DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1在一氧化氮合酶抑制劑誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中的作用

馬曉莉 吳凱 張輝 王艷華 柴麗芬 楊曉玲 姜怡鄧 張慧萍

寧夏醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)院，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（銀川 750004）；3寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院（銀川 750004）

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種以高血壓和蛋白尿為主要臨床表現(xiàn)、嚴(yán)重危害母兒健康的妊娠期特發(fā)性疾病。在我國發(fā)病率為2%～8%，是圍生期母嬰死亡的主要原因之一［1］。在正常妊娠過程中，滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮蛻膜和子宮螺旋動脈，代替血管內(nèi)皮細(xì)胞，將狹窄的彈性血管變?yōu)榈妥?、無彈性且擴張的子宮胎盤血管，完成子宮螺旋動脈的重塑，維持胎盤正常的功能［2］；相反，滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙可能導(dǎo)致一系列胎盤功能障礙性疾病的發(fā)生，如流產(chǎn)、死胎、胎兒生長受限、先兆子癇等，因此，深入探討PE的防治策略成為產(chǎn)科亟待解決的熱點問題之一。細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老一樣，參與生物的發(fā)育、生長等多種過程，它是十分重要的生物學(xué)現(xiàn)象。研究表明，自噬在人類胎盤的生成及發(fā)育中扮演重要作用，但其作用機制尚不清楚。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferases 1，DNMT1）是維持脊椎動物DNA甲基化狀態(tài)最重要的酶，可決定基因組甲基化方式、功能和維持甲基轉(zhuǎn)移活性而沉默基因［3］。DNMT1是哺乳動物最主要的甲基轉(zhuǎn)移酶，表達(dá)于復(fù)制狀態(tài)的增殖細(xì)胞，但關(guān)于DNMT1對胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的影響目前未見報道。因此，本研究以人源的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞作為研究對象，采用L?NAME干預(yù)細(xì)胞后并過表達(dá)或抑制DNMT1的表達(dá)，檢測自噬相關(guān)指標(biāo)的變化，旨在揭示DNMT1對L?NAME誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人源胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株（HTR?8/SVneo）購自上海復(fù)旦細(xì)胞庫（上海瑞鹿生物科技有限公司）；N?硝基?L?精氨酸甲酯（L?NAME）（美國Sigma公司）；胎牛血清、1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；青鏈霉素、胰蛋白酶消化液（碧云天生物技術(shù)研究所）；anti?DNMT1抗體（ab188453）、anti?LC3B 抗體（L7543/SIGMA）、anti?p62抗體（ab56416），anti?β?actin抗體（中國中杉金橋公司）；RNA提取試劑盒、熒光定量檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermofisher scientific）；引物由上海生工公司合成；shRNA?DNMT1由上海吉凱生物公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清、100 kU/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，保持溫度及CO2濃度恒定。

1.2.2 實驗設(shè)計及分組將HTR?8/SVneo細(xì)胞分為對照組（0 μmol/L L?NAME）和實驗組，每組3例樣品。實驗組包括：100 μmol/L L?NAME 組；Ad?GFP組（空載體腺病毒表達(dá)GFP）；Ad?DNMT1組（腺病毒包裝的過表達(dá)DNMT1）；shRNA?DNMT1組（DNMT1干擾片段：shRNA1、shRNA2、shRNA3序列）見表1。

1.2.3 熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞中DNMT1mRNA表達(dá)按Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫查詢DNMT1的基因序列并設(shè)計引物。得出DNMT1 Forward：5′?CAGGACTACGCAAGGTTTGAG?3′，Reverse：5′?CG?GATACAAGATAGGCAGAACT?3′；GAPDH Forward：5′?GGTGAAGGTCGGTGTGAACG?3′，Reverse：下游引物5′?CTCGCTCCTGGAAGATGGTG?3′，PCR 擴增程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72℃10 min，共45個循環(huán)，并設(shè)空白對照和內(nèi)參（GADPH）對照同體系擴增。目的基因的相對量根據(jù)公式 2?△△Ct計算，△△Ct=［Ct（Sample）（待測樣本）-Ct（GAPDH）（待測樣本）］-［Ct（GI）（校正樣本）-Ct（GAPDH）（校正樣本）］，Sample是目的基因，校正樣品是任何被選做代表1倍目的基因表達(dá)量的樣品，2-△△Ct表示的是目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。

