人工基因線路的研究進(jìn)展和未來(lái)挑戰(zhàn)

婁春波 杜沛 孟凡康 季翔宇 張益豪

合成生物學(xué)是一門(mén)利用工程學(xué)原理改造和創(chuàng)造生命的學(xué)科，目前已經(jīng)在生物能源、新材料、環(huán)境污染治理、腫瘤治療等方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，能夠在國(guó)家科技發(fā)展、產(chǎn)業(yè)升級(jí)過(guò)程中發(fā)揮重大作用，助力“中國(guó)制造 2025”。與傳統(tǒng)生物工程相比，合成生物學(xué)最大的進(jìn)步在于對(duì)工程設(shè)計(jì)原理的系統(tǒng)性應(yīng)用：依據(jù)工程設(shè)計(jì)原理對(duì)天然存在的各種酶、調(diào)控分子等進(jìn)行簡(jiǎn)單化、模塊化處理，設(shè)計(jì)出具有各種基本功能的元件。人工基因線路是利用此類(lèi)元件，根據(jù)類(lèi)似于電子工程電路編程的思想設(shè)計(jì)的，對(duì)生命的運(yùn)行過(guò)程進(jìn)行的重新編程。這種對(duì)生命的重編程能夠針對(duì)多樣的需求對(duì)天然的各種功能進(jìn)行優(yōu)化，甚至引入自然界中不存在的人造法則，實(shí)現(xiàn)豐富的、可設(shè)計(jì)的生物學(xué)功能，為人類(lèi)健康和社會(huì)發(fā)展服務(wù)。

1 人工基因線路的起源和研究進(jìn)展

自然界中存在大量的天然基因線路，是生命體用于收集和處理各種體內(nèi)生化信號(hào)和體外環(huán)境變化的動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)，其與物質(zhì)代謝、能量供給共同構(gòu)成了生命過(guò)程的3個(gè)基本要素。所有生物體均由物質(zhì)構(gòu)成，由能量驅(qū)動(dòng)，并由基因線路控制物質(zhì)的代謝和能量的流動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)多樣的生理活動(dòng)，如細(xì)胞分裂、個(gè)體形態(tài)發(fā)育等。同時(shí)，生物體對(duì)外界環(huán)境變化的適應(yīng)和抗逆反應(yīng)也依賴(lài)于基因線路。例如：人體細(xì)胞在血糖濃度升高時(shí)對(duì)胰島素的分泌；組織受損時(shí)啟動(dòng)組織再生；大量失血時(shí)促進(jìn)造血干細(xì)胞分化等。與天然基因線路不同，人工基因線路存在的目的是根據(jù)人工生命體的設(shè)計(jì)目標(biāo)，進(jìn)行有針對(duì)性的控制，實(shí)現(xiàn)特定的控制邏輯，發(fā)揮類(lèi)似于計(jì)算機(jī)控制芯片的功能。因此，人工基因線路是對(duì)生命進(jìn)行可編程控制的具體體現(xiàn)，是合成生物學(xué)的標(biāo)志性技術(shù)。

對(duì)生命的編程如同電路編程一樣，需要使用大量工程化的元器件，如計(jì)數(shù)器、脈沖信號(hào)產(chǎn)生器、邏輯信號(hào)門(mén)、信號(hào)過(guò)濾器等，以實(shí)現(xiàn)從低級(jí)到高級(jí)，由簡(jiǎn)單到復(fù)雜的控制。為了構(gòu)建出此類(lèi)元器件，需要在傳統(tǒng)生物學(xué)多年來(lái)對(duì)生命調(diào)控法則的認(rèn)識(shí)基礎(chǔ)上，按照工程化設(shè)計(jì)原理對(duì)生命系統(tǒng)進(jìn)行簡(jiǎn)單化處理，再進(jìn)一步按照不同的方式進(jìn)行組合而成。盡管人工基因線路與電子線路都是信號(hào)采集和處理的信息運(yùn)算系統(tǒng)，兩者在很多方面又是截然不同的?；蚓€路的工作環(huán)境是動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)的活體細(xì)胞，是大量各種分子的混合物，而電子線路的工作環(huán)境是固體金屬和半導(dǎo)體材料，各個(gè)元件之間很容易實(shí)現(xiàn)絕緣。這些差異決定了針對(duì)基因線路的設(shè)計(jì)與組裝必須要探索新途徑，而不是簡(jiǎn)單地照搬照抄電子線路的成功方案。

