絲氨酸蛋白酶抑制劑B1在肝肺綜合征大鼠肺組織中的表達(dá)變化

艾祥發(fā) 王海英

遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（貴州遵義563000）

肝肺綜合征（HPS）是源于肝源性疾病晚期引起的以動脈氧合不足引起缺氧為特征的肺內(nèi)出現(xiàn)的并發(fā)癥［1］。病理的血管新生可以導(dǎo)致肺內(nèi)通氣/血流比值失衡和異常分流，從而加重肺部氣體交換異常導(dǎo)致低氧血癥，這是HPS的重要發(fā)生機(jī)制。本課題組前期研究已證實(shí)促血管生成因子參與病理性血管新生在HPS發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用［2］。已有研究認(rèn)為異常的血管新生是由于內(nèi)皮細(xì)胞間連接松動，內(nèi)皮細(xì)胞再次增殖和遷移所導(dǎo)致［3］。

絲氨酸蛋白酶抑制劑B1（SerpinB1）是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，主要作用是保護(hù)組織細(xì)胞不受應(yīng)激期間細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶的損傷［4］。已有研究報(bào)道該蛋白在炎癥中發(fā)揮作用，大量表達(dá)于炎癥細(xì)胞，參與了肺部炎癥的發(fā)生機(jī)制［5］。對潰瘍性結(jié)腸炎患者的研究顯示SerpinB1的表達(dá)不僅定位于炎癥浸潤細(xì)胞，而且也在結(jié)腸上皮細(xì)胞有表達(dá)［6］。另有研究報(bào)道SerpinB1在侵襲性口腔鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)并可促進(jìn)口腔癌細(xì)胞遷移［7］。但SerpinB1在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞是否表達(dá)及其變化以及與血管新生的關(guān)系仍未見報(bào)道。MAPK通路參與多種細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控，最新研究發(fā)現(xiàn)SerpinB1通過激活ERK1/2及相關(guān)通路減輕自體肝移植后肺部炎癥及氧化應(yīng)激，減輕肺組織細(xì)胞凋亡［8］。本研究旨在探究SerpinB1參與調(diào)節(jié)肝肺綜合征血管新生及其機(jī)制，為探討通過抑制血管的生成來改善HPS的方法提供科研基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材小鼠抗GAPDH單克隆IgG、TRNzol總RNA提取試劑、蘇木精、SDS?PAGE配膠試劑以購買于康為世紀(jì)公司（中國），蛋白酶抑制劑Cocktail購買于羅氏生物公司（美國），ECL發(fā)光液購買于重慶葆光生物有限公司，兔抗Erk1/2抗體、兔抗p?Erk1/2抗體購買于美國R&D公司，山羊抗SerpinB1抗體和小鼠抗CD34抗體購買于Peprotech（美國）公司，山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、驢抗山羊IgG購買自碧云天（中國）公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR盒從日本TaKaRa公司購買，PCR引物購買自賽默飛世爾科技（美國）公司。臺式高速離心機(jī)購買自ThermoFisher公司，電泳儀購買自Bio?Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及動物模型建立健康的SD大鼠40只，3～5月齡，雄性，重量為0.24～0.27 kg，使用抽簽法將這些實(shí)驗(yàn)鼠分類為四組（n=10）：即假手術(shù)組（sham），膽總管結(jié)扎后1周組（1 W），膽總管結(jié)扎后3周組（3 W），膽總管結(jié)扎后5周組（5 W）。膽總管結(jié)扎組大鼠（CBDL組）用絲線分別結(jié)扎膽總管的近十二指腸端和近肝門端，并將游離膽總管剪斷。Sham組即僅打開腹腔并暴露后縫合，不予結(jié)扎膽管；膽總管結(jié)扎后1周組、3周組、5周組分別于膽總管結(jié)扎后1、3、5周通過腹主動脈采血后取肺組織。血?dú)庵笜?biāo)PaO2＜85 mmHg且A?aDO2＞18 mmHg為HPS動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭谱髁己玫闹笜?biāo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變肺組織用4%多聚甲醛固定12 h后進(jìn)行石蠟包埋，切片厚約5 mm，行HE染色后在光鏡下（200×）隨機(jī)選十個視區(qū)觀測肺組織及微血管病變。

