高表達(dá)SEMG1蛋白的弱精子癥大鼠模型的建立

郭曉彬 張萬(wàn)松 肖卓裕 呂嫻媛 王鵬 楊誠(chéng) 劉存東 周其趙

南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科（廣州 510630）

隨著不孕不育發(fā)病率的升高，生殖健康成為一個(gè)全球性的健康難題。調(diào)查顯示育齡夫婦中約有10%～15%患有不孕不育，其中接近一半由男性不育導(dǎo)致［1］。男性不育患者中絕大部分由于精子數(shù)量及活力顯著低下引起，即弱精子癥。弱精子癥的病因復(fù)雜多樣，發(fā)病機(jī)制尚未清楚［2］。既往的研究發(fā)現(xiàn)SEMG1基因（semenogelin I）編碼的蛋白質(zhì)是男性精液中主要的蛋白質(zhì)，功能是將射精精子包裹在一種凝膠狀的基質(zhì)中，在射精后迅速被前列腺特異抗原PSA（prostate?specific antigen)酶解成小的多肽，這種蛋白酶解過(guò)程破壞了凝膠狀基質(zhì)的性質(zhì)，從而使精液液化，精子也獲得更多的運(yùn)動(dòng)能［3-4］。多項(xiàng)研究［5-7］表明SEMG1在弱精子癥患者精子中表達(dá)水平明顯升高，在弱精子癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用。同時(shí)研究［4-8］表明SEMG1不僅表達(dá)于精囊及精子中，在附睪及睪丸中也有少量表達(dá)，但其在睪丸中表達(dá)所發(fā)揮的作用尚未清楚，在動(dòng)物模型中睪丸SEMG1蛋白表達(dá)水平與弱精子癥的關(guān)系尚未明確。環(huán)磷酰胺（cy?dophosphamide，CP）是一種臨床常見(jiàn)的烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥物，廣泛應(yīng)用于對(duì)各種血液系統(tǒng)疾病和實(shí)體腫瘤的治療［9］。研究表明CP能夠破壞生精細(xì)胞，導(dǎo)致各級(jí)精母細(xì)胞脫落，進(jìn)而造成弱精的表現(xiàn)［10］，因此被廣泛用于弱精子癥動(dòng)物模型的構(gòu)建［11］。本研究使用環(huán)磷酰胺腹腔注射法成功構(gòu)建弱精子癥大鼠動(dòng)物模型，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)弱精子癥大鼠睪丸中SEMG1蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，成功構(gòu)建了睪丸中高表達(dá)SEMG1蛋白的弱精子癥大鼠模型。本研究將為進(jìn)一步研究SEMG1在睪丸生精過(guò)程中的作用奠定了良好的動(dòng)物模型基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7～8周齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，由南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK（粵）2011-0074］。

1.2 主要儀器及試劑正置顯微鏡（Leica?DME日本），冰凍切片機(jī)（德國(guó)美康HM550）,電泳儀和電轉(zhuǎn)儀（Bio?Rad，美國(guó)），環(huán)磷酰胺由江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字H32020856，0.1 g/支，粉末狀)，購(gòu)于本院門(mén)診藥房.總蛋白提取試劑盒（Beyotime，上海），蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Beyo?time，上海），SEMG1、GAPDH單克隆抗體（abcam，美國(guó)），CASPASE-3、BCL2多克隆抗體（abconal，美國(guó)），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（RayAntibody，北京），PVDF膜（BioTrace，墨西哥）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立、取材健康6～8周齡雄性體重約（340±10）g的SD大鼠30只，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23～25℃，每天自然光光照12 h，過(guò)程中大鼠均可自由攝食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。大鼠被隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只?？瞻讓?duì)照組不做任何處理，實(shí)驗(yàn)組按60 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺,陰性對(duì)照組按60 mg/kg腹腔注射0.9%生理鹽水，每天1次，持續(xù)5 d。第30天時(shí)，頸椎脫臼處死大鼠，稱(chēng)其質(zhì)量，摘取大鼠雙側(cè)睪丸并稱(chēng)量質(zhì)量，睪丸指數(shù)=單側(cè)睪丸質(zhì)量/大鼠質(zhì)量，剪取附睪尾部置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)讓精子游離，取精子懸液在光學(xué)顯微鏡下分別計(jì)數(shù)a級(jí)和b級(jí)精子數(shù)量，一側(cè)大鼠睪丸用10%多聚甲醛固定，另一側(cè)大鼠睪丸置于－80℃冰凍備用。