在過(guò)去20年間，合成生物學(xué)領(lǐng)域出現(xiàn)了一批奠基性的工作，在人工基因線路設(shè)計(jì)、調(diào)控元件以及組裝方法等方面實(shí)現(xiàn)了“從0到1”的躍進(jìn)。相應(yīng)地，人工基因線路也經(jīng)歷了從基本型到組合型的升級(jí)，已經(jīng)開(kāi)始具備對(duì)高級(jí)的生命過(guò)程進(jìn)行模擬和探索的能力。

1.1 基本型人工基因線路

基本型的人工基因線路是基于生物學(xué)對(duì)生命系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，以電子工程的方式設(shè)計(jì)、模擬并構(gòu)建的基本生物控制器件，包括遺傳開(kāi)關(guān)、生物振蕩器、計(jì)數(shù)器、脈沖信號(hào)產(chǎn)生器、邏輯信號(hào)門(mén)、信號(hào)過(guò)濾器等。2000年，波士頓大學(xué)的Collins課題組設(shè)計(jì)出了第一個(gè)合成生物學(xué)功能模塊——轉(zhuǎn)錄水平的雙穩(wěn)態(tài)開(kāi)關(guān)。該模塊成功地在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)的雙穩(wěn)態(tài)效應(yīng)，可以作為基本型的遺傳開(kāi)關(guān)使用。同年，普林斯頓大學(xué)的Elowitz和Leibler實(shí)現(xiàn)了更為復(fù)雜的功能模塊——基因表達(dá)振蕩器。該器件利用 3個(gè)基因模塊彼此間的抑制和解抑制作用實(shí)現(xiàn)了輸出信號(hào)的規(guī)律振蕩。以上兩項(xiàng)工作在理論和實(shí)驗(yàn)層面證明了理性設(shè)計(jì)生物元器件的可能性，對(duì)合成生物學(xué)發(fā)展有重大指導(dǎo)意義，因此被稱(chēng)為“合成生物學(xué)的里程碑”。作為邏輯電路的基本元件，過(guò)去 20年間還出現(xiàn)了各種邏輯門(mén)，包括“與門(mén)”“非門(mén)”“或門(mén)”等。例如，一種“與門(mén)”利用帶有琥珀突變的T7噬菌體RNA聚合酶和能夠拯救琥珀突變的tRNA構(gòu)建的獨(dú)立輸入信號(hào)，可以整合處理環(huán)境中任意兩種信號(hào)輸入并相應(yīng)地給出下游輸出。類(lèi)似的邏輯門(mén)、基因開(kāi)關(guān)和振蕩器等基本型人工基因線路不僅可由原核生物中各種基礎(chǔ)調(diào)控元件拼裝，還能由更復(fù)雜的調(diào)控元件和信號(hào)傳導(dǎo)元件構(gòu)建而成，在真核生物乃至人體細(xì)胞中發(fā)揮功能。

