EZH2、p53、Ki?67在結(jié)直腸腺癌及腺瘤組織中的表達(dá)及相關(guān)性探討

胡曉舒 常方方 徐小艷 馮智坤 溫一陽(yáng) 楊金花

1鄭州人民醫(yī)院（鄭州 450000）；2河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校內(nèi)科（鄭州 450000）；3河南省人民醫(yī)院（鄭州 450000）

結(jié)直腸腺癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。近年來(lái)我國(guó)結(jié)直腸腺癌的發(fā)病率和病死率有所上升，分別居惡性腫瘤第4位及第5位，且呈逐年增加的趨勢(shì)［1］。且大部分患者就診時(shí)已處于結(jié)直腸腺癌中晚期，5年生存率不足50%，平均生存期也只有38～42個(gè)月，臨床生存期較短。因此，如何準(zhǔn)確的判斷患者的病情，制定科學(xué)合理的治療方案，判斷患者的預(yù)后就顯得尤為重要。結(jié)直腸腺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)在某種程度上可以滿足這一訴求。

EZH2蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。p53是最早發(fā)現(xiàn)、最重要的抑癌基因，相關(guān)研究表明，野生型p53的突變是很多腫瘤發(fā)生的原因之一，p53突變與p53蛋白高表達(dá)有明顯的相關(guān)性。Ki?67是細(xì)胞核增殖指數(shù)的特異性指標(biāo)，可以客觀地反映腫瘤細(xì)胞的增殖情況。有關(guān)EZH2、Ki?67、p53在結(jié)直腸腺癌中的單一指標(biāo)的研究已見相關(guān)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合研究在結(jié)直腸腺瘤及腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性尚未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在通過(guò)免疫組化法聯(lián)合檢測(cè)EZH2、p53及Ki?67蛋白在結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)合患者的臨床病理因素，分析其相關(guān)性，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師明確診斷；（2）首發(fā)、原發(fā)且無(wú)其他腫瘤，術(shù)前未經(jīng)任何放化療等輔助治療；（3）臨床病理資料完整；（4）無(wú)其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。收集2015年4月至2017年10月符合上述條件的，鄭州人民醫(yī)院普外科手術(shù)切除結(jié)直腸腺癌組織82例（結(jié)直腸腺癌組）、癌旁組織（距癌組織邊緣＞10 cm，即正常組）40例，消化內(nèi)科腸鏡下切除結(jié)直腸腺瘤組織49例（結(jié)直腸腺瘤組）。結(jié)直腸腺癌組：直腸癌37例，結(jié)腸癌45例；男46例，女36例；年齡42～78歲，平均年齡57±10.8歲；腫瘤分化程度高分化27例，中分化43例，低分化12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例；浸潤(rùn)深度T15例，T227例，T325例，T425例；TNM分期Ⅰ期14例，Ⅱ期26例，Ⅲ期37例，Ⅳ期5例。結(jié)直腸腺瘤組：男26例，女23例；年齡38～70歲，平均（54±12.3）歲。正常組：男24例，女16例；年齡38～68歲，平均（52±14.1）歲。3組在年齡、性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 試劑與方法所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，3 μm連續(xù)切片。常規(guī)HE染色，觀察結(jié)直腸黏膜組織的病理形態(tài)。鼠單克隆抗體EZH2購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠單克隆抗體P53、Ki?67及二抗購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化所有組織均經(jīng)石蠟包埋，每個(gè)石蠟塊5 mm連續(xù)切片，脫蠟至水；PBS洗3 min，兩次；抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，進(jìn)行必要的抗原修復(fù)，PBS洗3 min，兩次；滴加第一抗體室溫2 h或4℃過(guò)夜，PBS洗3 min，兩次；滴加第二抗體酶復(fù)合物室溫20～30 min，PBS洗3 min，兩次；DAB顯色5～10 min；水洗終止顯色；復(fù)染細(xì)胞核；分化水洗、返藍(lán)水洗、脫水透明、封固。本研究中采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，采用已知陽(yáng)性片做陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果判斷由病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲法評(píng)測(cè)。EZH2、p53、Ki?67染色主要位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例和陽(yáng)性細(xì)胞胞核著色強(qiáng)度綜合判斷染色結(jié)果。低倍鏡下（×40）觀察著色強(qiáng)度：細(xì)胞未著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；高倍鏡下（×200）觀察陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，取其平均值得出陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分乘積＞4即為陽(yáng)性，≤4即為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3 組間 EZH2、p53、Ki?67蛋白陽(yáng)性表達(dá)率、結(jié)直腸腺癌組臨床病理特征蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)，EZH2、p53、Ki?67蛋白之間的相關(guān)性檢驗(yàn)用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及正常組織中EZH2、p53及Ki?67的陽(yáng)性表達(dá)及比較82例結(jié)直腸腺癌組織中EZH2陽(yáng)性表達(dá)66例，陽(yáng)性率80.49%；p53陽(yáng)性表達(dá)35例，陽(yáng)性表達(dá)率42.68%；Ki?67陽(yáng)性表達(dá)47例，陽(yáng)性率57.31%。49例結(jié)直腸腺瘤組織中EZH2陽(yáng)性表達(dá)20例，陽(yáng)性率40.82%；p53陽(yáng)性表達(dá)3例，陽(yáng)性表達(dá)率6.12%；Ki?67陽(yáng)性表達(dá)13例，陽(yáng)性率26.53%。40例正常組織中EZH2陽(yáng)性表達(dá)2例，陽(yáng)性率5%；p53陽(yáng)性率1.02%；Ki?67陽(yáng)性表達(dá)1例，陽(yáng)性率2.5%。結(jié)直腸腺癌組EZH2、p53及Ki?67的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于腺瘤組和正常組，其結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖1、表1。