1.3.2 睪丸指數(shù)、精子密度及各級(jí)精子活力計(jì)數(shù)在6 cm培養(yǎng)皿中加入37℃預(yù)熱的生理鹽水1 mL，放入剪碎的附睪尾并將培養(yǎng)皿置入37℃溫箱孵育20 min制成精子懸液，緊接著用生理鹽水將精子懸液稀釋至100倍輕輕混勻，用吸管吸取5 μL懸液，光學(xué)顯微鏡下計(jì)算精子的密度，并在多個(gè)視野下觀察200個(gè)精子中a級(jí)和b級(jí)精子的數(shù)量。根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)，a級(jí)為快速向前運(yùn)動(dòng)的精子，b級(jí)為慢或呆滯的向前運(yùn)動(dòng)。

1.3.3 睪丸組織HE染色空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組睪丸組織置于10%中性甲醛溶液浸泡24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明石蠟包埋，石蠟切片機(jī)制備5 μm的連續(xù)切片，分別隨機(jī)選取各組睪丸組織石蠟切片3張，常規(guī)HE染色后顯微鏡下觀察睪丸組織生精結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)觀察并拍照。

1.3.4 蛋白質(zhì)免疫印跡提取睪丸組織蛋白加入上樣緩沖液，沸水煮沸變性10 min，每個(gè)上樣孔加入40 μg樣品，10%SDS?PAGE凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離。電泳結(jié)束后，濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%BSA室溫封閉1 h。相應(yīng)的抗體按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e置于4℃過(guò)夜。TBS?T洗膜3次，每次10 min，加入二抗兔抗羊抗體室溫下孵育1 h，TBS?T徹底洗膜5次，每次5 min后，Bio?Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠質(zhì)量、睪丸質(zhì)量、睪丸指數(shù)和精子密度及活力的影響空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組之間大鼠質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組睪丸質(zhì)量以及睪丸指數(shù)明顯低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（P＜0.001）；實(shí)驗(yàn)組的精子數(shù)量及a、b級(jí)精子活力明顯低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠質(zhì)量、睪丸質(zhì)量、睪丸指數(shù)和精子密度及活力的影響Tab.1 Effects of cyclophosphamide on rat quality,testicular mass,testicular index,sperm density and viability±s

表1 環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠質(zhì)量、睪丸質(zhì)量、睪丸指數(shù)和精子密度及活力的影響Tab.1 Effects of cyclophosphamide on rat quality,testicular mass,testicular index,sperm density and viability±s

注：***0.001

分組鼠質(zhì)量（g）睪丸質(zhì)量（g）睪丸指數(shù)（%）精子密度（×106/mL）200個(gè)精子中a級(jí)精子數(shù)200個(gè)精子中b級(jí)精子數(shù)a+b級(jí)精子百分比（%）空白對(duì)照組343.70±1.50 1.50±0.01 0.43±0.04 12.13±0.09陰性對(duì)照組342.90±1.40 1.51±0.01 0.44±0.04 12.44±0.13實(shí)驗(yàn)組346.50±1.66 1.43±0.02***0.41±0.06***7.51±0.01***38.50±0.7638.70±0.6017.40±0.54***68.00±1.24 0.53±0.01 69.10±0.74 0.54±0.01 43.40±0.62***0.30±0.01***

2.2 環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響根據(jù)睪丸切片HE染色圖可以看到，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組睪丸生精小管結(jié)構(gòu)完整，各級(jí)生精細(xì)胞層次分明，可見(jiàn)大量長(zhǎng)形精子細(xì)胞（見(jiàn)圖1A、1B）。實(shí)驗(yàn)組中可以看到各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞間隙增寬、數(shù)量明顯減少,管腔內(nèi)精子數(shù)量明顯減少（圖1C）。

2.3 弱精子癥大鼠睪丸中SEMG1及CASPE?3及BCL?2蛋白表達(dá)水平變化Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組睪丸中SEMG1及CASPE?3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），BCL?2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 各組睪丸組織HE染色高倍鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)（×40）Fig.1 Morphological structure of HE stained in testis of each group（×40）

圖2 弱精子癥大鼠睪丸中SEMG1及CASPASE?3及BCL?2蛋白表達(dá)水平Fig.2 SEMG1，CASPASE?3 and BCL?2 protein expression levels in the testis of asthenozoospermia rats