1.2 組合型人工基因線路

利用基本型人工基因線路作為基礎(chǔ)器件，可以搭建出復(fù)雜的組合型人工基因線路，用于模擬高級(jí)的生命過(guò)程。2014年，北京大學(xué)歐陽(yáng)頎課題組設(shè)計(jì)出了一種具有巴甫洛夫經(jīng)典條件反射行為的人工基因線路，在大腸桿菌中重現(xiàn)了高等生物的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)功能。該基因線路由2個(gè)邏輯“與門(mén)”、2個(gè)邏輯“或門(mén)”和 1個(gè)記憶模塊組成，能夠接收1個(gè)不引起輸出響應(yīng)的外界信號(hào)分子A和1個(gè)可引發(fā)輸出響應(yīng)的環(huán)境信號(hào) B。此 2種信號(hào)組合的多次共刺激能使大腸桿菌的記憶狀態(tài)發(fā)生改變，最終使信號(hào)A能夠單獨(dú)引起輸出響應(yīng)。2012年，麻省理工學(xué)院的Voigt課題組把3個(gè)二進(jìn)制邏輯“與門(mén)”組裝為1個(gè)巨大的四進(jìn)制邏輯“與門(mén)”，實(shí)現(xiàn)了能夠同時(shí)感知 4種不同環(huán)境信號(hào)的人工基因網(wǎng)絡(luò)。以上兩項(xiàng)工作外，還由很多有用的組合型人工基因線路，如加法器、邊界識(shí)別器、多輸入的邏輯線路等。

為了實(shí)現(xiàn)更高級(jí)的控制功能，人工基因線路勢(shì)必變得越來(lái)越復(fù)雜，隨之而來(lái)的是設(shè)計(jì)難度的迅速提升。電子線路設(shè)計(jì)領(lǐng)域在20世紀(jì)遇到過(guò)類(lèi)似的問(wèn)題，其解決方法是基于計(jì)算機(jī)程序的自動(dòng)化線路設(shè)計(jì)和模擬。因此，在 2016年，Voigt課題組開(kāi)發(fā)出了一種能用于自動(dòng)設(shè)計(jì)組合型復(fù)雜人工基因線路的計(jì)算機(jī)程序“Cello”（意為“cellular logic”），能根據(jù)用戶需求自動(dòng)化地給出可執(zhí)行布爾邏輯運(yùn)算的基因線路設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)類(lèi)似于電子工程領(lǐng)域電路設(shè)計(jì)軟件的功能。該程序整合了大量轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的表征數(shù)據(jù)，生物元件組裝的經(jīng)驗(yàn)，已知元件的生物學(xué)限制條件，以及邏輯線路的自動(dòng)編譯工具等。用戶選擇輸入信號(hào)、輸出信號(hào)、宿主細(xì)胞等信息后，程序會(huì)從標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的表征數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選合適元件，從動(dòng)力學(xué)區(qū)間、生物毒性等問(wèn)題出發(fā)進(jìn)行模擬和優(yōu)化，輸出線路的DNA序列和定量預(yù)測(cè)結(jié)果。最終，研究人員可以直接將DNA序列合成、裝載到宿主細(xì)胞中執(zhí)行功能。該程序能夠大幅提高對(duì)人工基因線路的設(shè)計(jì)效率。

2 人工基因線路的應(yīng)用

目前，人工基因線路已經(jīng)在基礎(chǔ)科研和實(shí)際應(yīng)用兩方面發(fā)揮了重要作用。在基礎(chǔ)科研領(lǐng)域，合成生物學(xué)對(duì)天然的生物系統(tǒng)進(jìn)行干擾、重建乃至再創(chuàng)的能力已經(jīng)成為生物學(xué)家探索生命的強(qiáng)大工具，能夠用于研究復(fù)雜生物的運(yùn)行規(guī)律。在實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域，人工基因線路也已經(jīng)在代謝工程、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、能源等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力，極大推動(dòng)了這些領(lǐng)域的發(fā)展。

2.1 “建物致知”――人工基因線路在基礎(chǔ)科研中的應(yīng)用

利用人工的基因線路元件，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)天然的基因線路的重編程，構(gòu)建超越進(jìn)化法則的人造生命過(guò)程，用于探索傳統(tǒng)生物學(xué)難以研究的一些基本科學(xué)問(wèn)題。這種方法被稱(chēng)為“建物致知”。目前，該方法已經(jīng)為生命起源、生物進(jìn)化、生命網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等方面的研究開(kāi)啟了更加廣闊的空間。

