不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血Treg細(xì)胞及細(xì)胞因子TGF?β、IL?10的表達(dá)及臨床意義

祝麗瓊 陳慧 劉梅蘭 陳穎 王瞾華 魏菁 蘇芳 張建平

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2醫(yī)學(xué)研究中心（廣州 510120）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥，指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上自然流產(chǎn)者。據(jù)統(tǒng)計(jì)，RSA的發(fā)病率約5%，它在生理和心理上對(duì)育齡婦女及其家庭產(chǎn)生諸多不良的影響，嚴(yán)重?fù)p害人類(lèi)生殖健康。RSA的病因非常復(fù)雜，包括夫婦或胚胎染色體異常、代謝及內(nèi)分泌異常、感染，生殖道解剖異常、抗凝脂綜合征等［1］。但仍有一半以上患者病因不明，因此稱(chēng)為“原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)”（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。生殖免疫學(xué)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，URSA的發(fā)生與母-胎免疫耐受異常有關(guān)［2］。近年來(lái)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regula?tory T cell，Treg）在免疫耐受中的作用備受關(guān)注，Treg細(xì)胞在正常妊娠的維持中具有重要作用［3］。既往對(duì)Treg細(xì)胞的研究較多采用CD4+CD25+或CD4+CD25high作為其分子標(biāo)志［4］，但這標(biāo)記并不能真實(shí)反映Treg細(xì)胞水平。Foxp3又稱(chēng)叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子，在Treg細(xì)胞中特異性表達(dá)，是Treg細(xì)胞特異性的分子標(biāo)志。本研究采用CD4、CD25、Foxp3作為標(biāo)記，采用三色流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)并比較正常未孕及早孕，URSA患者未孕及稽留流產(chǎn)外周血中Treg細(xì)胞百分比，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)及血清中細(xì)胞因子TGF?β及IL?10的表達(dá)，以探討Treg細(xì)胞數(shù)量及其功能在URSA患者中的變化及其在妊娠維持中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2013年9月至2015年1月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院就診，有連續(xù)3次或3次以上12周以前發(fā)生流產(chǎn)史的URSA稽留流產(chǎn)者及未孕患者各50例作為研究組，稽留流產(chǎn)患者在入組時(shí)均以陰道B超確診為早期妊娠稽留流產(chǎn)，且經(jīng)過(guò)系統(tǒng)流產(chǎn)病因篩查，排除夫婦染色體異常、內(nèi)分泌異常、解剖異常、感染及抗磷脂綜合征導(dǎo)致的流產(chǎn)；選取同期在人流室就診，要求進(jìn)行人工流產(chǎn)的早期妊娠者25例及在體檢中心體檢的正常未孕婦女25例作為正常對(duì)照組，所有對(duì)照者以往至少有過(guò)一次正常足月分娩且無(wú)自然流產(chǎn)病史，正常早期妊娠者入組時(shí)均以B超確診為宮內(nèi)早孕，可見(jiàn)心管搏動(dòng)。所有研究對(duì)象均沒(méi)有吸煙史、酗酒史、無(wú)糖尿病、高血壓、心臟病、肝腎疾病及血液疾病，3個(gè)月內(nèi)均無(wú)疫苗接種史。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自Sigma公司，流式抗體：CD4?FITC，CD25?APC、Foxp3?PE及PE同型對(duì)照單克隆抗、固定劑、破膜劑均購(gòu)自BD Pharmigin公司。qRT?PCR引物由廣州吉賽生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Real?time PCR試劑購(gòu)自盒日本TOYOBO公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為Beck?man coulter（美國(guó)），PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司（BD FACS Verse ?Z6511550198）。

1.2.2 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral bloodmononuclear cell，PBMC）本研究通過(guò)中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在征得研究對(duì)象的知情同意后，使用肝素鈉試管抽取靜脈血4 mL（研究組在行清宮前，對(duì)照組在做人工流產(chǎn)前）。取15 mL管離心管，每管小心加入淋巴細(xì)胞分離液4 mL，將4 mL外周血沿管壁緩慢置于淋巴細(xì)胞分離液層面之上，2 000 r/min 20℃離心20 min，收集淋巴細(xì)胞層中的淋巴細(xì)胞，PBS洗滌2次備用。

1.2.3 流式細(xì)胞技術(shù)檢查T(mén)reg百分比將PBMC調(diào)整至1×107/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，向其中加入CD4?FITC，CD25?APC各10 μL，混勻，室溫避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌離心后分別加入1 mL Fixation/Permeabilization破膜劑，室溫避光孵育40 min，用破膜緩沖液洗滌2次后，加入10 μL Foxp3?PE（同型對(duì)照管加入10 μL 小鼠IgG r1?PE），避光孵育30 min，經(jīng)破膜緩沖液洗滌2次，用500 μL PBS重懸，上流式機(jī)檢測(cè)。先以FSC?SSC設(shè)門(mén)淋巴細(xì)胞群（gate P1），再以CD4+T細(xì)胞設(shè)門(mén)（gate P2），分析CD4+T細(xì)胞中CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的百分比。