1.3.2 免疫組化觀察目的蛋白表達(dá)分布石蠟切片放置于60℃烤箱烘烤2 h后，將片子放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中1 h除石蠟、然后在濃度梯度酒精中脫水10 min/次；滴加 3%的 H2O2封片 40 min，高壓鍋抗原修復(fù)5 min后冷卻至室溫。山羊血清封片1 h，去掉血清滴加一抗（一抗稀釋比例分別為SerpinB1 1∶200，Erk 1∶300，p?Erk 1∶300，CD34 1∶300），并放置于濕盒中4℃過夜后用PBS洗滌2～3次；滴加二抗工作液放在37℃溫箱中1 h，PBS緩沖液進(jìn)行充分洗滌；滴加DAB顯色液于顯微鏡下觀察著色后充分沖洗；蘇木精染色10 s后沖洗；按照75%乙醇→二甲苯I的順序脫水并封片，最后對制作好的切片進(jìn)行觀察和拍照。從每個組化切片挑選至少五個視野，并通過Image Proplus和累積光密度值（IOD）指標(biāo)對表達(dá)量進(jìn)行量化。

1.3.3 微血管密度（MVD）的評估選擇抗CD34的一抗并使用免疫組化的方法標(biāo)記各組肺組織CD34陽性細(xì)胞，在高倍鏡（200×）下觀察計(jì)數(shù)，并將CD34陽性細(xì)胞數(shù)所占比作為微血管密度。每個肺組織切片至少選取5個視野，并用NIS?Elements AR軟件計(jì)數(shù)CD34陽性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)CD34陽性細(xì)胞的比例，算出微血管密度。

1.3.4 qRT?PCR實(shí)驗(yàn)按TRNzol RNA試劑說明書操作步驟獲取肺組織中總的RNA；用分光光度計(jì)檢測提取RNA的濃度，按相關(guān)說明使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒和T100反轉(zhuǎn)錄儀器將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按說明書操作用特異引物將cDNA片段擴(kuò)增，熒光定量PCR系統(tǒng)檢測目的基因的Ct值，以內(nèi)參選取GAPDH，并算出相對表達(dá)量。

1.3.5 Western blot實(shí)驗(yàn)將肺組織用研缽磨碎后，滴加約800 μL的RIPA裂解液及Cocktail蛋白酶抑制劑（100×）提取組織蛋白，用BCA法檢測樣品蛋白濃度。制備10%SDS聚丙烯胺凝膠，每孔上樣量為60 μg，70 V/90 V電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗于濕盒中4℃冰箱進(jìn)行孵育（SerpinB1 1∶800，GAPDH 1∶2 000）過夜，然后用TBST對膜進(jìn)行清洗；二抗（1∶3 000）室溫孵育100 min，TBST清洗膜8 min×4次，滴加ECL發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果用Image Lab軟件進(jìn)行灰度值測量，用目的蛋白灰度值除以GAPDH灰度值得到相對值用于統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本實(shí)驗(yàn)選擇SPSS 19.0，計(jì)量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差展示，多個組之間相比選用單個因素方差分析，兩個組之間對比均數(shù)使用t檢驗(yàn)，組間相關(guān)性分析用相關(guān)系數(shù)r分析比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CBDL大鼠肺組織大體觀察及血?dú)夥治鼋Y(jié)果肺組織大體可見sham組大鼠肺色澤紅潤，無出血點(diǎn)，無組織病變和壞死（圖1A）；CBDL 1周組大鼠可見少量點(diǎn)狀病變（圖1B）；CBDL 3W組大鼠肺組織色澤暗淡，出現(xiàn)較多點(diǎn)狀病變和部分融合病變（圖1C）；CBDL 5周組大鼠肺組織色澤暗淡，可見大量點(diǎn)狀病變和較多融合病灶，伴有肺組織壞死（圖1D）。

血?dú)夥治鼋Y(jié)果表明與Sham組大鼠比較，CBDL組大鼠氧分壓降低而肺泡-動脈血氧分壓差升高，在CBDL 3周及CBDL 5周時以上變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05）其中 CBDL 5WA?aDO2增大最明顯（P＜0.01）見表2。

圖1 各組大鼠肺組織大體外觀Fig.1 Appearance of lung tissue in each group

表2 各個組大鼠之間血?dú)鈹?shù)值比較（n=10）Tab.2 Comparison of blood gas value among rats in each group（n=10） ±s，mmHg

表2 各個組大鼠之間血?dú)鈹?shù)值比較（n=10）Tab.2 Comparison of blood gas value among rats in each group（n=10） ±s，mmHg