例如，細(xì)胞在應(yīng)激調(diào)控中會(huì)專(zhuān)一性地利用某種特定的調(diào)控拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)。因此，可以通過(guò)替換拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中某些特定的元件對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重編程，從而深入了解天然基因線路的某些特性。2009年，美國(guó)加州理工大學(xué)Elowitz課題組在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建了一個(gè)“先正后負(fù)”的人工負(fù)反饋基因線路，替換了天然的“先負(fù)后正”的負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)。他們發(fā)現(xiàn)，這種人工負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生的感受態(tài)響應(yīng)持續(xù)時(shí)間短、噪聲小，而天然負(fù)反饋網(wǎng)絡(luò)的感受態(tài)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短不一，分布特別寬。這一發(fā)現(xiàn)揭示了一種生命體在適應(yīng)環(huán)境方面的生存策略，即利用放大基因表達(dá)噪聲來(lái)適應(yīng)環(huán)境的多變和不確定性。

相比于細(xì)菌，高等生物的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜，也存在更多的未知領(lǐng)域，能夠賦予“建物致知”研究方法更大的發(fā)揮空間。早在2003年，美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的 Lim課題組在研究酵母細(xì)胞對(duì)環(huán)境信號(hào)的響應(yīng)策略時(shí)，通過(guò)對(duì)兩種完全不同的信號(hào)通路——有性生殖響應(yīng)和高滲透壓響應(yīng)的重編程，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩種輸入信號(hào)和輸出信號(hào)的嫁接，以此證明了MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的支架蛋白是空間上區(qū)域化的信號(hào)節(jié)點(diǎn)。同時(shí)，該工作還證明了只要將基于支架蛋白的層次性信號(hào)——蛋白磷酸化反應(yīng)整合在一起，就能獲得完全依賴(lài)于蛋白質(zhì)相互作用的、可重新編程配置的人工信號(hào)通路。類(lèi)似的調(diào)控拓?fù)涮鎿Q和信號(hào)通路嫁接工作還有很多，比如人工改變了調(diào)控順序的lambda噬菌體開(kāi)關(guān)，被嫁接了輸入和輸出信號(hào)的雙組分調(diào)控系統(tǒng)等。這些研究不僅加深了人們對(duì)天然基因線路生理學(xué)功能的認(rèn)識(shí)，而且為基因線路的從頭設(shè)計(jì)提供了高質(zhì)量的基本調(diào)控元件。

2.2 人工基因線路的實(shí)際應(yīng)用

計(jì)算機(jī)芯片是各種電器中不可缺少的核心設(shè)備，控制著電器的各種功能，同時(shí)帶來(lái)“智能化”的響應(yīng)。與之類(lèi)似，人工基因線路作為各種合成生物學(xué)應(yīng)用的可編程控制組件，往往能夠?qū)崿F(xiàn)一些傳統(tǒng)技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)的、“智能化”的控制方式。

在腫瘤治療領(lǐng)域，CAR-T技術(shù)已經(jīng)展現(xiàn)出了有目共睹的治療效果，但也在T細(xì)胞激活水平調(diào)節(jié)、靶向特異性、信號(hào)通路調(diào)控等方面存在提升的空間。針對(duì)這些問(wèn)題，波士頓大學(xué)的 Wong課題組提出了一種新型的CAR-T設(shè)計(jì)方案——“SUPRA CAR”，被諸多科技媒體稱(chēng)為新一代的CAR-T療法，引起了廣泛關(guān)注。SUPRA CAR方案通過(guò)將CAR-T固定式的細(xì)胞外scFV單鏈抗體與細(xì)胞內(nèi) CD3z信號(hào)結(jié)構(gòu)域拆分為由亮氨酸拉鏈（Leucine-Zipper）這種通用結(jié)構(gòu)連接的兩部分，分別實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩部分的模塊化設(shè)計(jì)和可編程性，為人工基因線路設(shè)計(jì)創(chuàng)造了可能。基于該方案設(shè)計(jì)的人工基因線路能夠?qū)Χ喾N抗原信號(hào)產(chǎn)生邏輯響應(yīng)，并且調(diào)控不同免疫細(xì)胞類(lèi)型的信號(hào)通路。通過(guò)合適的線路設(shè)計(jì)，還實(shí)現(xiàn)了調(diào)節(jié) T細(xì)胞激活反應(yīng)強(qiáng)度，以減輕治療的副作用。