2.2 結(jié)直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系EZH2、p53及Ki?67的表達(dá)與腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即隨著腫瘤分化程度的降低，浸潤(rùn)深度加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，3種蛋白的表達(dá)明顯升高，TNM臨床分期晚期患者，蛋白的表達(dá)也明顯增強(qiáng)。EZH2、p53及Ki?67蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與患者的年齡和性別無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。82例結(jié)直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67陽(yáng)性表達(dá)患者與其臨床病理特征之間的關(guān)系，見表2。

圖1 EZH2、P53、Ki67在結(jié)直腸腺癌、腺瘤及正常腸粘膜的表達(dá)（IHC×200）Fig.1 The expression of EZH2，P53 and Ki?67 in colorectal adenocarcinoma，adenoma and nomal tissue

2.3 結(jié)直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67表達(dá)的相關(guān)性EZH2與p53蛋白共同陽(yáng)性32例，共同陰性13例，EZH2蛋白陽(yáng)性而p53蛋白陰性34例，p53蛋白陽(yáng)性而EZH2蛋白陰性3例，Spearman相關(guān)分析呈正相關(guān)（P＜ 0.05）。EZH2與Ki?67蛋白共同陽(yáng)性45例，共同陰性13例，EZH2蛋白陽(yáng)性而Ki?67蛋白陰性21例，Ki?67蛋白陽(yáng)性而EZH2蛋白陰性2例，Spearman相關(guān)分析呈正相關(guān)（P＜0.05）。p53與Ki?67蛋白共同陽(yáng)性30例，共同陰性30例，p53蛋白陽(yáng)性而Ki?67蛋白陰性5例，Ki?67蛋白陽(yáng)性而p53蛋白陰性17例，Spearman相關(guān)分析呈正相關(guān)（P＜ 0.05）。EZH2、p53及Ki?67蛋白在結(jié)直腸腺癌組織中呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。見表3。

表1 結(jié)直腸腺癌、結(jié)直腸腺瘤及正常組織中EZH2、p53及Ki?67的陽(yáng)性表達(dá)及比較Tab.1 The comparison of EZH2,p53 and Ki?67 positive expression in colorectal adenocarcinoma，adenoma and nomal tissue

3 討 論

結(jié)直腸腺癌臨床發(fā)病率、病死率高，但治愈率卻不高，尤其結(jié)直腸腺癌的進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人死亡的一大原因。結(jié)直腸腺癌是多因素作用、多基因參與、多階段調(diào)控的疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不太清楚。