1.2.4 qRT?PCRFoxp3 和β?actin引物由廣州吉賽生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，序列如下：Foxp3?forward：5′?CATCCGCCACAACCTGAGTCTG?3′；Foxp3?reverse：5′?CCTGTTCGTCCATCCTCCTTT?CCT?3′；β?actin?forward：5′?GCACCACACCTTCTA?CAATGAGC?3′；β?actin?reverse：5′?GGATAGCA?CAGCCTGGATAGCAAC?3′。

取PBMC（2×106mL）按照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在PCR儀上按以下反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60 ℃ 30 s（此步驟收集熒光信號(hào)）；45個(gè)循環(huán)，融解曲線(xiàn)分析：溫度60～95℃。熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀在設(shè)定相關(guān)參數(shù)后，測(cè)量出不同基因的cycle threshold（Ct值）。計(jì)算出ΔCt值及ΔΔCt。內(nèi)參β?actin及Foxp3擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)如圖1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用Graph pad Prism v5.0 software軟件進(jìn)行分析及作圖。計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組差異性比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象臨床基本情況比較URSA稽留流產(chǎn)組流產(chǎn)次數(shù)為3～5次；正常早孕組足月分娩次數(shù)均為1～2次；研究對(duì)象年齡、月經(jīng)周期，懷孕者孕周、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 Treg/CD4+T百分比在URSA患者及正常對(duì)照中的表達(dá)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Treg占外周CD4＋T細(xì)胞的百分比，結(jié)果顯示見(jiàn)圖2。正常早孕者Treg/CD4+T百分比較正常未孕者明顯增高［（7.38±1.48vs.（5.67± 0.94），P＜0.000 1］；URSA稽留流產(chǎn)者Treg/CD4+T百分比較URSA未孕者增高［（5.72± 1.00）vs.（5.26±1.08），P=0.03］；URSA稽留流產(chǎn)患者Treg/CD4+T百分比較正常早孕者明顯下降［（5.72±1.00）vs.（7.38±1.48），P＜0.000 1］；而URSA未孕組與正常未孕組相比Treg/CD4+T百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（5.26±1.08）vs.（5.68±0.94），P=0.1］

圖1 內(nèi)參β?actin及Foxp3擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn)Fig.1 Amplification and dissolution curves of internal reference beta?actin and Foxp3

表1 研究對(duì)象臨床基本情況比較Tab.1 Comparison of the basic clinical situation of the subjects ±s

表1 研究對(duì)象臨床基本情況比較Tab.1 Comparison of the basic clinical situation of the subjects ±s

流產(chǎn)次數(shù)（次）足月分娩次數(shù)（次）年齡（歲）月經(jīng)周期（d）孕周（d）BMI（kg/m2）URSA未孕（n=50）3～4 0 28.08±2.78 29.67±2.34-20.78±1.58正常未孕（n=25）0 1～2 28.45±2.15 29.27±1.78-21.38±2.12 URSA稽留流產(chǎn)（n=50）3～5 0 28.35±1.87 30.58±2.45 44.14±5.83 20.14±2.53正常早孕（n=25）0 1～2 27.35±3.17 28.58±2.17 46.48±4.66 21.53±1.43

2.3 Foxp3 mRNA在URSA患者及正常對(duì)照中的表達(dá)以qRT?PCR測(cè)外周血PBMC中Foxp3 mRNA水平。結(jié)果見(jiàn)圖3。正常早孕者Foxp3 mRNA水平較正常未孕者明顯增高［（3.43±0.46）vs.（3.02±0.47），P=0.003］；URSA稽留流產(chǎn)者Foxp3 mRNA水平URSA未孕者增高［（3.06±0.57）vs.（2.79±0.52），P=0.01］；URSA稽留流產(chǎn)患者Foxp3 mRNA水平較正常早孕者明顯下降［（3.06±0.57）vs.（3.43±0.46），P=0.006］；而URSA未孕組與正常未孕組相比Foxp3 mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（2.79±0.52）vs.（3.02±0.47），P=0.07］。

2.4 TGF?β及IL?10在URSA患者及正常對(duì)照中的表達(dá)以URSA稽留流產(chǎn)及正常早孕兩組為研究對(duì)象，以ELISA方法檢測(cè)兩組血清中Treg相關(guān)細(xì)胞因子TGF?β及IL?10的水平，結(jié)果見(jiàn)圖3。URSA稽留流產(chǎn)患者TGF?β及IL?10水平均較正常早孕者下降［TGF?β：（56.12± 11.25）vs.（50.12±9.78）ng/mL，P=0.02；IL ?10：（6.43±2.48）vs.（4.48± 2.12）pg/mL，P＜0.001］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