此外，在代謝工程領(lǐng)域，人工基因線路也展現(xiàn)出了“智能化”控制的潛力，提供了更好的解決方案?；诩?xì)菌群體感應(yīng)功能設(shè)計(jì)的人工基因線路能夠根據(jù)細(xì)菌數(shù)量對(duì)目的基因表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，使對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有負(fù)面影響的基因在細(xì)菌達(dá)到一定數(shù)量之后再表達(dá)，規(guī)避了傳統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程中微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的矛盾，實(shí)現(xiàn)了對(duì)發(fā)酵過(guò)程“先生長(zhǎng)，再生產(chǎn)”的動(dòng)態(tài)調(diào)控，同時(shí)也避免了使用昂貴的誘導(dǎo)劑。

3 人工基因線路設(shè)計(jì)的挑戰(zhàn)

使用人工基因線路執(zhí)行控制功能時(shí)，需要將該線路裝載到不同的底盤(pán)生物中。不同領(lǐng)域的應(yīng)用對(duì)底盤(pán)生物需求的多樣性要求人工基因線路對(duì)底盤(pán)生物的適應(yīng)性。為了達(dá)到此目標(biāo)，需要對(duì)人工基因線路進(jìn)行“模塊化”設(shè)計(jì)?！澳K化”是合成生物學(xué)元件的核心屬性之一，設(shè)計(jì)目標(biāo)是將生物系統(tǒng)拆解為功能上相互獨(dú)立的模塊，并保證模塊間的拼裝不會(huì)導(dǎo)致模塊功能的改變。模塊化設(shè)計(jì)能使構(gòu)建的生物系統(tǒng)像電子系統(tǒng)一樣進(jìn)行規(guī)模擴(kuò)展和尺度放大，因此合成生物學(xué)領(lǐng)域的大量工作都注重模塊化元件的開(kāi)發(fā)。然而，事實(shí)遠(yuǎn)比設(shè)想中復(fù)雜?；蚧芈凡⒉荒?chē)?yán)格地和宿主細(xì)胞隔離，而是與細(xì)胞的生理狀態(tài)耦合形成一個(gè)整體，人工基因線路會(huì)對(duì)細(xì)胞生理產(chǎn)生一些不可預(yù)知的干涉性影響，而這些干涉性影響也使理論上“模塊化”的生物元件和基因線路失去了可預(yù)測(cè)性，不再“模塊化”。這就導(dǎo)致在一種生物中精細(xì)刻畫(huà)過(guò)的元件性質(zhì)并不能在另一種生物中直接成立，因?yàn)樵坏┟撾x了刻畫(huà)時(shí)的細(xì)胞生理狀態(tài)，其行為就有可能偏離預(yù)期。如果不能克服這個(gè)問(wèn)題，合成生物元件就不能像電子元件一樣使用簡(jiǎn)單元件逐步搭建復(fù)雜線路，而是需要耗費(fèi)大量時(shí)間和精力對(duì)單個(gè)底盤(pán)生物中的元件進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的優(yōu)化。目前，人工基因線路的設(shè)計(jì)挑戰(zhàn)主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：① 人工基因元件過(guò)表達(dá)引發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)壓力和細(xì)胞毒性；② 細(xì)胞體內(nèi)存在一些會(huì)影響人工基因線路功能的特殊生理機(jī)制。

3.1 人工基因線路過(guò)表達(dá)引發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)壓力和細(xì)胞毒性