EZH2基因是PcG基因家族重要成員，PcG家族可使許多分化相關(guān)因子沉默，從而抑制細(xì)胞分化［2?3］。EZH2基因可明顯抑制腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移殖，使腫瘤細(xì)胞失控生長(zhǎng)、過(guò)度增殖［4?5］。EZH2 基因在多種腫瘤中高表達(dá)，正常組織中不表達(dá)或少量表達(dá)，如血液系統(tǒng)腫瘤、黑色素腫瘤、膽管癌等。研究［6?8］報(bào)道，EZH2在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中的表達(dá)明顯高于前列腺癌原發(fā)灶的表達(dá)，且其高表達(dá)提示前列腺癌預(yù)后不良，EZH2在浸潤(rùn)性乳腺導(dǎo)管癌中表達(dá)高于乳腺原位癌。CHEN等［9］研究也證實(shí)了EZH2的高表達(dá)可縮短結(jié)直腸癌患者的生存時(shí)間。本研究表明，EZH2基因在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)水平明顯升高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織，在結(jié)直腸腺瘤中中度表達(dá)，兩者之間亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究還發(fā)現(xiàn)，低分化的結(jié)直腸腺癌蛋白表達(dá)明顯高于中分化、高分化；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的蛋白表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，TNM分期中Ⅲ、Ⅳ期EZH2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期，上述結(jié)果差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與張立成等［10］的研究報(bào)道相符。這表明EZH2蛋白的高表達(dá)在結(jié)直腸腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有著非常重要作用，可用于結(jié)直腸腺癌高危人群的篩查，亦可以判斷結(jié)直腸腺癌的預(yù)后。

表2 結(jié)直腸腺癌組織中EZH2、p53及Ki?67的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.2 The relationship with the expression and the clinical pathologic characteristics of EZH2，P53 and Ki?67 in colorectal adenocarcinoma例

表3 EZH2、p53及Ki?67蛋白在結(jié)直腸腺癌中表達(dá)的相關(guān)性Tab.3 The correlation of EZH2，p53 and Ki?67 expression in colorectal adenocarcinoma例

p53是非常重要的抑癌基因之一，一旦發(fā)生突變，可促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，侵襲力增強(qiáng)，使得p53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)樵┗颍?1?12］。免疫組化方法檢測(cè)出來(lái)多是突變型p53，野生型p53由于半衰期短、細(xì)胞中含量低而難以檢測(cè)到［13］。本實(shí)驗(yàn)研究表明，p53在結(jié)直腸腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于結(jié)直腸腺瘤和正常組織，進(jìn)一步對(duì)臨床因素的各數(shù)據(jù)分析顯示，p53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)深度、分化程度等密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明p53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率越高，腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。這與卞雪春等［14］研究結(jié)果一致。

Ki?67是具有代表性、應(yīng)用廣泛的細(xì)胞增殖抗原之一，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，在細(xì)胞周期各期中，其表達(dá)受到精準(zhǔn)調(diào)控，與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)［15?16］。本研究中顯示，Ki?67 在不同浸潤(rùn)深度、不同分化程度的結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且存在相關(guān)性，隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、惡化程度越高、浸入的深入、分期越高，Ki?67的陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。這證實(shí)，Ki?67亦與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，惡性細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。孫旭凌等［17］臨床研究均也證實(shí)了這一結(jié)果。

研究證實(shí)，野生型p53激活后，可直接通過(guò)結(jié)合EZH2基因的啟動(dòng)子抑制該基因的表達(dá)。當(dāng)p53基因發(fā)生突變后喪失抑制作用，EZH2 表達(dá)則增加［18?19］。筆者的相關(guān)性分析結(jié)果表明，EZH2與p53表達(dá)在結(jié)直腸腺癌中呈正相關(guān)，這也提示EZH2蛋白在腫瘤中的表達(dá)受p53基因的調(diào)控。而EZH2、p53及Ki?67三者在結(jié)直腸腺癌中陽(yáng)性表達(dá)也呈正相關(guān)，且隨著腫瘤分化程度的降低，浸潤(rùn)深度加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，3種蛋白的表達(dá)也明顯升高，推測(cè)3種蛋白在結(jié)直腸腺癌發(fā)展過(guò)程可能起協(xié)同作用。

綜上所述，聯(lián)合檢測(cè)EZH2、p53及Ki?67三者在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)情況，有助于了解腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)傾向，也可以為腫瘤的靶向及個(gè)體化治療提供依據(jù)，以期提高治療效果，延長(zhǎng)患者的生存期。同時(shí)本研究?jī)H用免疫組化得出上述結(jié)論尚不充分，因此有必要今后在分子水平上進(jìn)一步探討。