3 討論

弱精子癥發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，如：泌尿系感染［12］，精索靜脈曲張［13］等，但具體的分子機(jī)制尚未清楚。近年來(lái)，男性不育的研究取得一定的進(jìn)展，如WANG等［14］發(fā)現(xiàn)DJ?1和NDUFS3之間的相互作用被破壞以及精子和睪丸DJ?1蛋白的下調(diào)可導(dǎo)致弱精子癥的發(fā)生。XU等［15］發(fā)現(xiàn)RNASET2可以通過(guò)抑制PKA/PI3K/鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)降低精子活力。在本研究前期研究及多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)SEMG1在人弱精子癥患者精子中表達(dá)水平比正常精子明顯升高［5-6，16-17］，但尚未有研究報(bào)道該基因在弱精子癥鼠模型睪丸中的表達(dá)水平。本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［11］，使用環(huán)磷酰胺腹腔注射法構(gòu)建弱精子癥大鼠模型。雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同組大鼠的質(zhì)量無(wú)明顯差異，但實(shí)驗(yàn)組睪丸質(zhì)量及睪丸指數(shù)較對(duì)照組下降，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與目前文獻(xiàn)報(bào)道一致［18］。同時(shí)觀察到腹腔注射環(huán)磷酰胺后大鼠精子密度及精子活力明顯降低，睪丸組織HE染色見(jiàn)睪丸生精小管中各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂，生精細(xì)胞數(shù)量減少。此外，腹腔注射環(huán)磷酰胺后大鼠睪丸中CASPASE?3表達(dá)水平升高，BCL2表達(dá)水平下降。Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中Caspase?3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子；BCL2在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，大多數(shù)定位在線粒體外膜上，在受到信號(hào)刺激后轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，可抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，注射環(huán)磷酰胺后大鼠睪丸中Cas?pase?3表達(dá)水平升高，BCL2表達(dá)水平下降，這些結(jié)果表明大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后睪丸中的生精細(xì)胞凋亡增加。高學(xué)勇等［19］使用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)腹腔注射環(huán)磷酰胺后生精細(xì)胞的凋亡情況也得到了相同的結(jié)果，證明本研究弱精子癥大鼠模型構(gòu)建成功。

Western blot檢測(cè)SEMG1蛋白在構(gòu)建成功后的弱精子癥大鼠睪丸中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，SEMG1的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.001）。既往研究表明，SEMG1是精液中的主要蛋白質(zhì)，與弱精子癥有密切的的關(guān)系，SEMG1基因失能或突變會(huì)導(dǎo)致男性不育。研究者利用計(jì)算機(jī)輔助運(yùn)動(dòng)軌跡分析、流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦熒光顯微鏡等研究方法發(fā)現(xiàn)SEMG1降低精子活力是通過(guò)修飾精子細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜跨膜電位，以時(shí)間依賴的方式增加精子細(xì)胞膜的滲透性，間接抑制精子的運(yùn)動(dòng)［20-22］。睪丸是精子發(fā)生的部位，睪丸內(nèi)含有不同時(shí)期的生精細(xì)胞，本研究表明環(huán)磷酰胺腹腔注射后其代謝產(chǎn)物刺激各級(jí)生精細(xì)胞，使生殖細(xì)胞內(nèi)SEMG1表達(dá)水平升高，從而使生殖細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，最終導(dǎo)致生殖細(xì)胞的凋亡增加。睪丸中包含各個(gè)時(shí)期的生殖細(xì)胞，腹腔注射環(huán)磷酰胺后睪丸中哪一時(shí)期的生殖細(xì)胞SEMG1升高或者所有時(shí)期的生殖細(xì)胞SEMG1蛋白表達(dá)均升高尚未清楚，有待進(jìn)一步的研究。文獻(xiàn)報(bào)道［23］環(huán)磷酰胺可引起睪丸DNA損傷，誘導(dǎo)生殖細(xì)胞DNA畸形、斷裂或突變，導(dǎo)致精子DNA斷裂，最終導(dǎo)致雄性不育、誘發(fā)腫瘤、甚至子代畸形。本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射環(huán)磷酰胺后大鼠睪丸中凋亡蛋白CASPASE?3升高，抗凋亡蛋白BCL2表達(dá)降低，提示睪丸中的生殖細(xì)胞凋亡增加。有趣的是腹腔注射環(huán)磷酰胺后睪丸中SEMG1蛋白的表達(dá)水平也升高了，本研究首次報(bào)道了該蛋白在弱精子癥的大鼠睪丸中高表達(dá)。

綜上所述，本研究使用環(huán)磷酰胺腹腔注射法成功構(gòu)建了睪丸中高表達(dá)SEMG1蛋白的弱精子癥鼠模型，為進(jìn)一步研究SEMG1蛋白在睪丸中的生物學(xué)功能及其在弱精子癥中高表達(dá)的分子機(jī)制奠定了良好的動(dòng)物模型保證。