細(xì)胞利用有限的資源完成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取、能量代謝、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂等諸多生理過(guò)程。為了優(yōu)化自身的生長(zhǎng)，細(xì)胞需要根據(jù)環(huán)境平衡分配這些資源。當(dāng)人工基因線路的加入打破了這種平衡，就可能引發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)壓力（burden），影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。細(xì)胞的生長(zhǎng)壓力主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，① 人工基因線路在蛋白表達(dá)過(guò)程中占用了底盤(pán)細(xì)胞的RNA聚合酶和核糖體，以及相關(guān)的輔酶、能量等資源。② 過(guò)量表達(dá)蛋白還可能引起細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，激活一些細(xì)胞應(yīng)激途徑如ppGpp等。除了生長(zhǎng)壓力，人工基因線路還可能帶來(lái)細(xì)胞毒性（toxicity）。與生長(zhǎng)壓力不同，細(xì)胞毒性產(chǎn)生的原因是人工基因線路調(diào)控過(guò)程中的脫靶效應(yīng)對(duì)底盤(pán)細(xì)胞的正常生理活動(dòng)產(chǎn)生的干擾，而非由于對(duì)細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)資源的占用。

當(dāng)?shù)妆P(pán)細(xì)胞因?yàn)樯L(zhǎng)壓力或細(xì)胞毒性而生長(zhǎng)減緩時(shí)，會(huì)反過(guò)來(lái)對(duì)其內(nèi)部人工基因線路的可預(yù)測(cè)性和遺傳穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，基于 TetR家族阻遏蛋白設(shè)計(jì)的元件中，一些阻遏蛋白可能會(huì)與底盤(pán)細(xì)胞基因組上非特異靶位點(diǎn)的結(jié)合，從而影響底盤(pán)細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也降低了這些元件的可預(yù)測(cè)性。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，人工基因線路的序列可能產(chǎn)生各種隨機(jī)突變。通常這些突變帶來(lái)的影響非常小，但如果某種突變體為其所在的細(xì)胞帶來(lái)了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，就會(huì)很快占據(jù)群落的主體，使人工基因線路在群體層次上失效。例如，一種基于群體感應(yīng)設(shè)計(jì)的、控制細(xì)胞群體大小的元件在傳代培養(yǎng)3～6 d后，就由于逃脫調(diào)控的突變體發(fā)生大量增殖而失效。

許多已經(jīng)廣泛使用的優(yōu)質(zhì)元件也因?yàn)樽陨淼募?xì)胞毒性限制了其發(fā)揮和推廣。例如，CRISPRi-dCas9（CRISPR interference-dCas9）調(diào)控系統(tǒng)被認(rèn)為是優(yōu)秀的可編程的調(diào)控元件，目前已被廣泛用于基因線路的構(gòu)建。然而，隨著dCas9表達(dá)量升高，細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)明顯的遲滯。一些研究者認(rèn)為該毒性來(lái)源于CRISPR的脫靶效應(yīng)。因而在 CRISPRi-dCas9的實(shí)際使用過(guò)程中，研究者需要耗費(fèi)大量精力來(lái)平衡轉(zhuǎn)錄調(diào)控開(kāi)關(guān)的正面影響與其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)面影響。合成生物學(xué)的元件設(shè)計(jì)最終要針對(duì)下游應(yīng)用問(wèn)題進(jìn)行調(diào)整，而下游應(yīng)用需要宿主細(xì)胞健康、快速生長(zhǎng)，因此元件的細(xì)胞毒性將是合成生物學(xué)走向應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題之一。