注：與Sham組比較，*P＜0.05

指標(biāo)PaO2 A?aDO2 Sham組96.2±2.4 8.0±1.5 1周組89.7±3.0 13.2±1.4 3周組80.0±1.7*20.1±0.9*5周組75.6±1.2*22.7±0.7*

2.2 CBDL大鼠肺組織HE染色及形態(tài)觀察HE染色可觀察到，Sham組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)相對完整，細(xì)胞胞質(zhì)豐富，胞核染色均勻（圖2A）。與Sham相比，CBDL 1周組大鼠肺部有較多炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂（圖2B）；CBDL 3周組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂被破壞，血管腔擴(kuò)大明顯且管腔內(nèi)炎性細(xì)胞增多（圖2C）；CBDL 5周組肺組織炎癥細(xì)胞浸潤明顯，血管官腔直徑增寬，組織結(jié)構(gòu)被破壞且肺泡間隔明顯增厚（圖2D）。通過對多個切片樣本進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)肺泡微血管直徑在CBDL大鼠模型中有所擴(kuò)張（圖2E）。

2.3 SerpinB1、Erk1/2以及CD34在各組大鼠肺組織中mRNA水平的表達(dá)通過qRT?PCR定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組比較SerpinB1、Erk1/2、CD34在CBDL組均表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；其中在1W肺組織mRNA水平表達(dá)量高于Sham組（P＜0.01），在3W肺組織mRNA水平表達(dá)量高于1周組（P＜0.01），在5周肺組織mRNA水平表達(dá)量高于3周組（P＜0.01，圖3）。

2.4 SerpinB1及Erk1/2在各組大鼠肺組織中蛋白水平的表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)SerpinB1在CBDL組相比Sham組均有表達(dá)上調(diào)（P＜0.01，圖4），表明CBDL大鼠模型中SerpinB1可能參與了HPS疾病進(jìn)展。同時免疫印跡法檢測到Erk1/2及p?Erk1/2的表達(dá)上調(diào)（P＜ 0.01，圖4），并且Erk1/2表達(dá)升高（P＜0.01）與SerpinB1的變化具有相關(guān)性（r=0.884，P＜0.05）。表明SerpinB1可能通過調(diào)控Erk1/2參與到肝肺綜合征的發(fā)病機(jī)制中。

圖2 大鼠肺組織HE切片觀察（HE 200×）Fig.2 HE sections of rat lung tissue（HE 200 ×）

圖3 SerpinB1、Erk1/2以及CD34在大鼠肺組織中mRNA表達(dá)Fig.3 mRNA expression of SerpinB1,Erk1/2 and CD34 in rat lung tissue

圖4 免疫印跡法檢測SerpinB1及Erk1/2在肺中的表達(dá)情況及統(tǒng)計(jì)Fig.4 Immunoblotting assay for the expression of SerpinB1 and Erk1/2 in the lung tissue and statistics

2.5 SerpinB1在CBDL大鼠肺中的分布及表達(dá)情況進(jìn)一步通過肺組織切片免疫組化染色結(jié)果可見，SerpinB1主要表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及部分肺泡上皮細(xì)胞，SerpinB1在CBDL組表達(dá)相對于Sham組明顯增加（P＜0.01），并且表達(dá)量隨著CBDL建模周數(shù)的增加逐漸遞增。表現(xiàn)為SerpinB1在CBDL 3周組表達(dá)量高于CBDL 1周（P＜0.01），CBDL 5周組表達(dá)量高于CBDL 3周組（P＜ 0.01，圖5A?E）。

2.6 Erk1/2及CD34在CBDL大鼠肺組織中的表達(dá)分布染色結(jié)果表明Erk1/2，p?Erk1/2以及CD34主要表達(dá)于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且在CBDL 3W組的表達(dá)高于Sham組（P＜0.01）。與Sham組相比較，CBDL 3周組大鼠肺組織中p?Erk/Erk的表達(dá)量有所上調(diào)（P＜0.01），CBDL 3周組CD34的表達(dá)也顯著升高。用CD34陽性細(xì)胞百分比作為肺組織微血管密度（MVD）的指標(biāo)，評估發(fā)現(xiàn)CBDL 3周組大鼠肺組織微血管密度顯著增加，并且與SerpinB1上調(diào)呈正相關(guān)（r=0.795，P＜ 0.05）（圖6A，B）。