表1 DNMT1 Target序列信息Tab.1 The sequence information of DNMT1 target

1.2.4 DNMT1腺病毒感染HTR?8/SVneo細(xì)胞將狀態(tài)好的HTR?8/SVneo細(xì)胞鋪于六孔板中，培養(yǎng)過夜后棄培養(yǎng)基，PBS清洗，重復(fù)3次，加入1 mL 1640培養(yǎng)基及相應(yīng)數(shù)量的病毒液，每隔15 min輕輕搖晃一下，感染時間為2 h，棄培養(yǎng)基，加入2 mL完全培養(yǎng)基，感染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察HTR?8/SVneo細(xì)胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 Western blot測定各組細(xì)胞中DNMT1、LC3和p62的蛋白表達(dá)根據(jù)蛋白提取試劑盒說明提取各組細(xì)胞蛋白，加入上樣緩沖液煮沸變性。每孔30 μg 蛋白樣品，SDS PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至0.22 μm PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBST洗膜10 min×3次，加入DNMT1、LC3B、p62抗體（1∶1 000）或β?actin（1∶1 000），4 ℃過夜，PBST洗膜10 min ×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，PBST洗膜10 min×3次，ECL化學(xué)發(fā)光。以DNMT1、LC3B、p62分別與β?actin的光密度值比值作為DNMT1、LC3B、p62蛋白表達(dá)的相對量。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法用Prism 5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以表示，計量資料兩組對比采用t檢驗，多樣本均數(shù)間比較采用One?way ANOVA檢驗，組間兩兩比較用 Student?Newman?Keuls檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 L?NAME干預(yù)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞后自噬的改變L?NAME 干預(yù)HTR?8/SVneo細(xì)胞后，與對照組比較，100 μmol/L L?NAME組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)明顯增高，而p62表達(dá)明顯降低，提示L?NAME誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生自噬。見圖1。

2.2 L?NAME干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后DNMT1的表達(dá)與對照組相比，L?NAME組DNMT1 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖1 L?NAME干預(yù)HTR?8/SVneo細(xì)胞后LC3 BⅡ/Ⅰ和p62的蛋白表達(dá)Fig.1 The expression of LC3B II/I and p62 protein after HTR?8/SVneo cells treated with L?NAME

2.3 DNMT1干擾和過表達(dá)后檢測其自身的mRNA和蛋白表達(dá)為了進(jìn)一步明確DNMT1對滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的作用，首先，我們將DNMT1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后，運用qRT?PCR和Western blot檢測DNMT1表達(dá)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，shRNA1組DNMT1 mRNA和蛋白水平降低最明顯（P＜0.05）。其次，我們將腺病毒包裝的DNMT1感染滋養(yǎng)細(xì)胞48 h后，應(yīng)用qRT?PCR和Western blot檢測DNMT1表達(dá)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Ad?GFP組比較，Ad?DNMT1組DNMT1 mRNA和蛋白水平顯著升高（P＜0.05），以上說明DNMT1干擾質(zhì)粒和過表達(dá)腺病毒分別轉(zhuǎn)染和感染成功。見圖3。

2.4 干擾和過表達(dá)DNMT1后檢測自噬水平的改變?yōu)檫M(jìn)一步明確DNMT1在L?NAME誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中的作用，將DNMT1過表達(dá)后，與L?NAME組比較，LC3 BⅡ/Ⅰ水平降低，而p62蛋白表達(dá)增加。DNMT1干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞后，同時L?NAME干預(yù)細(xì)胞48 h，檢測了自噬蛋白LC3B、p62的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與L?NAME組比較，抑制DNMT1后，LC3 BⅡ/Ⅰ水平升高，而p62蛋白表達(dá)降低。見圖4。

圖2 L?NAME干預(yù)HTR?8/SVneo細(xì)胞后DNMT1的表達(dá)Fig.2 The expression of DNMT1 after HTR?8/SVneo cells treated with L?NAME

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮（NO）在維持滋養(yǎng)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)胎盤血管阻力等方面發(fā)揮重要作用［4］。胎盤合成NO減少，能夠促進(jìn)胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)一步對滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤、遷移等過程造成影響，然而自噬在NO介導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙中的作用尚未見報道?；诖?，本研究擬采用一氧化氮合酶抑制劑（L?NAME）干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后，觀察滋養(yǎng)細(xì)胞自噬水平改變并探討其可能的機制。

圖3 DNMT1干擾和過表達(dá)后檢測DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)Fig.3 The mRNA and protein expression of DNMT1 in HTR?8/SVneo cells after knockdown and over?expressed DNMT1