3.2 細(xì)胞內(nèi)的一些特殊生理機(jī)制會(huì)影響人工基因線路的功能

細(xì)胞內(nèi)存在的一些生理機(jī)制也可能會(huì)對(duì)元件的功能產(chǎn)生意料之外的影響，如排隊(duì)效應(yīng)（queueing-up effect）和追溯效力（retroactivity）。合成生物元件和底盤(pán)細(xì)胞共同利用細(xì)胞內(nèi)的酶、核糖體等有限資源，資源競(jìng)爭(zhēng)會(huì)導(dǎo)致設(shè)計(jì)上本互不相關(guān)的基因線路元件產(chǎn)生功能上的干涉。例如，帶有LAA蛋白降解標(biāo)簽的黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白在同一大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)時(shí)，可能過(guò)載細(xì)胞內(nèi)的 ClpXP降解機(jī)器，使得兩種不同的熒光蛋白不得不排隊(duì)進(jìn)入 ClpXP的降解通道，從而使兩種不相關(guān)的蛋白降解過(guò)程產(chǎn)生干涉。這一機(jī)制被稱(chēng)為排隊(duì)效應(yīng)。與此類(lèi)似，細(xì)胞內(nèi)核糖體的數(shù)量不足時(shí)，mRNA的翻譯也會(huì)出現(xiàn)對(duì)核糖體的競(jìng)爭(zhēng)，從而導(dǎo)致不相關(guān)的mRNA翻譯產(chǎn)生排隊(duì)效應(yīng)。追溯效力是指信號(hào)通路下游的系統(tǒng)給上游系統(tǒng)帶來(lái)信號(hào)反饋，從而影響上游系統(tǒng)功能的效應(yīng)。具體而言，人工基因線路中一個(gè)基因被調(diào)控的程度，可能會(huì)被其他接受同類(lèi)調(diào)控的基因的個(gè)數(shù)所影響，類(lèi)似于一個(gè)電阻兩端的電壓差依賴(lài)于其他并聯(lián)電阻的數(shù)目一樣。排隊(duì)效應(yīng)和追溯效力都會(huì)給人工基因線路的功能帶來(lái)嚴(yán)重影響，但設(shè)計(jì)時(shí)卻很難被面面俱到地考慮到，因此為人工基因線路的可預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)帶來(lái)挑戰(zhàn)。

4 結(jié)論與展望

人工基因線路設(shè)計(jì)、調(diào)控元件工具箱以及組裝方法的開(kāi)發(fā)在過(guò)去十幾年間經(jīng)歷了巨大的發(fā)展，然而人工基因線路與底盤(pán)細(xì)胞的各種相互作用卻阻礙了人工設(shè)計(jì)的生命系統(tǒng)的復(fù)雜度進(jìn)一步提升。為了突破這個(gè)瓶頸，需要關(guān)注一些合成生物學(xué)領(lǐng)域的基本工程科學(xué)問(wèn)題，如細(xì)胞生理系統(tǒng)對(duì)人工基因線路的影響及相關(guān)元件設(shè)計(jì)原則等，來(lái)獲得對(duì)未來(lái)人工基因線路研究方向的啟發(fā)。我們認(rèn)為，未來(lái)研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下問(wèn)題：① 注重元件在不同培養(yǎng)條件下功能和行為的刻畫(huà)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表述和定量方式進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，便于數(shù)據(jù)的整合和分享；② 開(kāi)發(fā)基于轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等多層次的高通量技術(shù)，降低獲取合成生物的全局表型數(shù)據(jù)庫(kù)的金錢(qián)和時(shí)間成本，并做針對(duì)性的數(shù)據(jù)挖掘，為理解元件—宿主相互作用的產(chǎn)生機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持；③ 根據(jù)需要開(kāi)發(fā)新型的全細(xì)胞模型，用于描述資源分配等細(xì)胞生理規(guī)律，增強(qiáng)人工合成生物系統(tǒng)的預(yù)測(cè)性；④ 研發(fā)元件—宿主隔離技術(shù)和策略，總結(jié)消除兩者相互作用影響的設(shè)計(jì)原則。相關(guān)方面的深入研究將使我們真正實(shí)現(xiàn)人工生命系統(tǒng)設(shè)計(jì)的精準(zhǔn)化，促進(jìn)合成生物學(xué)成果在應(yīng)用領(lǐng)域的高效轉(zhuǎn)化。

（摘自《中國(guó)科學(xué)院院刊》2018年第11期）