3 討論

嚴(yán)重的慢性肝病的發(fā)生主要由肝細(xì)胞功能衰竭和門脈高壓作用引起，其中約有15%～30%發(fā)生與原發(fā)肺部病變無關(guān)的肺部并發(fā)癥，即HPS；HPS的存在損害患者的生活質(zhì)量并增加了患者的病死率，需要肝移植治療才可逆轉(zhuǎn)［9-10］?，F(xiàn)有研究認(rèn)為HPS患者發(fā)生難以糾正的低氧血癥的發(fā)生機(jī)制主要包括：肺泡通氣-血流灌注失調(diào)、肺泡內(nèi)氣體彌散障礙以及動靜脈分流［11］；這些病理改變主要與肝功能受損引起肺部微血管異常擴(kuò)張［12］，腸道細(xì)菌的異常轉(zhuǎn)移［13］，肺內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞活化并釋放炎癥因子［14］，以及血管新生增強(qiáng)也是實(shí)驗(yàn)性HPS發(fā)生的重要因素［15］。

圖5 免疫組化法檢測大鼠肺組織中SerpinB1表達(dá)情況（200 ×）Fig.5 Detection of SerpinB1 expression in rat lung tissue by immunohistochemistry（200 ×）

SerpinB1屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑這一家族中的成員，Serpin家族參與多種生化反應(yīng)，包括調(diào)節(jié)凝血（血栓形成和溶栓），神經(jīng)營養(yǎng)因子，激素轉(zhuǎn)運(yùn)，補(bǔ)體和炎癥，激素轉(zhuǎn)運(yùn)，血管生成和血壓等［16］。已有報(bào)道 PAI?1（SerppinE1）［17］、Maspin（SerpinB5）［18］、SerpinB3及SerpinB13等均與血管新生有關(guān)系，其中Maspin（SerpinB5）在腫瘤中的效應(yīng)表現(xiàn)為抗腫瘤血管新生、抑制遷移和浸潤，其與整合素β1的活化密切相關(guān)［18］。以往的研究發(fā)現(xiàn)SerpinB1在急性肺損傷中通過激活Erk1/2通路改善急性氧化應(yīng)激和減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而起到保護(hù)作用［8］，這表明SerpinB1在內(nèi)皮細(xì)胞的增殖過程中扮演關(guān)鍵角色。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPS組大鼠血?dú)夥治鼋Y(jié)果PaO2降低且A?aDO2升高（表2），HE染色結(jié)果表明HPS大鼠肺組織結(jié)構(gòu)被破壞及肺間隔增厚（圖2），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SerpinB1的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（圖3、圖4），通過免疫組化發(fā)現(xiàn)主要分布于微血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞（圖5），提示SerpinB1在HPS的發(fā)生機(jī)制中可起到重要作用。

圖6 Erk1/2及CD34在CBDL大鼠肺組織中的表達(dá)分布Fig.6 Distribution and expression of Erk1/2 and CD34 in lung tissue of CBDL rats

內(nèi)皮細(xì)胞生長和增殖對于血管生成是關(guān)鍵的［19］，實(shí)驗(yàn)組前期研究已證實(shí)Erk1/2在實(shí)驗(yàn)性HPS中對血管新生的重要性［20］。本研究通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測到HPS組大鼠Erk1/2蛋白水平的上調(diào)并且與SerpinB1的表達(dá)具有相關(guān)性（r=0.884，P＜0.05）。CD34是微血管內(nèi)皮細(xì)胞重要的標(biāo)志物，CD34陽性比例可表示血管新增數(shù)量，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CD34陽性細(xì)胞數(shù)在HPS大鼠中的表達(dá)較Sham組明顯增高并且并且與SerpinB1上調(diào)呈正相關(guān)（r=0.795，P＜0.05），這表明SerpinB1可能參與到內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管新生的調(diào)控，并且可能與激活Erk1/2，促進(jìn)Erk1/2磷酸化有密切關(guān)系。

綜上所訴，通過調(diào)控SerpinB1的表達(dá)水平來從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，可以有效抑制HPS患者肺血管新生，從而改善肺內(nèi)分流和缺氧狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)將SerpinB1及Erk1/2與肺血管新生聯(lián)系在一起進(jìn)行研究，提出一種可能存在的調(diào)控途徑，為肝肺綜合征的治療提供新靶點(diǎn)。但本研究僅局限于CBDL模型體內(nèi)研究SerpinB1的表達(dá)變化及其與Erk1/2的關(guān)系，尚未進(jìn)行干擾SerpinB1表達(dá)后的觀察，尚未在內(nèi)皮細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)。下一步深入研究需要在細(xì)胞水平進(jìn)行干擾后并觀察其對內(nèi)皮細(xì)胞增值遷移能力的影響。