越來越多的證據(jù)表明自噬在胎盤形成中發(fā)揮重要作用，無論是參與正常妊娠還是PE和胎兒生長受限，但目前有關(guān)自噬異常引起胎盤功能障礙的機制尚未清楚。細(xì)胞自噬的激活受多種自噬相關(guān)基因（autophagy?related gene，ATG）調(diào)控［5］，其中LC3是自噬體膜上重要的標(biāo)記蛋白，它在細(xì)胞內(nèi)以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ兩種形式存在，在自噬發(fā)生過程中，LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ并定位于自噬體膜，因此LC3Ⅱ/Ⅰ可以反映自噬水平的高低［6］。p62是一種可與Atg8/LC3結(jié)合的多功能蛋白質(zhì)，二者結(jié)合后產(chǎn)生蛋白酶體活性并誘導(dǎo)自噬。如果改變p62水平，可導(dǎo)致一些疾病的產(chǎn)生［7］。AKAISHI等［8］研究妊娠高血壓疾?。℉DCP）胎盤組織中LC3?Ⅱ和p62的表達(dá)并發(fā)現(xiàn)LC3?Ⅱ表達(dá)升高，而p62表達(dá)下降。本研究中L?NAME干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白LC3明顯增加，而p62則表現(xiàn)為降低，與文獻(xiàn)報道的一致。有關(guān)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬水平升高引起PE的可能解釋是：一方面由于滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬活性過強，使滋養(yǎng)細(xì)胞過度死亡，侵入螺旋小動脈能力減弱從而加重PE；另一方面導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的機制還有氧化應(yīng)激、母胎免疫反應(yīng)異常和子宮螺旋小動脈“血管重鑄”異常等，滋養(yǎng)細(xì)胞的異常侵襲可造成一系列疾?。?］，暗示自噬參與了PE疾病的發(fā)生，但其機制仍需進(jìn)一步探討。

圖4 干擾和過表達(dá)DNMT1后檢測LC3 BⅡ/Ⅰ和p62的表達(dá)Fig.4 The expression of LC3BⅡ/Ⅰand p62 protein were detected after knockdown and overexpressed DNMT1。

DNMT1是人體發(fā)育過程中必需的基因，定位于人類19pl3.2?19pl3.3，是人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)最早且比較重要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）［10］，主要維持有絲分裂期DNA的甲基化狀態(tài)，其在細(xì)胞增殖、凋亡、分化中發(fā)揮重要的作用。文獻(xiàn)報道，與正常足月胎盤組織比較，PE胎盤組織中DNMTs表達(dá)明顯降低［11］。在本研究中，100 μmol/L L?NAME干預(yù)滋養(yǎng)細(xì)胞后DNMT1 mRNA及蛋白水平均顯著降低，這與文獻(xiàn)報道的一致，提示DNMT1可能是L?NAME誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬過程中的重要調(diào)節(jié)因子，但關(guān)于DNMT1對胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的影響目前國內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報道。為了進(jìn)一步探討DNMT1在L?NAME誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中的作用，我們分別干擾和過表達(dá)DNMT1后發(fā)現(xiàn)，干擾DNMT1后導(dǎo)致自噬水平增加，過表達(dá)DNMT1后正好相反，說明DNMT1能夠抑制L?NAME誘導(dǎo)的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生自噬。另外，在肝癌細(xì)胞中干擾DNMT1和DNMT3b后抑制肝癌細(xì)胞的增殖且促進(jìn)細(xì)胞凋亡；同時，ANG等觀察到HTR?8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)DNMTs抑制劑（AZC）處理后發(fā)生去甲基化、遷移和侵襲能力下降，綜上均提示DNMT1參與調(diào)控了細(xì)胞的行為學(xué)改變。且課題組前期也發(fā)現(xiàn)DNMT1下調(diào)導(dǎo)致FABP4啟動子區(qū)發(fā)生低甲基化，進(jìn)而上調(diào)FABP4表達(dá)引起胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞脂代謝異常［12］。因此筆者推測L?NAME降低DNMT1水平可能會造成自噬相關(guān)基因的啟動子區(qū)DNA發(fā)生低甲基化，從而引起自噬相關(guān)基因在PE患者體內(nèi)高表達(dá)，因此LC3水平增加，而p62降低，DNMT1可能通過這樣的機制在PE的發(fā)病中起作用，但是其具體機制正在探索中。

綜上所述，DNMT1能夠抑制L?NAME誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生自噬，DNMT1可作為調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵基因，對其具體機制的進(jìn)一步研究，將為防治PE提供一定的理論依據(jù)。