1995年，SAKAGUCHI等［5］首次報(bào)道了在自身免疫耐受中存在一類(lèi)表達(dá)IL2受體a鏈（IL2Ra，CD25）的T細(xì)胞亞群，并將這類(lèi)CD4+CD25+T細(xì)胞命名為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cell，Treg）。隨后研究發(fā)現(xiàn)，Treg是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞群，它能分泌IL?10、TGF?β，表達(dá)Foxp3及CTLA?4分子等，通過(guò)細(xì)胞間直接接觸或細(xì)胞因子間接方式抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)、抑制傳統(tǒng)T細(xì)胞的活化以及促進(jìn)一些抑制性細(xì)胞因子的分泌等，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、誘導(dǎo)移植物的耐受中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究均證明Treg細(xì)胞在母胎免疫耐受中起著極其重要的作用［6］。

圖2 Treg/CD4+T百分比在URSA患者及正常對(duì)照中的表達(dá)Fig.2 Expression of Treg/CD4+T in URSA patients and normal controls

ZENCLUSSEN［7］首先證實(shí)正常妊娠小鼠胸腺中CD4+CD25+Treg細(xì)胞較非妊娠小鼠增高，有流產(chǎn)傾向的小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Treg細(xì)胞明顯降低，而向流產(chǎn)傾向小鼠轉(zhuǎn)入正常孕小鼠CD4+CD25+Treg細(xì)胞則可以阻止自然流產(chǎn)的發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)，有流產(chǎn)傾向的小鼠蛻膜組織中Foxp3表達(dá)降低。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)URSA患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組明顯下降［8］。上述研究均顯示，Treg細(xì)胞與妊娠失敗密切相關(guān)。本研究以CD4、CD25及Foxp3作為標(biāo)記，利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Treg占外周CD4+T細(xì)胞的百分比，數(shù)據(jù)顯示：正常早孕者Treg/CD4+T百分比較正常未孕者明顯增高［（7.38±1.48）vs.（5.67±0.94），P＜0.000 1］；UR?SA稽留流產(chǎn)者Treg/CD4+T百分比較URSA未孕者增高［（5.72±1.00）vs.（5.26±1.08），P=0.03］；結(jié)果顯示，妊娠期母體外周Treg會(huì)顯著的升高，提示Treg細(xì)胞在維持妊娠中有重要作用。數(shù)據(jù)還顯示，URSA稽留流產(chǎn)患者Treg/CD4+T百分比較正常早孕者明顯下降［（5.72±1.00）vs.（7.38±1.48），P＜0.000 1］，結(jié)果提示，外周Treg細(xì)胞數(shù)量降低可能與URSA的發(fā)生密切相關(guān)。接下來(lái)筆者利用qRT?PCR技術(shù)檢測(cè)了Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp 3mRNA水平，在mRNA水平上證實(shí)了上述結(jié)果。

圖3 Foxp3 mRNA在URSA患者及正常對(duì)照中的表達(dá)Fig.3 Expression of Foxp3 mRNA in URSA patients and normal controls

圖4 TGF?β及IL?10在URSA患者及正常對(duì)照中的表達(dá)Fig.4 Expression of TGF?and IL?10 in URSA patients and normal controls

IL?10和TGF?β是兩種參與免疫調(diào)節(jié)及具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子，而Treg細(xì)胞可通過(guò)釋放IL?10和TGF?β等抑制性細(xì)胞因子參與維持對(duì)機(jī)體免疫平衡［9-10］。研究表明，IL?10與TGF?β在母-胎免疫耐受中也起著非常重要作用。IL?10可以誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞及母胎界面單核細(xì)胞HLA?G基因和蛋白表達(dá)。IL?10還可以使單核細(xì)胞表面MHC?1型及Ⅱ型抗原表達(dá)降低。此外，IL?10還可以抑制Th1型細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子。有研究表明，IL?10水平降低可能與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病有關(guān)［11］。TGF?β具有較強(qiáng)的免疫抑制功能，它可以通過(guò)下調(diào)黏附分子從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞上白細(xì)胞的附著，在移植物免疫耐受中起著非常重要的作用。此外，它還可以通過(guò)抑制T細(xì)胞增生，降低NK細(xì)胞毒性及效應(yīng)性T細(xì)胞的活性，從而保護(hù)胚胎發(fā)育。有報(bào)道，妊娠期外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)TGF?β上調(diào)，參與維持正常妊娠，其表達(dá)下降與URSA發(fā)病有關(guān)［3］。本研究結(jié)果顯示：URSA稽留流產(chǎn)患者TGF?β及IL?10水平均較正常早孕者下降［TGF?β：（56.12±11.25）vs.（50.12±9.78）ng/mL，P=0.02；IL?10：（6.43±2.48）vs.（4.48±2.12），P＜0.001］，說(shuō)明Treg細(xì)胞的數(shù)量減少，TGF?β及IL?10表達(dá)降低，與URSA的發(fā)生有密切關(guān)系。

綜上所述，Treg在維持妊娠中有重要作用；外周血Treg細(xì)胞數(shù)量及mRNA表達(dá)明顯降低，TGF?β及IL?10表達(dá)降低可能與URSA的發(fā)生有密切關(guān)系。