin?3彌漫中度表達（SP法×100）Fig.3 Moderate expression of Fibulin?3 in bladder cancer sample

圖4 膀胱癌中Fibulin?3強表達（SP法×200）Fig.4 High expression of Fibulin?3 in bladder cancer sample

表1 膀胱癌和正常膀胱組織中Fibulin?3的表達Tab.1 Expression of Fibulin?3 in bladder cancer sample and normal bladder tissues 例（%）

2.2 膀胱癌中Fibulin?3的表達與臨床因素的關(guān)系Fibulin?3在侵及肌層、伴有轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期膀胱癌和復(fù)發(fā)的膀胱癌中陽性表達率分別高于未侵及肌層、無轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期和無復(fù)發(fā)的膀胱癌，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；而與性別、年齡和分化程度之間未見明顯差異，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 膀胱癌中Fibulin?3的表達與臨床因素的關(guān)系Tab.2 Correlation between Fibulin?3 and clinical characteristics in bladder cancer patients 例

3 討論

Fibulins是細胞外基質(zhì)糖蛋白家族成員，由一串鈣結(jié)合表皮生長因子（calcium?binding epidermal growth factor）樣模塊和C端fibulin樣結(jié)構(gòu)域組成。Fibulins主要參與構(gòu)成細胞外基質(zhì)，該家族已知有7個基因型，其中Fibulin?3是調(diào)控細胞的生長及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子，并參與腫瘤的發(fā)生與演進。本實驗表明，F(xiàn)ibulin?3在膀胱癌組織中高表達，并且與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移、分期及復(fù)發(fā)相關(guān)。以往研究證實，F(xiàn)ibulin?3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、宮頸癌、卵巢癌中呈過表達，并與腫瘤進展和不良預(yù)后有關(guān)；而在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、鼻咽癌中Fibulin?3下調(diào)，由于其啟動子的超甲基化，這個超甲基化過程與腫瘤進展及不良預(yù)后有關(guān)［9］。Fibu?lin?3在不同腫瘤中發(fā)揮相反作用的機制尚不明確，可能與其調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo?proteases，MMPs）、血管生成、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以及MAPK、AKT、NOTCH等信號通路有關(guān)［10?11］。

本研究發(fā)現(xiàn)Fibulin?3升高與膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，與以往一些研究結(jié)果一致。國外學(xué)者對159例宮頸癌患者進行分析，發(fā)現(xiàn)Fibulin?3的表達與腫瘤組織的微血管密度（microvascular density，MVD）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的基因水平呈顯著相關(guān)，過表達Fibulin?3與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、血管侵襲和生存率下降顯著相關(guān)，多變量分析顯示Fibulin?3是宮頸癌不良預(yù)后的獨立危險因素［7］。在卵巢癌中同樣證實Fibulin?3呈高表達并與MVD和VEGF相關(guān)，組織和血清中的Fibulin?3過表達與臨床分期、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后正相關(guān)［8］。HU等［12］發(fā)現(xiàn)升高的Fibulin?3與膠質(zhì)瘤侵襲有關(guān)，在膠質(zhì)瘤組織和體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞中Fibulin?3均呈現(xiàn)高表達，而在正常腦組織和培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中則檢測不到Fibulin?3蛋白，過表達和敲除Fibulin?3并未影響膠質(zhì)瘤細胞的形態(tài)或增殖，但是增加了底物特異性細胞黏附，促進了器官培養(yǎng)環(huán)境中的細胞運動和擴散。過表達Fibulin?3的腫瘤組織和體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞中，MMPs（包括 MMP?2/MMP?9 和 ADAMTS?5）的表達及活性明顯增加，提示Fibulin?3參與腫瘤發(fā)展過程可能與MMPs有關(guān)。在胰腺癌中，DNA微陣列雜交實驗顯示，與人胰腺癌細胞系FG細胞相比，F(xiàn)ibulin?3的表達在胰腺癌高轉(zhuǎn)移性細胞株L3.6pl細胞中明顯增加；同時在體內(nèi)實驗中將Fibulin?3轉(zhuǎn)染給FG細胞促進了原位和轉(zhuǎn)移腫瘤的生長，F(xiàn)ibulin?3促進了腫瘤細胞生成VEGF并增加了CD31+微血管，而并未改變內(nèi)皮細胞增殖和遷移，提示Fibulin?3具有間接的血管生成作用［13］。此外，在給予化療藥物吉西他濱、5?氟尿嘧啶和伊立替康時，F(xiàn)ibulin?3減少了腫瘤細胞凋亡并促進了細胞周期進程，提示升高的Fibulin?3與腫瘤耐藥有關(guān)［13］。最新研究證實，F(xiàn)ibulin?3的表達水平在MIBC中顯著高于NMIBC，同時在幾個膀胱癌細胞系中Fibulin?3均被證實與腫瘤浸潤有關(guān)，給膀胱癌小鼠模型敲除Fibulin?3明顯降低了MIBC的發(fā)生率［9］。

在另一些研究中，F(xiàn)ibulin?3則被證實能夠抑制腫瘤進展。TIAN等［14］研究證實，F(xiàn)ibulin?3作為乳腺癌微環(huán)境中的一種分泌性蛋白，能夠有效抑制乳腺癌細胞和內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)移生長因子β（trans?forming growth factor?β，TGF?β）通路，F(xiàn)ibulin?3與TGF?β受體I相互作用，阻斷了TGF?β誘導(dǎo)的TGF?β受體I與TGF?β受體II結(jié)合，進而阻斷了下游TGF?β信號通路；同時在乳腺癌進展過程中，F(xiàn)ibu?lin?3表達減少，低水平Fibulin?3與疾病不良預(yù)后相關(guān)，升高的Fibulin?3能夠抑制TGF?β誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、浸潤和內(nèi)皮通透性，而Fibu?lin?3缺失則能夠促進TGF?β介導(dǎo)的這些效應(yīng)，證實Fibulin?3是乳腺癌微環(huán)境中的一種新的TGF?β信號通路抑制劑。XU等［15］研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織的Fibulin?3基因和蛋白水平均顯著低于正常組織，下調(diào)腫瘤組織的Fibulin?3基因水平會增加Fibulin?3啟動子甲基化，患者的血清Fibulin?3水平與癌癥進展、生存率及循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量密切相關(guān)；此外將肺癌A549細胞轉(zhuǎn)染到Fibulin?3載體上，發(fā)現(xiàn)表達Fibulin?3的肺癌A549細胞增殖率和遷移率顯著降低。研究證實Fibulin?3可通過抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，活化糖原合酶激酶3β，抑制Wnt/β?catenin信號，進而誘導(dǎo)肺癌細胞中與癌癥浸潤相關(guān)的啟動子的MMP?7表達［16］。

SIMSEK等［17］對80例結(jié)腸癌患者進行研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者術(shù)前血清Fibulin?3水平較對照組相比顯著減低，提示其可能作為結(jié)腸癌的一種血清標記物。Fibulin?3也被認為是未來診斷惡性間皮細胞瘤的生物標志物之一［18］。

總結(jié)本研究證實，膀胱癌中Fibulin?3呈高表達，并與膀胱癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為反應(yīng)膀胱癌生物學(xué)行為和判斷預(yù)后的有效指標。